长寿/防衰老sirt1蛋白的激活剂核纤层蛋白a的制作方法

长寿/防衰老sirt1蛋白的激活剂核纤层蛋白a的制作方法
【专利说明】长寿/防衰老SIRT1蛋白的激活剂核纤层蛋白A
[0001]相关申请的交叉引用
本申请要求2012年11月12日提交的美国临时申请顺序号61/725，252的权益，其通过引用以其整体结合到本文中。
[0002]发明背景
Sirtuin (沉默交配型信息调节 2 同源物(silent mating type informat1nregulat1n 2 homolog)),含有NAD+依赖性蛋白质脱乙酰酶和ADP核糖基转移酶活性的III 类 HDAC，调节各种代谢途径(Denu, 2005 ；Donmez 和 Guarente, 2010 ；Finkel 等，2009 ；Haigis和 Sinclair, 2010)。
[0003]7种哺乳动物的sirtuin中，SIRTl (NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin-Ι)是30年前鉴定的酿酒酵母cerevesiae) Sir2 (沉默信息调节因子2)的最接近的同源物(Klar等，1979)。SIRTl丢失引起缺陷型配子发生、心脏和视网膜异常、基因组不稳定、小体型和小鼠存活期缩短(Cheng等，2003 ;McBurney等，2003 ;Wang等，2008);并破坏许多饮食限制的有益作用(Chen等，2005)。虽然在酿酒酵母、秀丽隐杆线虫(C.elegans)和果绳属{Drosophild)中通过异位Sir2引起寿命延长仍有争议(Burnett等，2011 ；Lombard等，2011 ；Tissenbaum 和 Guarente，2001 ；Viswanathan 和 Guarente，2011 ；Viswanathan等，2005)，但是具有额外拷贝的SIRTl的转基因小鼠显示类似于饮食限制的表型，并且与健康寿命(healthspan)改善一致(Alcendor 等，2007 ；Banks 等，2008 ；Bordone 等，2007 ；Herranz 等，2010 ；Pf Iuger 等，2008)。
[0004]SIRTl 使包括 KU70、Nbsl、p53、NF- κ B、PPAR γ、PGC-1 α、F0X0 和 SUV39H1 在内的各种蛋白质脱乙酰化，并调节基因组完整性、炎性反应、脂肪形成、线粒体生物发生和胁迫抗性(Lavu等，2008)。例如，SIRTl催化肿瘤抑制物蛋白ρ53的脱乙酰作用，因此通过抑制Ρ53介导的细胞凋亡提高生存(Cheng等，2003)。SIRTl还与PPAR- γ和PGC-1 α直接相互作用，由此调节代谢反应(Picard等，2004 ；Rodgers等，2005)。
[0005]另外，SIRTl使Foxo3a脱乙酰化以通过Foxo3a靶(例如MnSOD、过氧化氢酶和Gadd45 α )提高胁迫抗性(Brunet等，2004)。SIRTl在胚胎干细胞(ESC)中高表达，但其表达在分化的细胞中通过被miRNA介导的过程而被降低(Saunders等，2010) JIRTl是通过调节P53细胞分布和Nanog表达以保持ESC自我更新所必需的(Han等，2008)。在SIRTl ,和57^77+/小鼠中，ESC的造血分化有缺陷，且造血祖细胞的数目和功能下降(Lee等，2011)。当在5%氧下培养时，与野生型细胞相比，SIRTl ,和SIRTl+Z造血祖细胞两者显示有缺陷的增殖(Mantel 等，2008)。
[0006]SIRTl是物种间最保守的防衰老/促长寿蛋白之一。SIRTl脱乙酰酶活性的增加赋予模拟人代谢或变性疾病(例如肥胖症、糖尿病和阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease))的各种小鼠模型许多有益作用。因此，SIRTl激活性化合物可有益于患有各种代谢和衰老相关变性疾病的人类患者。另一方面，发现SIRTl蛋白在各种人类癌症中增量调节，并且抑制SIRTl活性可有助于消除癌干细胞(Li等，2012)。
