胞质或匪级分存在时测定RhSIRTl脱乙酰酶活性。在将rhSIRTl加入测定缓冲液、胞质或匪中后，测定脱乙酰酶活性的相对增加并作图。来自野生型BMSC的匪增强rhSIRTl脱乙酰酶活性，而来自的匪的刺激能力被大大损害。数据表示均值土 SEM，n = 3。
< 0.05o (F)在rhLamin A和白藜芦醇存在或不存在时将乙酰FLAG_p53与rhSIRTl—起温育。通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法检测FLAG-p53乙酰化。(G)通过蛋白质印迹法测定的野生型和ZmpstdV BMSC中白藜芦醇提高的SIRTl的匪缔合。⑶(G)的定量。数据表示均值土 SEM，n = 3。*/^〈 0.05。(I)核基质(NM)级分保持SIRTl脱乙酰酶活性在核基质级分存在或不存在时，通过B1Mol? SIRTl Fluorimetric Drug DiscoveryKit测定重组人SIRTl (rhSIRTl)脱乙酰酶活性。苏拉明钠被用作SIRTl的抑制剂。对相对rhSIRTl脱乙酰酶活性作图。数据表示均值土 SEM，n = 30 ^ < 0.05。
[0026]图8显示白藜芦醇对Z尊小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的作用。⑷在用白藜芦醇治疗的Zmpsti^, MEF中通过衰老相关β -半乳糖苷酶测定法测定的细胞衰老。(B)通过蛋白质印迹法测定的白藜芦醇处理的MEF细胞中pl6ink419水平。
[0027]图9显示ZmpsteS^&鼠中ASC下降加快。(A)在12天培养后BMSC集落的数目。在10 Cm培养皿中用来自4月龄野生型和Z尊小鼠的新分离的骨髓细胞进行集落形成测定法。数据表示均值土 SEM，η = 5。〈 0.01。(B)在12天培养后来自10cm培养皿中野生型或突变型小鼠的磁富集BMSC的集落。(C)来自I个月和5个月野生型
小鼠的富集BMSC的增殖能力。数据表示均值土 SEM，n = 3。**/5 < 0.001。(D)来自I月龄野生型和Z尊小鼠的富集BMSC中的衰老相关β -半乳糖苷酶测定法。数据表示均值土 SEM，n = 3。0.001。(E)来自4月龄野生型和小鼠的股骨和胫骨中的单核细胞总数。数据表示均值土 SEM，η =6o '^P < 0.05。(F)来自4月龄Z尊/和野生型小鼠骨髓中HSC的代表性FACS概况。门R4代表HSC群(谱系Flt3 Sca-l+c-Kit高)。注意办/以仏匆/小鼠中HSC群减少。(G) I月龄、2月龄和4月龄野生型和為小鼠的骨髓的总单核细胞中HSC群的百分比。< 0.0l0⑶将来自I月龄野生型或Z尊小鼠的HSC植入致死照射的接受者中。在野生型移植接受者中，B细胞分化在1、4或6个月时不受影响；在重新移入Zmpste24 7供体的接受者中，在移植后4个月，B细胞谱系大大减少。**P < 0.001，為相对于Zinpste2‘\
[0028]图10显示Zinps te24 /小鼠中N-乙酰半胱氨酸饲养挽救ASC下降和延长寿命。(A)在H2O2存在或不存在时测定的富集BMSC的集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)。数据表示均值土 SEM，η = 3。*尸〈0.05。(B)与野生型HSC中的相比新分离的Zmpste24, HSC中的ROS水平升高(左)和通过N-乙酰半胱氨酸(NAC，I mg/ml，在饮用水中)挽救的ROS水平(右)。(C)用溶媒或NAC (I mg/ml，在饮用水中)治疗的Z尊w7小鼠中BMSC的集落形成效率。在10 cm培养皿中对新分离的骨髓细胞进行集落形成测定法。数据表示均值土 SEM，n = 3。*P < 0.05o (D)溶媒治疗和NAC治疗的小鼠中骨髓HSC群的百分比。〈 0.05，溶媒治疗的Zmps te24 /小鼠相对于野生型，和NAC治疗相对于溶媒治疗的為小鼠。(E) 4月龄时溶媒治疗和NAC治疗的為小鼠的体重。数据表示均值土 SEM，n =12。*P < 0.05，NAC治疗相对于溶媒治疗。(F)溶媒治疗和NAC治疗的Zmps te24 7小鼠的存活率。Z5〈 0.0001。
