用于药物递送的组合物和方法

用于药物递送的组合物和方法
【专利说明】用于药物递送的组合物和方法
[0001] 本发明涉及适用于递送分子至哺乳动物的组合物和方法。本发明具体地涉及肽衍 生物（肽和伪肽）、其二聚体或多聚体以及它们作为感兴趣分子的载体的用途。本发明还 涉及缀合物，其含有连接至感兴趣分子的本发明的肽衍生物或其二聚体或多聚体。本发明 的肽具体地可通常以前药缀合物的形式用于经特异性受体（受体介导的转运，RMT)将感兴 趣的药物或诊断分子例如治疗分子、成像或诊断剂或分子探针负载穿过健康或病理（癌细 胞）的不同组织或器官（例如肝、肾上腺和肠）的细胞膜，且具体地使其穿过神经系统的生 理屏障例如血脑屏障（BBB)、血-脊髓屏障（BSCB)或血-视网膜屏障（BRB)。
[0002] 发明背景
[0003] 根据頂SHealth，在2007年，治疗中枢神经系统（CNS，脑和脊髓）病症的药物的 全球市场大约700亿美元，该总额中有近90亿美元代表的是由药物递送技术研发的产品 (Jain，2008,JainPharmaBiotechReport，DrugDeliveryinCNSdisorders)。因此，神 经病学连同心血管医学和肿瘤学是当下三大治疗领域。尽管全世界患CNS障碍和病症的 人数高于患心血管疾病或癌症的人数，神经病学仍然是有待开发的市场。其由以下事实进 行部分解释：98 %的治疗CNS病症的潜在药物并未穿过血脑屏障或BBB(Pardridge，2003， Mol.Interv.，3, 90-105)。目前市场上仅有5%的药物针对神经系统。
[0004] 事实上，CNS是由于两个主要的生理屏障系统（BBB/BSCB和血-脑脊液屏障 (BCSFB))的存在而免受潜在的有毒物质的侵害。所述BBB被认为是在脑水平摄取等离子体 配体的主要途径。其表面积约是BCSFB表面积的5000倍。BBB的结构性血管（constitutive bloodvessel)的总长大约600km。大脑皮层每立方厘米所含的相当于lkm血管所含。BBB 的总表面积估计有 20m2(DeBoer等人，2007,Clin.Pharmacokinet.，46 (7)，553-576)。BBB 和BSCB被视为在研发治疗CNS病症和损伤的新型疗法中需要克服的主要障碍（Neuwelt等 人，2008,LancetNeurol.，7,84-96) 〇
[0005] 类似地，在眼中，血-视网膜屏障（BRB)是血眼屏障的一部分，所述血眼屏障是 由紧密结合在一起的细胞所组成并抵御一些物质进入视网膜。所述BRB有两种成分：视 网膜血管内皮和视网膜色素上皮，其还被称为内部和外部组分（内部BRB[iBRB]和外部 BRB[oBRB])。与脑血管类似的视网膜血管维持内部血眼屏障。正如BBB或BSCB，这种生理 屏障包括紧密连接（TJ)的单层无孔内皮细胞。视网膜上皮细胞间的这些连接阻止大分子 从脉络膜毛细血管穿过进入该视网膜。
[0006] 在2007年，全球总的眼用药物制品方面估值约115. 2亿美元（Visiongain， Ophthalmics. 2007,Visiongain,Inc. :SanFrancisco.JanoriaKG,等人。Novel approachestoretinaldrugdelivery.ExpertOpinDrugDeliv〇2007 ;4(4):371-388)〇 视网膜疾病包括色素性视网膜炎、黄斑变性、视锥-视杆细胞营养不良（CORD)、视网膜脱 离、视网膜剥落、高血压性视网膜病变和糖尿病视网膜病变、视网膜母细胞瘤、视网膜脂血 症等。
