的片段)；模拟核纤层蛋白A活性的化合物的类似物，例如肽模拟物；或提高核纤层蛋白A-SIRTl相互作用的化合物。
[0073]核纤层蛋白A肽的功能片段的长度可为5-600个氨基酸或之间的任何长度，包括但不限于长度为 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550 和 600 个氨基酸。
[0074]在另一个实施方案中，提高SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂的筛选测定法还包括测定候选分子与SIRTl的结合，如果所述分子与SIRTl结合或提高核纤层蛋白A (或其功能片段)与SIRTl的结合，则选择该候选分子。
[0075]在一个实施方案中，本发明提供用于筛选降低或抑制SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂的方法，所述方法包括使候选分子与试验样品中表达SIRTl的细胞接触；测定试验样品中的脱乙酰酶活性；如果所述分子降低或抑制试验样品中SIRTl脱乙酰酶活性的水平，则选择该候选分子作为降低或抑制SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂。
[0076]在降低或抑制SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂的筛选测定法的一个实施方案中，候选分子选自抑制核纤层蛋白A活性的作用剂；和降低或抑制核纤层蛋白A表达的作用剂，例如抑制核纤层蛋白A的转录、翻译和/或加工的作用剂。
[0077]在一个实施方案中，降低或抑制SIRTl脱乙酰酶活性的作用剂的筛选测定法还包括测定候选分子与SIRTl的结合，且如果所述分子抑制核纤层蛋白A与SIRTl结合，则选择该候选分子。
[0078]在某些实施方案中，筛选测定法检查SIRTl使选自KU70、NbsU p53、NF-κ B、PPAR γ, PGC-1 a、F0X0和SUV39H1的蛋白质脱乙酰的体外活性。在某些实施方案中，筛选测定法检查 SIRTl 使选自 Ac-Arg-His-Lys-LysAe-AMC (SEQ ID NO:1)或全长乙酰化FLAG_p53蛋白的蛋白质脱乙酰的体外活性。
[0079]脱乙酰活性可通过以下方法测定:包括但不限于免疫共沉淀、蛋白质印迹法、ELISA、免疫荧光、放射免疫测定法、免疫细胞化学及其组合。
[0080]在某些实施方案中，本发明提供包括在SIRTl重组蛋白的动力学(UP疋)上测定SIRTl激活性肽或模拟物的方法；测定在肽激活剂存在或不存在时SIRTl的结构；和测定肽激活剂对培养的人细胞和早衰小鼠模型的生物作用。
[0081]疾病的治疗
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗其中SIRTl脱乙酰酶活性提高是有益的疾病或病况的方法，所述方法包括给予需要所述治疗的患者或受试者有效量的核纤层蛋白A肽、提高SIRTl脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A的类似物或其功能片段。
[0082]在不同的实施方案中，其中SIRTl脱乙酰酶活性提高可能是有益的且可按照本发明治疗的疾病或病况包括但不限于代谢疾病，例如肥胖症、糖尿病；神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病；和衰老相关疾病。
[0083]在一个实施方案中，本发明提供用于治疗其中SIRTl脱乙酰酶活性降低是有益的疾病或病况的方法，所述方法包括给予需要所述治疗的患者或受试者有效量的核纤层蛋白A肽的抑制剂。在一个实施方案中，其中SIRTl脱乙酰酶活性降低可能是有益的疾病或病况包括但不限于瘤形成。
[0084]本文所用术语“受试者”或“患者”描述可向其提供用本发明的组合物治疗的生物，包括哺乳动物，例如灵长类动物。可获益于所公开的治疗方法的哺乳动物种类包括但不限于类人猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；驯养动物，例如狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和其它动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
[0085]本文所用术语“治疗”或其任何语法变化(例如treat、treating和treatment等)包括但不限于缓解疾病或病况的症状；和/或减轻、压制、抑制、减缓或影响疾病或病况的进展、严重性和/或范围。
[0086]本文所用术语“有效量”是指能够治疗、预防或改善疾病或病况或以别的方式能够产生预期的治疗作用的量。
[0087]治疗组合物和制剂
本发明还提供包括呈可与药学上可接受的载体组合的形式的本发明的化合物的治疗或药物组合物。在这种情况下，化合物可以是例如分离的或基本纯的。
[0088]术语“载体”是指化合物与其一起给予的稀释剂、辅助剂、赋形剂或溶媒。所述药用载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油(例如矿物油)、植物油(例如花生油、大豆油和芝麻油)、动物油或合成源的油的那些。盐溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体，特别用于注射溶液剂。用于治疗或改善中枢神经系统炎症的特别优选的药用载体是可穿透血/脑屏障的载体。本文所用载体不包括在自然界存在的天然植物材料。