[0029]图11 (A)在含有rhSIRTl和重组人核纤层蛋白A (rhLamin A)的试管中通过抗核纤层蛋白A免疫沉淀检出重组人SIRTl (rhSIRTl)。(B)在rhLamin A存在或不存在时通过 B1Mol? SIRTl Fluorimetric Drug Discovery Kit (BSDK)测定 RhSIRTl 脱乙酰酶活性。数据表示均值土 SEM, η = 3。< 0.05, W < 0.01，rhLamin A + rhSIRTl 相对于仅 rhSIRTl。_rhLamin A 与 rhSIRTl 的摩尔比率分别为 0.5、1.0、2.0 和 4.0。(C)在rhLamin A存在或不存在时将乙酰FLAG_p53与rhSIRTl —起温育。通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法检测FLAG-p53乙酰化。通过Image J?量化乙酰化p53的相对水平。^rhLamin A与rhSIRTl的摩尔比率分别为0.5和1.0。(D)在LA-80 (核纤层蛋白A的羧基 80 aa 的合成肽)存在或不存在时，通过 B1Mol? SIRTl Fluorimetric Drug DiscoveryKit (BSDK)测定rhSIRTl脱乙酰酶活性。数据表示均值土 SEM,η = 3。**尸〈0.01,LA-80+ rhSIRTl相对于仅rhSIRTl。(E)在不同量的LA-80存在下将乙酰FLAG_p53与rhSIRTl一起温育。通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法测定FLAG-p53乙酰化(左)。通过Image Γ量化乙酰化p53的相对水平(右)。
[0030]序列简述
SEQ ID NO:1是依据本发明使用的氨基酸序列。
[0031]SEQ ID N0:2是人核纤层蛋白A蛋白的氨基酸序列。
[0032]发明的详细内容
在一个实施方案中，本发明提供根据核纤层蛋白A和SIRTl蛋白间的相互作用和核纤层蛋白A的SIRTl激活性质筛选SIRTl激活/抑制性化合物的方法。在另一个实施方案中，本发明提供SIRTl激活性化合物治疗患有代谢和/或衰老相关变性疾病的患者/受试者的用途和SIRTl抑制性化合物治疗人恶性肿瘤的用途。在另一个实施方案中，本发明提供通过经由相互作用改进化合物改变核纤层蛋白A与SIRTl的结合亲和力来调节SIRTl的脱乙酰酶活性的方法。
[0033]SIRTI脱乙酰酶活性被核纤层蛋白A激活
鉴于核基质(_在保存HDAC活性中的基本作用和白藜芦醇的延寿性质，测定了核纤层蛋白A对SIRTl的可能作用。结果显示，在匪中核纤层蛋白A与SIRTl直接相互作用并用作SIRTl的激活剂；前核纤层蛋白A和progerin显示与SIRTl的结合能力显著降低，因此使SIRTl从匪错定位，导致ZmpstW'\、鼠中ASC快速下降。白藜芦醇在体外和体内都增加SIRTl与A型核纤层蛋白的结合，因此在Z尊/小鼠中，可提高SIRTl的脱乙酰酶活性，恢复ASC群，改善早衰样特征，并延长寿命。
[0034]本发明显示，核纤层蛋白A是SIRTl的激活剂；白藜芦醇通过增加其与核纤层蛋白A的相互作用而激活SIRTl ;白藜芦醇以SIRTl依赖性方式挽救ASC下降；且白藜芦醇治疗在早衰小鼠中减轻早衰样特征并延长寿命。
[0035]本发明显示，核核纤层蛋白A蛋白在体内与长寿/防衰老SIRTl蛋白形成复合物。核纤层蛋白A蛋白与SIRTl蛋白直接结合。核纤层蛋白A激活针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-Hi s-Ly s-Ly Sac-AMC)和全长乙酰化FLAG_p53蛋白(一种已知的SIRTl蛋白的靶标)两者的SIRTl脱乙酰酶活性。含有核纤层蛋白A蛋白的羧基端的80个氨基酸的合成肽，赋予SIRTl针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-Hi s-Ly s-Ly sAe-AMC)和全长乙酰化FLAG_p53蛋白两者的高得多的激活潜力。
[0036]在一个实施方案中，本发明提供筛选激活SIRTl脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A蛋白的小肽的方法。在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定激活或抑制SIRTl蛋白的核纤层蛋白A-肽-模拟化合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定调节核纤层蛋白A蛋白和SIRTl蛋白间的相互作用从而激活或抑制SIRTl的脱乙酰酶活性的化合物的方法。在又一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有各种代谢疾病例如肥胖症、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、早衰综合征和衰老的患者的方法。还提供使用SIRTl抑制性化合物治疗人类癌症的方法，所述癌症包括前列腺癌、急性髓性白血病、结肠癌和各种非黑素瘤皮肤癌。