[0007] 由于许多群体的年龄不断增加，金融专家预测，短期内该方面的年均增长将超过 10%。然而，持续给药治疗上有效浓度的药物以治疗眼疾，尤其是眼后半段疾病，仍然是显 著的技术挑战。患者顺应性与现有疗法的相应问题也是严重的难题。因此，对于追求新型 分子以及创新的药物递送体系的公司而言，存在大量的市场机会。
[0008] 因此，BBB、BSCB和BRB不仅代表了在使用潜在药物治疗许多CNS和眼部疾病时的 主要障碍，还代表了在血液和神经组织之间大面积的潜在交换。
[0009] 作为一般规律，仅有大约450至600道尔顿的少许亲脂性小分子（仅2%的候选药 物）可穿过上述生理屏障，也就是说，穿过血液进入神经组织。许多在治疗CNS疾病的体外 研究和动物研究中显示出有希望的结果的候选药物的分子量和大小是相当大的。因此，由 于神经组织毛细血管内皮细胞的低跨细胞渗透性，大多数的分子，例如治疗性的肽、蛋白， 包括治疗性的抗体，通常被排除在血液到CNS或眼（视网膜）神经组织的通路/转运系统 外。排列在血管中的脑毛细血管内皮细胞（BCEC)被基底层、星形胶质细胞突触小结、周细 胞以及小神经胶质和神经细胞所包围。内皮细胞与星形胶质细胞突触小结的紧密结合导致 了BBB对大多数分子不透过性的发展与维持，从而确保严格且有效地控制血液和脑之间的 分子交换以维持脑稳态。相比于其他器官的具有孔的内皮细胞，脑的内皮细胞是通过TJ而 紧密结合的。因此这些TJ防止穿过BBB的细胞旁通道。围绕在其周围的内皮细胞和星形 胶质细胞突触小结也构成了生理屏障，因为这些细胞具有有效的外排体系，其限制任何跨 细胞途径的通路/转运系统。事实上，多药耐药性（MDR)转运蛋白将一些能够穿过生理屏 障的分子从内皮细胞主动排出到血液系统。这些主动外排转运（AET)体系通常控制由神经 组织到血液系统的小分子的主动外排。举个例子，BBB的模型AET体系是ATP结合盒（ABC) 转运蛋白，即P-糖蛋白（P-gp);但是，其他的AET体系也存在于BBB，例如MDR-相关蛋白 1 (MRP1)。主要位于BCEC腔表面的P-gp不仅是阻止大多数外源物进入脑的BBB生理屏障 功能的主要要素，还是候选药物以及在CNS中能够被活化的感兴趣的其他治疗分子。因此， 这些性质强烈地限制了物质从血浆转运到CNS和眼神经组织的细胞外隙。
[0010] 可以解释为什么目前没有可用于主要CNS或眼部病症和损伤（脑癌、帕金森病和 阿尔茨海默病、脑血管意外（CVA)等）的真正有效的治疗的原因之一是：研发治疗脑部病 症的候选药物的人员采取的是自身研究项目（脑部药物开发项目），而并没有投入精力在 穿透屏障的问题，也没有投入精力在优先靶向神经组织，特别是脑（脑部药物靶向项目）， (Pardridge，2003,Mol.Interv.，3,90-105)。候选药物必须遵循一定结构、物理化学、药物 化学和药理学规律以便具有最大的成为治疗CNS病症或障碍的药物的可能性（Pajouhesh 等人，2005,Neur〇Rx，2(4)，541-553)。因此，在研发候选药物中，分子对其靶点的选择性与 特异性（药理学性质）对其治疗活性（有效性）是必要的。分子的生物利用度和潜在毒性 (药物学性质）对其将来作为药物是至关重要的。换句话说，任何可能成为用于治疗CNS或 眼部病症或障碍的药物的分子必须穿过BBB/BSCB或BRB，保持其生物活性并呈现出合适的 药代动力学（PK)、吸收、分布、代谢和排泄/清除（ADME)和药效学（PD)特性，且具有低毒性 (Tox)。实际上，对于神经系统治疗学这一领域的药学化学家而言，找出正研发的分子的亲 水/亲油平衡是特别困难的。