[0089]合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如有需要，治疗组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或PH缓冲剂。这些组合物可呈以下形式:溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等。组合物可用传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)配制。合适的药用载体的实例描述于E.ff.Martin的“Remington’sPharmaceutical Sciences”。所述组合物含有治疗有效量的治疗组合物以及适量的载体以提供适当给予患者的形式。制剂应适于给药方式。
[0090]在一个实施方案中，本发明提供适于局部注射给予人类的药物组合物。通常，用于局部注射给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液剂。需要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉药(例如利多卡因)以舒缓注射部位的疼痛。一般而言，各成分单独施用或在单位剂型中混合在一起，例如作为标明活性剂的量的密封容器(例如安瓿或小袋)中的冻干粉或无水浓缩物。在组合物通过注射给予时，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水，使得可在给药前将所述成分混合。
[0091]本发明的治疗或药物组合物可配成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与游离羧基形成的盐，例如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
[0092]本发明还提供药包或药盒，其包含一个或多个装有本发明的药物组合物的一种或多种成分(例如化合物、载体)的容器。
[0093]给药途径
可将本发明的化合物和组合物通过标准途径给予正治疗的受试者，所述途径包括口月艮、吸入或胃肠外给药，包括静脉内、皮下、局部、经皮、皮内、跨黏膜、腹膜内、肌内、囊内、眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔以及作为待(临时或永久地)插入受试者中的任何医疗装置或物体的组分共同给予。
[0094]在治疗特定疾病、病况或病症中是有效的本发明的治疗或药物组合物的量将取决于给药途径和疾病、病况或病症的严重性，并且应按照从业医师的判断和各患者的情况决定。一般来说，剂量范围为约0.001 mg/kg-约3 g/kgo例如，合适的单位剂量可介于约0.0 1-约 3 g、约 0.0 1-约 I g、约 0.01-约 500 mg、约 0.01-约 400 mg、约 0.01-约 300 mg、约 0.01-约 200 mg、约 0.0 1-约 100 mg、约 0.0 1-约 50 mg、约 0.01-约 30 mg、约 0.0 1-约 20mg、约 0.01-约 10 mg、约 0.01-约 5 mg、约 0.01-约 3 mg、约 0.01-约 I mg 或约 0.01-约0.5 mg之间。可以一天一次以上(例如一天两次或三次)给予所述单位剂量。
[0095]可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据病况的类型和待治疗的受试者而变化。一般来说，治疗组合物含有约5%-约95%活性成分(w/w)。更具体地讲，治疗组合物含有约20% (w/w)-约80%或约30%-约70%活性成分(w/w)。
[0096]—旦患者病况发生改善，则需要时给予维持剂量。随后，可随症状而变将剂量或给药频率或两者减至保持病况改善的水平。当症状已减轻到所需水平，则应终止治疗。然而根据疾病症状的任何复发，患者可能长期需要间断性治疗。
[0097]另外，体外测定法可任选用于辅助鉴定最佳剂量范围。待用于制剂中的精确剂量也将取决于给药途径及疾病、病况或病症的严重性，并且应按照从业医师的判断和各患者的情况决定。可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推算有效剂量。
[0098]材料与方法
细胞系、构建体和抗体
使HEK293细胞、MEF和人真皮成纤维细胞维持在补充10% FBS的DMEM中。来源于HGPS患者的HGADFN143、HGADFN188、HGADFN164和HGADFN122皮肤成纤维细胞由早衰研究基金会(Progeria Research Foundat1n)提供。人健康真皮成纤维细胞PH和带有Zi姻突变(即R453W、R482W和 R401C)的细胞由 Manfred Wehnert 教授(Institute of Human Genetics,University of Greifswald, Greifswald, Germany)提供。无 SIRTl 的 MEF 由 Chu-XiaDeng 教授(NIDDK，Nat1nal Institutes of Health, USA)提供。别处描述了 F2-S 人成纤维细胞和来自小鼠胚胎的MEF的制备(Liu等，2005)。