[0037]本发明人发现，核核纤层蛋白A蛋白与延寿/防衰老SIRTl蛋白相互作用。在一个实施方案中，本发明提供筛选SIRTl激活剂或抑制剂的方法。在另一个实施方案中，本发明提供提高或抑制SIRTl活性以治疗人类代谢和变性疾病以及瘤形成的方法。
[0038]在一个实施方案中，本发明提供使用核纤层蛋白A蛋白的小的羧基末端肽提高SIRTl蛋白活性的方法。针对其体外提高针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-Hi s-Ly s-Ly Sac-AMC)和全长乙酰化FLAG_p53蛋白(一种已知的SIRTl蛋白的靶标)两者的SIRTl脱乙酰酶活性的能力，确定位于成熟核纤层蛋白A蛋白的G567-Y646区的范围为3 mer-20 mer的合成肽。在又一个实施方案中，使用直接使靶标(例如p53和PGC-1 α )脱乙酰的乙酰化状态的SIRT1，测试细胞中SIRTl的合成的3 mer-20 mer肽的作用，作为读出。在再一个实施方案中，通过上述体外和体内测定法，测试共价修饰的上述3 mer-20 mer核纤层蛋白A肽提高SIRTl脱乙酰酶活性的能力。
[0039]在一个实施方案中，本发明提供筛选模拟上述3 mer-20 mer核纤层蛋白A肽的结构的化合物的方法，其中在试管中通过焚光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-Lysik-AMC)和全长乙酰化FLAG-p53蛋白，测定提高的SIRTl的脱乙酰酶活性。在又一个实施方案中，使用直接使靶标(例如p53和PGC-1 α )脱乙酰的乙酰化状态的SIRT1，在细胞中测试核纤层蛋白A-肽-模拟物对SIRTl的作用，作为读出。
[0040]在一个实施方案中，本发明提供鉴定能够通过增加核纤层蛋白A和SIRTl蛋白间的相互作用来提高SIRTl脱乙酰酶活性的化合物的方法。在核纤层蛋白A蛋白和受测化合物存在时，测定针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-Lysik-AMC)和全长乙酰化FLAG-p53蛋白两者的SIRTI脱乙酰酶。可通过免疫共沉淀、蛋白质印迹法和GST-检出测定法(GST-pull down assay)，测定受测化合物在含有重组核纤层蛋白A和重组SIRTl的试管中和在细胞中提高核纤层蛋白A和SIRTl间的相互作用的能力。可通过分析乙酰化p53和乙酰化PGC-1 α的水平，测试细胞中受测化合物激活SIRTl的能力。
[0041]在一个实施方案中本发明提供使用上述SIRTl激活性分子式(包括小核纤层蛋白A肽、肽-模拟物和核纤层蛋白A-SIRTl相互作用增强性化合物)治疗人类代谢和衰老相关变性疾病的方法。在一个实施方案中，可在重现代谢和衰老相关变性疾病的动物(例如小鼠)模型(例如饲喂高脂肪饮食的小鼠、类似Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)的小鼠模型、db/db糖尿病小鼠等)中，测试候选化合物/肽。
[0042]在另一个实施方案中，本发明提供使用SIRTl抑制性化合物(包括小核纤层蛋白A肽、肽-模拟物和核纤层蛋白A-SIRTl相互作用抑制性化合物)治疗人类恶性肿瘤的方法。另外，本发明提供通过给予SIRTl激活性化合物以治疗代谢疾病包括肥胖症、糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病、早衰络合征和衰老的方法。
[0043]核纤层蛋白A与SIRTl直接相互作用，且核纤层蛋白A的羧基结构域的最后80个氨基酸用作SIRTl的激活剂。在一个实施方案中，本发明提供用于提高SIRTl脱乙酰酶活性的方法，其中所述方法包括将核纤层蛋白A肽、核纤层蛋白A肽的类似物或其功能片段给予表达SIRTl且需要SIRTl脱乙酰酶活性提高的细胞。
[0044]各类核纤层蛋白A蛋白的氨基酸序列是公众已知的，本领域技术人员可通过例如GenBank数据库容易地获取。在一个实施方案中，根据本发明使用的核纤层蛋白A肽是人源的，具有SEQ ID NO:2 ;GenBank登录号NP_733821的氨基酸序列。
