度（微克/毫升）
[0132]Peff:有效穿透率（公分/秒）
[0133]J:流量（微克/平方公分?秒）
[0134]A:扩散表面积（平方公分）
[0136] 3. 2. 5体外人体细胞株穿透试验
[0137] 将RPMI2650细胞（即，人类鼻中膈鳞状细胞株）接种于涂布有胶原蛋白之孔径 为0.4微米的细胞隔膜盘（cellinsert)中，并培养2天，使细胞在细胞隔膜上形成细胞单 层膜（monolayer)。接着，将细胞隔膜盘转移到已加入1. 5毫升Hepes缓冲液的12孔盘中， 再于细胞隔膜盘中加入〇. 5毫升的含亚丁基苯酞原液或医药组合物的H印es缓冲液。然后， 将12孔盘置于37°C、5% 0)2的培养箱中培养，每间隔1小时，分别收集12孔盘内的缓冲 液，并以分光光度计测量其于310纳米波长下的吸收光谱，计算亚丁基苯酞或医药组合物 浓度，共测量6小时，并利用前述公式1及公式2,计算求得有效穿透（Prff)与流量（J)。
[0138] 3. 3试验结果
[0139] 3. 3. 1低温稳定性测试结果
[0140] 以第3. 2. 1点所载方法测试医药组合物1、比较医药组合物1、医药组合物5及医 药组合物6于低温下的稳定性，结果如图2A及图2B所示，其中图2A及图2B分别为储存前 及储存后的照片。由图2A及图2B可知，本发明医药组合物（医药组合物1、5及6)在4°C 低温下长时间储存（长达30天）前后外观不会有显著变化且不会分层，而非本发明医药组 合物（比较医药组合物1)在4°C低温下储存后则有明显分层的现象。前述结果显示，本发 明医药组合物的稳定性优异。
[0141] 3. 3. 2毒杀试验结果：以第3. 2. 2点所载方法对亚丁基苯酞原液、医药组合物1、比 较医药组合物1、医药组合物5及医药组合物6进行毒杀试验，结果如图3及表8所示。由 图3可知，相较于控制组，GBM8401细胞的存活率系随着活性成分亚丁基苯酞的剂量提高 而下降，且各医药组合物中，以医药组合物5的毒杀效果最好，其抑制GBM8401细胞的存活 的IC5。为28. 20微克/毫升。
[0142]表 8
[0145] 3. 3. 3毒杀效果稳定度试验结果
[0146] 以第3. 2. 3点所载方法对医药组合物5进行毒杀效果稳定度试验，结果如图4所 示。由图4可知，相较于控制组，不论医药组合物5的储存时间如何，经处理后的各组GBM 8401细胞的存活率仍保持着随着活性成分亚丁基苯酞的剂量提高而下降的规律。前述结果 显示，医药组合物5对恶性脑瘤细胞的毒杀效果并不会受到储存时间的影响，为一稳定的 配方。
[0147] 3. 3. 4体外人工纤维膜穿透试验结果
[0148] 以第3. 2. 4点所载方法对亚丁基苯酞原液、医药组合物1、比较医药组合物1、医药 组合物5及医药组合物6进行体外人工纤维膜穿透试验，结果记录于下表9。由表9可知， 医药组合物5和医药组合物6的有效穿透率（Prff)最高，而亚丁基苯酞原液的有效穿透率 最低。前述结果显示，相较于亚丁基苯酞原液，本发明医药组合物的穿透能力明显较佳，其 中又以医药组合物5和医药组合物6的穿透能力为最佳。
[0149]表 9
[0150]
[0152] 3. 3. 5体外人体细胞株穿透试验结果
[0153] 以第3. 2. 5点所载方法对亚丁基苯酞原液、医药组合物1、比较医药组合物1、医药 组合物5及医药组合物6进行体外人体细胞株穿透试验，结果记录于下表10。由表10可 知，医药组合物6的有效穿透率（Prff)最高，而亚丁基苯酞原液的有效穿透率最低。前述结 果显示，相较于亚丁基苯酞原液，本发明医药组合物穿透细胞的能力明显较佳，其中又以医 药组合物5及6的穿透细胞的能力为佳。
[0154]表10
[0155]
[0156] 4.医药组合物的动物实验
[0157] 4.1实验方法
[0158] 于大鼠颅内植入9L(即，大鼠恶性脑瘤细胞株）肿瘤组织，待颅内生成肿瘤后再 进行药物治疗试验。试验方法包括：（i)利用400毫克/公斤体重的水合氯醛（chloral hydrate) (Sigma-Aldrich公司）麻醉大鼠，待其昏迷后，将大鼠头部毛发剃除，并将大鼠保 持固定于鼠脑定位仪（LabStandard?StereotaxicInstrument)上；（ii)以大剪将头皮剪 开以露出头盖骨，以脑部囱门（bregma)为中心，向右3毫米，向下5毫米，到定位钻孔处， 利用钻孔器将头盖骨磨出5毫米直径的空洞；（iii)用镊子夹取预先准备好的9L肿瘤组织 (IXIX1立方毫米）并植入脑内3毫米深处，静置1分钟待血液凝固后取出镍子，并于空洞 处涂上骨腊，最后将大鼠头皮缝合，并给予抗生素；（iv)待植入肿瘤组织后第7天，随机分 组如下表11，并利用微量吸管吸取药物（亚丁基苯酞原液或医药组合物5)滴进大鼠鼻腔 中，进行鼻内投药治疗，连续投药30天，并于期间记录大鼠体重及死亡只数；以及（V)取下 肿瘤，利用电子式游标卡尺来测量肿瘤的长和宽，并且用下列公式3计算肿瘤之总体积，同 时测量肿瘤重量，将测得之数值绘制成长条图与曲线图，以判断治疗成效。
[0159]表11
[0160]
[0163] 4. 2动物实验结果