[0007]已证实SIRTl活性增加在许多疾病模型和人类患者中是有益的；因此，被广泛接受的是，SIRTl激活性化合物可为各种代谢和变性疾病提供治疗益处(Baur，2010)。另一方面，SIRTl在p53凋亡活性中的抑制作用表明SIRTl的促肿瘤性质(Luo等，2001)。实际上，据报道在许多类型的瘤形成中，包括前列腺癌、急性髓性白血病、结肠癌和各种非黑素瘤皮肤癌，SIRTl蛋白升高(Deng，2009)。据最新报道，抑制SIRTl激活p53，因此有利于清除白血病干细胞(Li等，2012)。因此，SIRTl抑制性化合物为各种人恶性肿瘤提供治疗潜力。据报道，白藜芦醇，一种在筛选SIRTl激活剂时鉴定的化合物，延长酵母、蠕虫和蝇的寿命，并增强嗤齿动物的健康寿命(Agarwal 和 Baur，2011 ；Baur 等，2006 ；Howitz 等，2003 ；Milne等，2007 ;Wood等，2004)。已报道了白藜芦醇对衰老相关性白内障、骨密度减少、神经退行性疾病、肥胖症和糖尿病的有益作用。白藜芦醇诱导多基因表达改变，模拟了由热量限制(CR)所诱导的多基因表达改变(Pearson等，2008)。摄食ResVida? (—种含有白藜芦醇的组合物)，在胖人个体中提供类似于CR的显著代谢变化(Timmers等，2011)。有关另一种含有白藜芦醇的营养品Longevine/的研究显示，短期摄食该营养品会再现CR的长期作用(Barger 等，2008)。
[0008]由基因座编码的A型核核纤层蛋白是V型中间丝蛋白质。两种最著名的A型核纤层蛋白，核纤层蛋白A和C，只在C端不同，其中CaaX基序规定一系列加工事件，包括短暂的异戊二稀化(Rusinol和Sinensky，2006)。Zyl細中新生G608G突变促进可变剪接，产生部分加工的前核纤层蛋白A (prelamin A)(亦称为progerin)，这是Hutchinson-Gilford早老综合征(一种严重形式的早发性早衰)的主要原因(Eriksson等，2003) oZmpste24 (一种负责前核纤层蛋白A成熟的金属蛋白酶)缺陷型小鼠，出现类似于Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)患者的许多早衰样特征(progeroid features)(Pendas 等，2002)。
[0009]本发明人和其它研究者表明，HGPS皮肤成纤维细胞和来源于Z尊胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)经历归因于基因组不稳定和p53途径过度活化的早衰，且通过Z皿7a杂合性降低Z尊小鼠的前核纤层蛋白A水平改善早衰样表型并且显著延长寿命(Fong等，2004 ；Liu等，2005 ；Varela等，2005)。经改造以表达progerin的人细胞显示有缺陷的增殖和早衰(Candelar1等，2008 ；Kudlow等，2008)。
[0010]核纤层蛋白Α/C是核基质(NM)的主要组分，核基质是不同于染色质且对维持核结构是重要的丝状核骨架(Fey等，1991)。染色质和其它蛋白质与匪动态相关以调节各种核活动，包括复制、基因转录、DNA修复和染色质组构(Blencowe等，1994 ;Kruhlak等，2000 ；Phair和Misteli，2000)。例如，NM与大多数核组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性共纯化(Downes等，2000 ；Hendzel等，1991 ；Li等，1996)。HGPS和Z尊细胞的标志之一是畸形核，这导致无序的异染色质(Liu等，2005 ;Pendas等，2002 ;Scaffidi和Misteli，2005)和错定位的核蛋白质，例如 ATR、SKIP、XPA 和 Mof (Krishnan 等，2011 ;Liu 等，2005 ;Liu 等，2008 ；Manju 等，2006 ;Pendas 等，2002 ;Scaffidi 和 Misteli，2005，2006，2008)。通过经由用法呢基转移酶抑制剂(FTI)处理降低来自核被膜的未加工的前核纤层蛋白A或progerin以挽救核形状异常显著改善HGPS细胞和小鼠模型两者中的早衰样特征(Capell等，2005 ；Fong等，2006 ；Glynn 和 Glover, 2005 ；Toth 等，2005 ；VareIa 等，2008)。