[0045]在一个实施方案中，提高SIRTl脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A肽的功能片段包含核纤层蛋白A肽的羧基结构域。在一个实施方案中，提高SIRTl脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A肽的功能片段包含SEQ ID NO: 2的氨基酸570-664。
[0046]SIRTl脱乙酰酶活性的抑制
在一个实施方案中，本发明提供用于降低或抑制SIRTl脱乙酰酶活性的方法，其中所述方法包括将核纤层蛋白A蛋白或肽的抑制剂给予表达SIRTl且需要SIRTl脱乙酰酶活性降低的细胞。
[0047]依据本发明使用的核纤层蛋白A抑制剂包括但不限于抑制核纤层蛋白A活性的作用剂；和降低或抑制核纤层蛋白A表达的作用剂，例如抑制核纤层蛋白A的转录、翻译和/或加工的作用剂。
[0048]抑制核纤层蛋白A活性的作用剂包括但不限于抗核纤层蛋白A抗体、适体、核纤层蛋白A结合配偶体和核纤层蛋白A的小分子抑制剂。
[0049]在一个实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与核纤层蛋白A结合的抗体、适体或结合配偶体。在一个具体实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与核纤层蛋白A特异性结合的抗体、适体或结合配偶体。在又一个具体实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与人核纤层蛋白A特异性结合的抗体、适体或结合配偶体。在又一个具体实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与SEQ ID N0:2的人核纤层蛋白A特异性结合的抗体、适体或结合配偶体。
[0050]在某些实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与非人动物物种的核纤层蛋白A蛋白特异性结合的抗体、适体或结合配偶体，所述动物包括但不限于类人猿、黑猩猩、猩猩、猴、狗、猫、马、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠和豚鼠。与核纤层蛋白A蛋白特异性结合的抗体是市购可获得的。技术人员可容易地制备与公众已知的核纤层蛋白A蛋白特异性结合的抗体、适体或结合配偶体。在另一个实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是包含与核纤层蛋白A蛋白(例如人核纤层蛋白A)特异性结合的抗体、适体或结合配偶体的融合构建体。
[0051]“特异性结合”或“特异性”是指蛋白质可检测地结合存在于目标蛋白质或多肽分子中的表位，同时与其它蛋白质或结构具有相对小的可检出反应性的能力。可采用例如Biacore仪，通过结合测定法或竞争结合测定法，相对地测定特异性。可通过例如在与特定靶分子结合相对于与其它无关分子非特异性结合中，亲和力/亲合力的比率约10:1、约20:1、约50:1、约100:1、10.000:1或更大来表示特异性。
[0052]本发明的抗核纤层蛋白A抗体可以是各种形式的任一种，包括完整的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白的片段例如Fv、Fab和类似片段；免疫球蛋白分子的多聚体(例如本领域已知的双抗体、三抗体和二特异性和三特异性抗体；参见例如Hudson和Kortt, J.1mmunol.Methods 231:177 189，1999);含有抗体或抗体片段的融合构建体；和人或人源化免疫球蛋白分子或其片段。
[0053]本发明范围内的抗体可以具有任何同种型，包括IgG、IgA、IgE、IgD和IgM。IgG同种型抗体可进一步细分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚型。IgA抗体可进一步细分为IgAl和IgA2亚型。
[0054]本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体。本文所用术语“单克隆抗体”是指获自基本均质的抗体或抗体片段群的抗体或抗体片段(即群中的各个抗体是相同的，可存在于少量抗体分子子集中的可能的天然存在的突变除外)。