[0011] 因此，在治疗CNS和眼部障碍和病症中一个主要的问题在于以下事实：所给药的 分子不穿过BBB/BSCB/BRB，因此无法到达它们在CNS或眼中的靶点。因此，在发现治疗、诊 断或成像CNS或眼部障碍或病症的分子的研究中，一个优先考虑事项是找到提高活性物质 穿过BBB/BSCB或BRB的有效性的方法。
[0012] 在这方面，负载分子穿过这些屏障的策略，即候选药物研发者为了使感兴趣的 治疗分子到达CNS而在目前所研究并使用的，可分为两大主要策略：药理学方法和生理 学方法（Pardridge，2007,Pharm.Res.，24 (9) ,1733-1744;DeBoer等人，2007，（：1111. Pharmacokinet.，46 (7)，553-576;DeBoer等人，2007,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，47， 327-355 ;Jones等人，2007，Pharm.Res.，24 (9)，1759-1771;Vlieghe和Khrestchatisky， 2012,MedResRev.，33 (3)，457-516)。
[0013] 侵入方法
[0014] 侵入方法可通过以下实施：在脑中直接室内注射、脑内注射或鞘内输注活性物质 或破坏BBB/BSCB(短暂的破坏这些屏障的完整性）。
[0015] 对于通过室内注射的神经外科方法，除了涉及神经外科手术的花费之外，其主要 问题在于：该药物不是直接递送至脑实质而是递送至脑脊液。室内输注包括将导管置于室 (Aird，1984,Exp.Neurol.，86, 342-358)。这个高度侵入性技术无法有效地将活性物质输送 到神经实质。事实上，例如在脑中，在通过室内输注递送药物的过程中，脑脊液到脑实质的 流量是由其对流（输送）的异常缓慢的扩散所控制的，因为脑不具有实质内流量。
[0016] 同样对于脑内注射，脑中活性物质的扩散从注射部位到病变部位降低得非常快。 事实上，活性物质的脑浓度在距离其注射部位500ym处减少了 90 %。
[0017] 鞘内输注包括将导管置于脑中。这个导管被连接至以预定流速递送活性物质的 栗。由于脑是唯一不具有淋巴系统的器官这一事实，而淋巴系统通常提供将细胞外液输送 回大循环，因此通过鞘内输注将活性物质分布于脑中是非常缓慢的。这降低了活性物质在 病变部位的浓度。
[0018] 此外，在该神经外科手术过程中，感染的风险显著，特别是在所述导管的存在的情 况下。在这些条件下，患者舒适性不佳。
[0019]BBB的短暂开放与BCEC的瞬间开放TJ有关。这是针对血管活性物质，例如白细 胞三稀或缓激肽的情况下（Baba等人，1991，J.Cereb.BloodFlowMetab.，ll，638_643)。 这一策略同样是侵入性的且需要动脉进入麻醉了的受试者/患者的颈动脉。短暂破坏BBB 的完整性遇到的主要问题，除了涉及进入颈动脉的放射性手术的花费外，所述BBB仅维持 很短时间的开放，因此限制了长期递送药物的可能性。此外，短暂破坏BBB会使血浆蛋白 进入脑（而这些蛋白可能对脑有毒性）且还可促使病原体的进入。因此，破坏BBB的这 种类型可能会导致慢性神经病理性破坏并伴随高风险感染（Salahuddin等人，1988,Acta Neuropathol.，76,1-10) 〇
[0020] 负载的药理学方法
[0021] 输送分子的药理学方法包括：通过将脂质或亲脂性基团加至活性物质中所制成 的更疏水分子的跨细胞扩散（跨细胞亲脂性扩散，TLD)或使用脂质体（Zhou等人，1992， J.Control.Release，19,459-486)，以及通过正电荷载体分子的离子吸附或通过将活性分 子阳离子化进行输送（吸附介导的输送或AMT)。