[0011]野生型Zyl細基因座上的可变剪接事件可导致低水平progerin的表达，这可影响正常的老化过程(Scaffidi和Misteli，2006)。发现在正常的个体中，在老化期间表达progerin的细胞数增加(McClintock等，2007)，且端粒缩短或功能障碍激活progerin产生(Cao等，2011)。这些研究结果表明progerin可能通过调节参与老化的蛋白质的活性，促进正常的老化过程(Burtner和Kennedy，2010)。
[0012]在过去几年内，白藜芦醇和SIRTl蛋白的热量限制(CR)模拟性质在寻找白藜芦醇模拟物和SIRTl激活剂中吸引了众多努力。已鉴定出显示比白藜芦醇显著较高的SIRTl激活潜力的化合物，这些化合物可诱导与白藜芦醇类似的模拟CR的有益作用。另外，据报道，白藜芦醇特异性地提高针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-LysAe-AMC) (SEQ IDNO:1)而非未修饰的合成肽的SIRTl活性(Borra等，2005 ;Kaeberlein等，2005)。这一发现后来得到其它研究者的证实，表明白藜芦醇和SRT1720不提供针对其全长天然靶蛋白(包括 p53 和 PGC-1 α )的任何 SIRTl 活化(Beher 等，2009 ；Dai 等，2010 ；Pacholec 等，2010)。因此，尽管白藜芦醇和模拟物的各种有益作用，但是基本机制仍不清楚。
[0013]发明简述
在一个实施方案中，本发明提供通过经由相互作用改进化合物改进核纤层蛋白A与SIRTl的结合亲和力而在一种或多种细胞中调节SIRTl的脱乙酰酶活性的方法。SIRTl的脱乙酰酶活性可通过核纤层蛋白A与SIRTl的结合亲和力提高而提高，并且通过核纤层蛋白A与SIRTl的结合亲和力降低而降低。相互作用改进化合物的实例包括但不限于白藜芦醇。在本文所述实施方案中，白藜芦醇提高核纤层蛋白A与SIRTl的结合亲和力。在本发明的一些实施方案中，经由相互作用改进化合物通过提高核纤层蛋白A蛋白的羧基端与SIRTl蛋白的结合能力来调节SIRTl脱乙酰酶活性。
[0014]在一个实施方案中，本发明提供根据核纤层蛋白A和SIRTl蛋白间的相互作用和核纤层蛋白A的SIRTl激活/抑制性质筛选调节SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂的方法。一些方法包括使候选分子与试验样品中表达SIRTl的细胞接触；测定试验样品中的脱乙酰酶活性；如果分子改变试验样品中SIRTl脱乙酰酶活性的水平，则选择该候选分子为调节SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂。激活或提高SIRTl脱乙酰酶活性的候选分子包括但不限于核纤层蛋白A的肽片段，包括核纤层蛋白A的羧基结构域的肽片段；核纤层蛋白A的类似物，包括所述类似物的肽片段；提高核纤层蛋白A与SIRTl结合的化合物；提高或诱导核纤层蛋白A表达的化合物；及其组合。抑制或降低SIRTl脱乙酰酶活性的候选分子包括但不限于核纤层蛋白A的肽片段，包括核纤层蛋白A肽的羧基结构域；核纤层蛋白A的类似物，包括所述类似物的肽片段；抑制核纤层蛋白A活性的作用剂或化合物；抑制核纤层蛋白A表达的作用剂或化合物；及其组合。