[0055]单克隆抗体组合物通常由称为杂交瘤的单细胞克隆产生的抗体组成，所述杂交瘤只分泌(产生)一种类型的抗体分子。通过使产抗体细胞和骨髓瘤或其它自身永生细胞系融合形成杂交瘤细胞。所述抗体最早描述于Kohler和Milstein，Nature, 1975,256:495-497，其公开内容通过引用结合到本文中。Niman等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A., 1983，80:4949-4953描述了示例性的杂交瘤技术。产生单克隆抗体、杂交瘤细胞或杂交瘤细胞培养物的其它方法也是众所周知的。参见例如Antibodies: A LaboratoryManual, Harlow 等,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ;或从 Sasatry 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1989，86:5728-5732所描述的免疫库分离单克隆抗体的方法；以及Huse等，Science, 1981，246:1275-1281。所引用的参考文献通过引用结合到本文中。
[0056]在一些实施方案中，依据本发明使用的核纤层蛋白A抑制剂是降低或抑制核纤层蛋白A表达的作用剂，例如抑制核纤层蛋白A的转录、翻译和/或加工的作用剂。
[0057]在一个实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是核纤层蛋白A反义多核苷酸。在一个实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是靶向人核纤层蛋白A mRNA的反义多核苷酸。在一些实施方案中，核纤层蛋白A反义多核苷酸靶向非人动物的核纤层蛋白A mRNA，所述动物包括但不限于类人猿、黑猩猩、猩猩、猴、狗、猫、马、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠和豚鼠。技术人员应容易认识到，可设计反义多核苷酸以靶向公众已知的任何核纤层蛋白A mRNA。
[0058]在一些实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是具有与靶核纤层蛋白A mRNA序列充分互补以指导靶特异性RNA干扰(RNAi)的序列的siRNA。在一些实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是具有与靶人核纤层蛋白A mRNA序列充分互补以指导靶特异性RNA干扰的序列的SiRNA0
[0059]反义多核苷酸的实例包括但不限于与互补靶核纤层蛋白A mRNA结合并抑制翻译和/或诱导靶转录物的RNaseH介导的降解的单链DNA和RNA ;靶向或介导核纤层蛋白AmRNA降解的siRNA寡核苷酸；切割核纤层蛋白A mRNA转录物的核酶；和核酸适体和诱杀剂，其是以类似于小分子药物的方式结合并阻断核纤层蛋白A蛋白靶的非天然存在的寡核苷酸。
[0060]术语“核苷酸”是指具有以酯键与糖部分连接的一个或多个磷酸基团的核苷。示例性的核苷酸包括核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。术语“多核苷酸”和“核酸分子”在本文可互换使用，是指在5’和3’碳原子间通过磷酸二酯键连接在一起的核苷酸的聚合物。术语“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或这些的任一种的片段、可为单链或双链且可表示有义或反义链的基因组或合成源的DNA或RNA、肽核酸(PNA)或起源为天然或合成的任何DNA样或RNA样物质。如本领域技术人员应了解的一样，当核酸为RNA时，脱氧核苷酸A、G、C和T分别被核糖核苷酸A、G、C和U置换。
[0061 ] 本文所用术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子” 一般是指核糖核苷酸的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子” 一般是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA分子可以是天然合成的(例如分别通过DNA复制或DNA转录)。RNA分子可以经转录后修饰。DNA和RNA分子还可为化学合成的。DNA和RNA分子可以是单链(即分别为ssRNA和ssDNA)或多链的(例如双链，即分别为dsRNA和dsDNA)。然而，根据本发明的性质，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”也可指主要包含(即大于80%或优选大于90%)核糖核苷酸但任选包括至少一个非核糖核苷酸分子(例如至少一个脱氧核糖核苷酸和/或至少一个核苷酸类似物)的聚合物。