[0022] 加入脂质或亲脂性基团能够使亲水性分子化学转化成更疏水的分子，尤其是利用 前药方法。但是，合成该化合物导致超出最佳输送阈的分子穿过BBB/BSCB/BRB，尤其是对 于分子量（MW)变得大于450道尔顿的最佳限度（Pajouhesh等人，2005,NeuroRx，2(4)， 541-553)。出于相同原因，通常过大的脂质体或甚至小囊泡（胶束等）或纳米颗粒（纳米 球，纳米囊）对BBB/BSCB/BRB没有足够的特异性，并因此不太能够有效地输送感兴趣的治 疗分子（或成像或诊断试剂或任何其他分子，例如分子探针）穿过这些屏障（Levin，1980， J.Med.Chem.，23,682-684;Schackert等人，1989,SelectiveCancerTher.，5, 73-79)。此 外，这种类型的囊泡系统通常对大脑具有不可忽略的毒性作用。因此，脂质化技术所面临的 主要问题是相比于其他细胞膜，它们对特异性靶向并穿过BBB/BSCB/BRB的特异性较低、该 药物血浆值的曲线下面积（AUC)的降低以及它们普遍仅限用于负载小分子。
[0023] 在AMT(通过共价结合或直接阳离子化药物引入阳离子基团）中，所面临的主要问 题是相比于其他细胞膜，特异性靶向和穿过BBB/BSCB/BRB的特异性低。事实上，AMT基于 吸附在细胞上的阳离子分子，所述细胞的细胞膜带负电荷，这是对于绝大多数细胞而言。该 药物AUC的血浆值的降低、其通常仅限用于负载小分子以及它们的细胞毒性均是使AMT负 载方法无效的其他因素。
[0024] 负载的生理学方法
[0025] 基于生理学方法进行负载的策略在于利用屏障的各种天然输送机制。主动输送分 子穿过BBB的这些机制既可以通过偶联特定受体底物或与特定受体底物分子模拟起作用 (载体介导的输送或CMT)，也可以通过与特异性靶向受体的配体偶联或融合起作用（RMT， 受体介导的转运或受体介导的跨细胞作用）。
[0026] 作为一个例子，分子（例如L-D0PA(帕金森病）、美法仑（脑癌）、a-甲 基-D0PA(动脉高血压）和加巴喷丁（癫痫））通过CMT，经由大型中性氨基酸转运蛋白1和 2(LAT1 和LAT2)进入脑（Pardridge，2003，Mol.Interv.，3,90-105)。这些分子具有与苯丙 氨酸（LAT1天然底物之一）接近的化学结构。但是，CMT方法面临的主要问题是它们对缀 合物广泛的选择性/特异性，所述缀合物近似地模仿/模拟内源性受体/转运蛋白的底物， 并因此它们的用途仍然仅限于负载小分子。
[0027]RMT需要受体依赖的输送系统。负载是经由胞吞作用机制，通过靶向存在于靶组 织（包括脑毛细血管）中的内源性受体实现的。各种会参与RMT的人BBB受体的著名实 例包括：转铁蛋白受体（TfR)，其输送结合铁的转铁蛋白（Tf);胰岛素受体（IR)或胰岛素 样生长因子受体（IGFR);能够输送包含在低密度、高密度和极低密度脂蛋白（分别是LDL、 HDL和VLDL)中胆固醇的受体，包括低密度脂蛋白（LDL)受体和低密度脂蛋白受体相关蛋 白（LRP)家族成员；白喉毒素受体（DTR)或肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF);以及清道 夫受体（SCAV-Rs)，包括B族I型清道夫受体（SR-BI)。在RMT中，器官中特定细胞（包括 BBB内皮细胞）细胞膜上的受体结合它们的配体，其导致由在细胞表面形成的囊泡中受体 及其配体所组成的缀合物的胞吞作用，然后穿透靶细胞。