[0015]在一个实施方案中，本发明提供用于治疗其中调节SIRTl脱乙酰酶活性是有益的疾病或病况的方法。所述方法包括给予需要所述治疗的受试者有效量的调节SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂。在一些实施方案中，所给予的作用剂提高SIRTl脱乙酰酶活性。SIRTl激活性化合物的实例包括但不限于核纤层蛋白A的肽片段，包括核纤层蛋白A的羧基结构域的片段；核纤层蛋白A的类似物或其片段；提高核纤层蛋白A与SIRTl结合的化合物；及其组合。在其它实施方案中，所给予的作用剂降低SIRTl脱乙酰酶活性。所述作用剂包括但不限于核纤层蛋白A的羧基末端肽和核纤层蛋白A的羧基末端肽的类似物。
[0016]导致SIRTl脱乙酰酶活性提高的本发明方法的实施方案可用于治疗其中增加骨髓基质细胞和/或造血干细胞的数目和/或功能是有益的疾病或病况，例如但不限于代谢和/或衰老相关变性疾病。因此，例如可发生骨密度的增加和骨丢失的防止。此外，导致SIRTl脱乙酰酶活性降低的本发明方法的实施方案可用于治疗瘤形成和其它恶性肿瘤。
[0017]在一个实施方案中，本发明提供用于提高一种或多种细胞的SIRTl脱乙酰酶活性的方法。所述方法包括以有效提高SIRTl的脱乙酰酶活性的量将核纤层蛋白A肽、核纤层蛋白A肽的类似物或其功能片段给予或接触表达SIRTl并需要提高的SIRTl脱乙酰酶活性的一种或多种细胞。在一个实施方案中，本发明的有用的核纤层蛋白A肽是人源的，具有(SEQID N0:2 ;GenBank登录号NP_733821)的氨基酸序列或其类似物。在一个实施方案中，提高SIRTl脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A肽的功能片段包含核纤层蛋白A的羧基结构域或其类似物。核纤层蛋白A肽的羧基结构域可包括SEQ ID NO: 2的氨基酸567-646或其一个或多个片段。特别有用的片段长度为约3个氨基酸-约50个氨基酸。
[0018]在一个实施方案中，本发明提供用于降低或抑制一种或多种细胞的SIRTl脱乙酰酶活性的方法。所述方法包括将核纤层蛋白A蛋白或肽的抑制剂给予表达SIRTl并需要SIRTl脱乙酰酶活性降低的一种或多种细胞。本发明实施方案的有用的核纤层蛋白A抑制剂包括但不限于抑制核纤层蛋白A活性的作用剂；和降低或抑制核纤层蛋白A表达的作用剂，例如抑制核纤层蛋白A的转录、翻译和/或加工的作用剂。
[0019]附图简述
图1显示SIRTl与核纤层蛋白A相互作用，且前核纤层蛋白A/progerin的形成损害SIRTl-核纤层蛋白A相互作用。(A) FLAG-SIRT1和核纤层蛋白A在HEK293细胞中异位表达。通过蛋白质印迹法，在抗FLAG免疫沉淀中检出核纤层蛋白A ;在抗核纤层蛋白Α/C免疫沉淀中检出FLAG-SIRT1。(B)在HEK293细胞的总细胞裂解物中，通过抗核纤层蛋白Α/C免疫沉淀检出内源SIRT1，相反地，通过抗SIRTl免疫沉淀检出内源核纤层蛋白A。(C)人成纤维细胞中SIRTl和核纤层蛋白Α/C的免疫荧光染色和共焦显微术。大部分的核SIRTl与核纤层蛋白A在核内(箭头)共定位。比例尺为5 Mffl0⑶共焦显微术显示异位EGFP-SIRT1和DsRed-核纤层蛋白A在人成纤维细胞细胞中共定位。比例尺为10 Pm。(E)在含有rhSIRTl和重组人核纤层蛋白A (rhLamin A)的试管中，通过抗核纤层蛋白A免疫沉淀检出重组人SIRTl (rhSIRTl)。(F)在HEK293细胞中，在抗FLAG-SIRT1免疫沉淀中检出核纤层蛋白A，而非核纤层蛋白C。(G)将HEK293细胞用FLAG-SIRT1连同A型核纤层蛋白(即野生型核纤层蛋白A)、未加工的前核纤层蛋白A和progerin之一瞬时转染。进行蛋白质印迹法以测定抗FLAG免疫沉淀中A型核纤层蛋白的水平。注意与野生型核纤层蛋白A相比，通过抗FLAG抗体检出显著较少的前核纤层蛋白A/progerin。(H) (G)的定量。数据表示均值土SEM, η = 3。**尸 < 0.0l0
[0020]图2显示早衰样细胞中SIRTl的错定位和脱乙酰酶活性降低。㈧显示核(Nu，Pl)和核基质(W，P2’)级分中各种蛋白质的代表性免疫印迹。匪缔合的SIRTl在