[0062]本文所用术语“核苷酸类似物”，本文亦称为“改变的核苷酸”或“修饰的核苷酸”，是指非标准核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。优选的核苷酸类似物在任何位置被修饰使得改变核苷酸的某些化学性质但仍保持核苷酸类似物执行其预期功能的能力。
[0063]本文所用术语“RNA干扰”(“RNAi”)是指RNA的选择性胞内降解。RNAi天然发生在细胞中以除去外来RNA (例如病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA (其指导其它类似的RNA序列的降解机制)切割的片段进行。或者，例如可借助人工启动RNAi以使内源靶基因(例如核纤层蛋白A)的表达沉默。
[0064]本文所用术语“小干扰RNA”(“siRNA”)(本领域亦称为“短干扰RNA”)是指包含能够指导或介导RNA干扰的大约10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA (或RNA类似物)。
[0065]如本文所用，具有“与靶mRNA序列充分互补以指导靶特异性RNA干扰(RNAi)的序列”的siRNA意指siRNA具有通过RNAi手段或过程足以引发靶mRNA (例如核纤层蛋白AmRNA)破坏的序列。“mRNA”或“信使RNA”或“转录物”是规定一种或多种多肽的氨基酸序列的单链RNA。在蛋白质合成期间当核糖体与mRNA结合时，该信息被翻译。
[0066]本发明还预期包含可用于抑制核纤层蛋白A表达和/或活性的核酸分子的载体(例如病毒载体)和表达构建体。在一个实施方案中，载体包含靶向核纤层蛋白A mRNA的siRNA。在另一个实施方案中，载体包含编码抗核纤层蛋白A抗体的核酸分子。
[0067]本文所用术语“表达构建体”是指提供有效连接的核酸序列的转录的核酸序列的组合。本文所用术语“有效连接的”是指所述组分的毗邻，其中各组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。一般来说，有效连接的组分处于邻接关系。
[0068]本发明的表达构建体一般还将包括在其中表达构建体有待表达的预期宿主细胞中起作用的调节元件。因此，本领域普通技术人员可选择用于例如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞的调节元件。调节元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和聚腺苷酸化元件。
[0069]本发明的表达构建体可包含与编码本发明的肽的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。可采用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸中。多拷贝的启动子或多个启动子可用于本发明的表达构建体。在一个优选的实施方案中，启动子可位于与在其天然遗传环境中距离转录起始位点大致相同的自转录起始位点的距离。在不显著降低启动子活性的情况下允许该距离的某些变化。表达构建体中通常包括转录起始位点。
[0070]药物筛选测定法
在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选提高或降低SIRTl脱乙酰酶活性的治疗剂的方法。该治疗剂可以是药物、化学品、化合物、蛋白质或肽或核酸分子(例如DNA、RNA例如siRNA)ο
[0071]在一个实施方案中，本发明提供用于筛选提高SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂的方法，所述方法包括使候选分子与试验样品中表达SIRTl的细胞接触；测定试验样品中的脱乙酰酶活性；如果所述分子提高试验样品中SIRTl脱乙酰酶活性的水平，则选择候选分子作为提高SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂。
[0072]在提高SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂的筛选测定法的一个实施方案中，候选分子选自核纤层蛋白A肽的片段(例如SEQ ID N0:2的核纤层蛋白A肽