这个RMT过程并不依赖于胞吞作 用所吞食的分子大小。对于BBB/BSCB/BRB，所述配体/受体缀合物或离解配体可穿过内 皮细胞（跨细胞作用），并因此能够穿过这些生理屏障，从而作用于神经组织。因此，许多 分子或分子缀合物的RMT是一种将其输送至特定细胞类型或器官，尤其是从血液到CNS或 眼的机制。这些分子或分子缀合物的受体可用于输送这些经修饰而携带药物的受体的天 然配体和/或纳米颗粒。例如，将纳米颗粒用聚山梨酯，尤其是聚山梨酯80涂布会导致载 脂蛋白E从血浆中吸收至该纳米颗粒的表面，随后该纳米颗粒模仿低密度脂蛋白（LDL)颗 粒且可与LDLR相互作用，从而导致其被内皮细胞所摄取（Kreuter，2012，AdvDrugDeliv Rev.pii:SO169-409X(12) 00275-X)。LDL受体靶向的包裹有脂质体的多柔比星提高了跨 越BBB细胞的体外药物递送（Pinz6n_Daza等人，2012，BrJPharmacol。doi:10. 1111/j. 1476-5381. 2012. 02103.x)。Tf是存在于BBB上的TfR的天然配体。已将活性物质偶联 / 缀合至Tf，从而通过Tfr来主动穿透BBB(Jefferies等人，1984,Nature，312,162-163 ; Friden等人，1983，Science，259, 373-377 ;Friden，1994,Neurosurgery，35, 294-298)。尽 管使用蛋白型大分子的这个负载策略能够提高感兴趣的缀合分子穿透该屏障，但是该策略 有多个缺点。首先，该分子通常经基因表达方法偶联/缀合至载体（融合），因此将所输送 的分子数仅限制为多肽或蛋白。第二，用于偶联/缀合分子和载体的系统是非常复杂的；传 统的化学或生化偶联无法从结构和分子角度得到明确的大分子体系。此外，缀合物和靶向 受体的内源性配体之间的潜在竞争可导致RMT生理过程的抑制，或导致脑正常运转所需的 内源性配体的浓度降低。最后，RMT受体还可参与大脑的细胞信号传导过程且所述缀合物 可能会干扰这些过程。
[0028] 经特异性受体的RMT还可用于靶向药物至其他组织/器官而非BBB和脑。已显 示，例如视网膜对胆固醇的摄取主要经LDLR介导的过程发生（Tserentsoodol等人，2006， MolecularVision2006;12:1306-18)。
[0029] 器官的血管系统、具体器官的实质或患病组织可表达高水平的给定受体，该受 体可用于药物革巴向（reviewedinChung和Wasan，2004，AdvDrugDelivRev. 2004May 7;56(9):1315-34)。例如LDLR在肝（尤其是在肝细胞窦状隙侧）以及在其他组织，例 如肾上腺和肠中高水平表达（Beisiegel等人，1981，JBiolChem. 25;256(8):4071-8; Huettinger等人，1984,JClinInvest. ;74(3): 1017-26;Fong等人，1989,JClinInvest; 84(3) : 847-56) 〇
[0030] 最终，有足够的证据显示了在各种类型的癌症中LDLR增加的表达并显示了经由 这些癌细胞（包括胶质母细胞瘤）的LDLR进行的LDL-或纳米颗粒介导的抗癌药物的递 送（Varshosaz等人，2〇l2，EurJMedChem;54:429_38;Kopecka等人，2〇ll;Journalof ControlledRelease; 149:196 - 205;Nikanjam等人，2007,IntJPharm. ;328(1): 86-9