BMSC中显著降低，而在NM级分中，野生型和Zmps te24 7 BMSC间的S ir t6、CBP、Foxo3a、组蛋白H3和β-肌动蛋白的水平相当。总的SIRTl核水平不改变。(B) (A)的定量。数据表示均值土 SEM，n = 3。**P < 0.0l0 (C)核纤层蛋白A、未加工的前核纤层蛋白A或progerin在HEK293细胞中稳定表达。进行亚细胞分级分离和蛋白质印迹法以测定匪缔合的SIRT1。虽然与野生型核纤层蛋白A相比，在前核纤层蛋白A-和progerin转染的细胞中匪缔合的SIRTl降低，但是FoXo3a和β-联蛋白的水平保持不变。(D) (C)的定量。数据表示均值土 SEM，n = 3。**P〈 0.01。(E)抗Foxo3a免疫沉淀中通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法测定的Z尊匆7BMSC中Foxo3a的高度乙酰化。(F) (E)的定量。数据表示均值土 SEM，n = 3。*尸〈0.05, W < 0.01。(G)上图，在抗Foxo3a免疫沉淀中通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法测定的表达异位核纤层蛋白A或前核纤层蛋白A或progerin的HEK293细胞中Foxo3a的乙酰化；下图，输入中的过氧化氢酶、MnSOD和GADD45 α的表达。
[0021]图3显示白藜芦醇以核纤层蛋白A依赖性方式直接激活SIRT1。㈧在rhLaminA 存在或不存在时通过 B1Mol? SIRTl Fluorimetric Drug Discovery Kit (BSDK)测定RhSIRTl脱乙酰酶活性。数据表示均值± SEM, η = 3。*尸〈0.05，林Z5 < 0.01，rhLaminA + rhSIRTl 与仅 rhSIRTl。林* rhLamin A 与 rhSIRTl 的摩尔比率分别为 0.5、1.0、2.0 和4.0。(B)在白藜芦醇存在或不存在时将乙酰FLAG-p53与rhSIRTl和rhLamin A—起温育。通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法测定FLAG-p53乙酰化。通过Image J?量化乙酰化p53的相对水平。^rhLamin A与rhSIRTl的摩尔比率分别为0.5、1.0和2.0。(C)通过蛋白质印迹法评价在白藜芦醇存在或不存在时通过抗核纤层蛋白Α/C抗体检出的rhSIRTl水平。(D)将FLAG-SIRT1和核纤层蛋白A共转染至HEK293细胞中。将细胞用白藜芦醇处理接着抗FLAG免疫沉淀。蛋白质印迹法显示，白藜芦醇处理以剂量依赖性方式增加SIRTl和核纤层蛋白A间的相互作用。(E) (D)的定量。数据表示均值土 SEM，n = 3。〈 0.05。(F)用不同剂量的白藜芦醇处理的野生型、无SIRTl和无Z皿7a细胞的代表性免疫印迹。(G)用或未用白藜芦醇处理的野生型和无Z皿?a细胞中H3K9ac的免疫荧光染色。(H)在试管中白藜芦醇提高rhSIRTl与匪的缔合。按与进行SIRTl脱乙酰酶活性测定法类似的方式，将重组hSIRTl在白藜芦醇(10 μΜ)存在或不存在时与由野生型或ZmpsteZ^ BMSC制备的匪级分一起温育。不溶性匪和反应缓冲液通过离心分离。进行蛋白质印迹法和考马斯蓝染色测定rhSIRTl的水平。
[0022]图4显示在Z尊小鼠中白藜芦醇以SIRTl依赖性方式挽救骨髓基质细胞(BMSC)的减少。㈧白藜芦醇(10 μΜ)提高為妨仏匆7BMSC的集落形成能力。在白藜芦醇存在和不存在时在10 cm培养皿中对新分离的骨髓细胞进行集落形成测定法。(B)集落数计数。数据显示，白藜芦醇(RSV)以剂量依赖性方式(2 μΜ和10 μΜ)提高Zmpste24,BMSC的集落形成能力。数据表示均值土 SEM，n = 4。〈 0.05，白藜芦醇与溶媒。(C)左图，在用或未用白藜芦醇(2 μΜ)处理的BMSC中通过抗SIRTl免疫沉淀检出的前核纤层蛋白A的水平通过免疫印迹法测定；右图，通过免疫印迹法评价白藜芦醇中乙酰化Foxo3a的水平。(D)通过蛋白质印迹法测定的在白藜芦醇(10 μM)存在或不存在时SIRTl或杂乱siRNA处理的ZmpsteZV BMSC中过氧化氢酶和Gadd45 α的水平。