[0164] 以第4. 1点所载方法进行动物实验，实验结果如图6及图7A至7C所示。由图6 及图7A至7C可知，相较于控制组，亚丁基苯酞原液（160毫克/公斤）及亚丁基苯酞原液 (320毫克/公斤）皆具有抑制肿瘤生长的效果。前述结果显示，经由鼻内投予BP原液，确 实可提供治疗恶性肿瘤的效果。
[0165] 由图6及图7A至7C亦可知，经鼻内投予亚丁基苯酞原液（160毫克/公斤）与医 药组合物5 (80毫克/公斤）30天后，该二组大鼠具有明显提升且相似的存活率、以及明显 下降且相似的肿瘤体积及肿瘤重量。此结果显示，本发明医药组合物中的亚丁基苯酞的有 效剂量，只需要亚丁基苯酞原液的有效剂量的一半，即可达到相同的治疗效果。
[0166] 由图7B、7C可知，投予医药组合物5 (160毫克/公斤）30天后，该组肿瘤重量可减 少约92% (图7B)，而肿瘤体积可减少约94% (图7C)。前述结果显示，本发明医药组合物 5 (160毫克/公斤）具有优异的治疗恶性肿瘤的效果。
[0167] 以上体外及动物实验结果皆显示，将亚丁基苯酞制成如本发明的医药组合物，可 提高鼻内投药后活性成分穿透鼻腔粘膜的效率，加乘其治疗效果，尤其是治疗恶性脑瘤的 功效。
[0168] 上述实施例仅用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟 于此项技艺之人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修 改及变化。因此，本发明的权利保护范围应如所附申请专利权利要求所界定。
【主权项】
1. 一种稳定医药组合物，包含： (a) -介质系统，包含第一成分、第二成分、及第三成分，该第一成分为磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline)，该第二成分选自以下群组：植物油、动物油、脂肪酸、及其 组合，且该第三成分选自以下群组：聚乙二醇、二甲亚砜、乙醇、聚丙二醇、聚山梨醇酯、聚 氧乙基化蔬菜油（polyoxyethylated vegetable oil)、乙酸乙酯、12-羟基硬酯酸轻乙酯 (2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate)、维生素 E 聚乙二醇琥泊酸酯（tocopheryl polyethylene glycol succinate)、及其组合；以及 (b) 亚丁基苯酿（n-butylidenephthalide，BP)〇2. 如权利要求1所述的组合物，其中该植物油选自以下群组：芥花油、椰子油、玉米油、 棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花籽油、芝麻油、大豆油、葵花油、杏仁油、腰果 油、榛果油、胡桃油、山核桃油、松子油、开心果油、蓖麻油（castor oi 1)及其组合；且该动物 油选自以下群组：鱼油、鱼肝油、猪油、牛油、羊油、鸡油、鸭油及其组合。3. 如权利要求1所述的组合物，其中该第二成分为经修饰的蓖麻油（modified castor oil)。4. 如权利要求3所述的组合物，其中该经修饰的蓖麻油为聚乙氧化蓖麻油 (polyethoxylated castor oil)，且该第三成分选自以下群组：聚乙二醇、二甲亚砜、乙醇、 聚丙二醇、及其组合。5. 如权利要求4所述的组合物，其中该第三成分选自以下群组：聚乙二醇、二甲亚砜、 乙醇、及其组合。6. 如权利要求5所述的组合物，其中该第三成分为聚乙二醇与二甲亚砜的组合或聚乙 二醇与乙醇的组合。7. 如权利要求6所述的组合物，其中该第三成分为聚乙二醇与二甲亚砜的组合。8. 如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中以每毫升（a)介质系统计，（b)亚丁 基苯酞的浓度为〇. 001晕克/毫升至1500晕克/毫升。9. 如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中于（a)介质系统中，第一成分与第二 成分的体积比为1:2至20:1，且第一成分与第三成分的体积比为1 :2至30 :1。
【专利摘要】一种稳定医药组合物，包含：（a）一介质系统，包含第一成分、第二成分、及第三成分，该第一成分为磷酸盐缓冲液，该第二成分选自以下群组：植物油、动物油、脂肪酸及其组合，且该第三成分选自以下群组：聚乙二醇、二甲亚砜、乙醇、聚丙二醇、聚山梨醇酯、聚氧乙基化蔬菜油、乙酸乙酯、12-羟基硬酯酸羟乙酯、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、及其组合；以及（b）亚丁基苯酞（n-butylidenephthalide，BP）。
【IPC分类】A61P35/00, A61K47/44, A61K31/365, A61K47/34
【公开号】CN105030760
【申请号】CN201510191893
【发明人】林欣荣, 韩鸿志, 邱紫文, 邱郁涵
【申请人】长弘生物科技股份有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年4月22日
【公告号】US20150306233