(E)在白藜芦醇存在或不存在时SIRTl或杂乱敲减(scramble knocking down)引起的BMSC的集落形成能力。白藜芦醇处理(10 μΜ)提高BMSC中的集落形成能力(左)，通过敲减SIRTl集落形成能力被完全破坏(右)。在6孔板中对新分离的细胞进行集落形成测定法。(F) (E)的定量。数据表示均值土 SEM，n = 5。〈 0.05，“杂乱+白藜芦醇”与“杂乱+ Veh"o (G)通过蛋白质印迹法评价野生型和无Zmpste24的BMSC中在有或没有异位SIRTl时H3K9ac和IR诱导的-H2AX的水平。(H)异位SIRTl提高Z尊和野生型BMSC的集落形成能力。在6 cm培养皿中对新分离的细胞进行集落形成测定法。(I) (H)的定量。数据表示均值土 SEM，η = 5。〈 0.05，SIRTl与模拟品。
[0023]图5显示白藜芦醇在小鼠中挽救ASC下降、改善早衰样特征并延长寿命。㈧用溶媒或白藜芦醇(20 μ g/ml，在饮用水中)治疗的Zmps te24 /小鼠中BMSC的集落形成能力。在10 cm培养皿中对新分离的骨髓细胞进行集落形成测定法。(B) (A)的定量。数据表示BMSC的平均集落数土 SEM，n=3。*P < 0.05。(C)自溶媒治疗和白藜芦醇治疗的Zmpstd^&鼠分离的BMSC中过氧化氢酶、乙酰化p53和H3K9ac的水平。(D)用白藜芦醇饲喂Z尊小鼠增加HSC群。每个点代表个体小鼠的总的骨髓单核细胞中HSC群的百分比。0.05，溶媒治疗的Z尊小鼠相对于野生型，和白藜芦醇治疗(20 μ g/ml，在饮用水中)相对于溶媒治疗的Zmps te24 /小鼠。(E)野生型小鼠和用白藜芦醇(20 μ g/ml，在饮用水中)或溶媒治疗的Zmpste24,小鼠中骨小梁结构的微CT检查。(F)白藜芦醇治疗增加為小鼠的骨矿物密度。数据表示均值土 SEM，η =3。< 0.05，溶媒治疗小鼠相对于野生型，和白藜芦醇治疗(20 yg/ml，在饮用水中)相对于溶媒治疗的小鼠。(G)白藜芦醇治疗和溶媒治疗的雄性Z尊小鼠的体重。数据表示均值土 SEM，n = 10。*/5〈 0.05。⑶白藜芦醇治疗和溶媒治疗的雌性Z尊小鼠的体重。数据表示均值土 SEM，n = 10。< 0.05。(I)白藜芦醇治疗和溶媒治疗的小鼠的存活率。Z5〈 0.0001。(J)白藜芦醇治疗和溶媒治疗的乃取?ie匆/小鼠的最大寿命。数据表示均值土 SEM。**P < 0.01。
[0024]图6显示核纤层蛋白A与SIRTl相互作用。(A)通过免疫共沉淀测定BMSC中核纤层蛋白A和SIRTl间的内源相互作用。(B)通过免疫共沉淀测定野生型和无Z皿^小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中核纤层蛋白A和SIRTl间的内源相互作用。(C)通过抗GFP免疫共沉淀评价GFP-核纤层蛋白A和SIRTl、SIRT2和SIRT5间的相互作用。
[0025]图7显示早衰细胞中SIRTl的错定位和脱乙酰酶活性降低以及在核纤层蛋白A存在时通过白藜芦醇对SIRTl的激活。(A)不同的亚细胞级分中Kap-1和Mcm3的表达。将细胞分级分离，通过蛋白质印迹法测定Kap-1和Mcm3的亚细胞分布。(B) 57无77 7和野生型MEF被分级分离成胞质(〇7切，51)、核质/染色质(Np+Chr，S2’)和核基质(NM，P2，)级分。显示匪缔合的SIRTl的代表性免疫印迹。(C)在来源于健康个体和具有不同Z#遍基因突变的患者的真皮成纤维细胞中通过蛋白质印迹法测定的核和NM级分中的SIRTl表达。注意，与来自健康个体或具有非早衰LMM突变的患者的细胞中的相比，在HGPS细胞中NM缔合的SIRTl被显著减量调节。在HGPS细胞中总的SIRTl核水平也降低。⑶人细胞中SIRTl的定量。与来自非早衰核纤层蛋白病(Iaminopathy)患者和健康个体的真皮成纤维细胞中的相比，HGPS成纤维细胞中匪缔合的SIRTl相对于总的核SIRTl显著减量调节。(E)在