[0099]按照生产商的程序，用Lipofectamine2000? (Invitrogen，USA)进行转染。SIRTlsiRNA寡聚物购自Invitrogen，USA。先前已描述了核纤层蛋白A和未加工的前核纤层蛋白A构建体(Liu等，2005)。progerin构建体通过基于核纤层蛋白A构建体的细菌重组工程产生。Flag_F0X03A (Addgene 质粒 8360)获自 Dr M.E Greenberg (Brunet 等，2004)。腺病毒 SIRTl 构建体(Addgene 质粒别38) (Rodgers 等，2OO5)由 Dr P Puigserver 提供。EGFP-SIRTI 构建体(Sun 等，2007)由 Prof Qiwei Zhai (Shanghai Institutes forB1logical Sciences，China)提供。加 Flag 标签的 SIRTl 突变体、Flag-p53 和 p300 构建体是来自 Dr.Zhenkun Lou (Mayo Clinic College of Medicine, USA)白勺惠赠。
[0100]兔抗SIRT6、抗SIRTl、抗CBP和抗乙酰赖氨酸抗体获自Abeam (Cambridge, UK)。兔抗 H3K9ac 和小鼠抗 γ -Η2ΑΧ 抗体购自 Millipore (Bedford，MA, USA)。抗 SIRTl、抗核纤层蛋白A/C、抗过氧化氢酶、抗MnSOD和抗Gadd45 α抗体购自Santa Cruz (Santa Cruz,CA，USA) ο 兔抗 Foxo3a 购自 B1Vis1n (Mountain View，CA，USA)。生物素标记的谱系标志物购自 BD B1sciences (San Jose，CA，USA) 0 PE 抗小鼠 CD105 抗体购自 eB1science(San Diego, CA，USA)。
[0101]Zmps te24 ,小鼠的白藜芦醇治疗
先前已描述了 Z尊小鼠(Pendas等，2002)。小鼠实验按照香港大学教学与研究活动物使用委员会(Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research,⑶LATR)的准则进行。给新生的Z尊小鼠和野生型对照饲喂含白藜芦醇(20 Pg/ml)或N-乙酰半胱氨酸(I mg/ml)的饮用水。记录白藜芦醇治疗、NAC治疗或溶媒治疗的Z尊小鼠的存活，并每周监测其体重。通过微CT测定骨小梁组构和骨矿物密度。通过Kaplan-Meier方法分析存活率，通过Log-rank (Mantel-Cox)检验进行统计比较。
[0102]骨髓基质细胞和造血干细胞
按照修改方案(使用MesenCuiIt?的小鼠间充质祖细胞计数和扩增，StemcelITechnologies，Canada)，分离并培养骨髓基质细胞。简单地说，用补充20% FBS的a-MEM(Invitrogen, Carlsbad, CA，USA)从股骨和胫骨冲洗出骨髓细胞，并铺于培养皿中。在第3天除去未贴壁细胞，每3天更换培养基。BMSC集落用甲醇固定，并在规定日用结晶紫溶液染色。对于磁富集，按照生产商说明书，使用MidiMACS ?磁性细胞分选试剂盒(MiltenyiB1tec, Bergisch Gladbach, Germany)除去⑶Ilb阳性群。统计含有超过50个细胞的集落。BMSC集落形成效率计算为由17个骨髓有核细胞形成的集落的数目。
[0103]为了分析造血干细胞，通过用染色培养基(补充2% FBS的HBSS)冲洗股骨和胫骨来收集单核细胞，用生物素偶联的谱系标志物生物素_Flt3、PE-Sca-U APC-c-Kit且然后用SAv-PerCP染色。采用BD FACSCalibur进行FACS概况分析。
[0104]为了纯化HSC，在表面标志物染色前，使用NH4Cl溶解红细胞，然后用BDFACSVantage SE分选HSC。将分选的HSC与5 μΜ DCF-DA在37 °C下温育30分钟，通过FACS以488-nm激发和525_nm发射进行分析以测定ROS水平。
[0105]对于造血重构，使用Gammacell 3000 Elan辐照器，用9 Gy的剂量对接受者小鼠(B6SJL/BoyJ)进行致死照射，将500个纯化的供体HSC通过尾静脉给接受者注射。在再增殖后，收集外周血，针对细胞表面标志物染色，并通过FACS分析。
[0106]SA-β -半乳糖苷酶测定法
按照生产商说明书，米用 Cellular Senescence Assay Kit (ChemiconInternat1nal, CA，USA)进行SA-β -半乳糖苷酶测定法。对于MEF，在第4次传代时在完全培养基中补充白藜芦醇，在第6次传代时，进行SA-β -半乳糖苷酶测定法。为了量化SA-β-半乳糖苷酶染色，用100 μ? DMSO提取染成蓝色的沉淀，在415 nm下记录吸光度。
[0107]免疫荧光染色
使BMSC在腔室载玻片上生长，在4%低聚甲醛中固定，然后在含5%正常血清的1% BSA/PBS中在4°C下封闭过夜，然后与稀释于1% BSA/PBS中的第一抗体一起在4°C下在潮湿箱中温育过夜。将载玻片用PBS洗涤3次，与稀释于1% BSA/PBS中的FITC-或TRITC-偶联的第二抗体一起在室温下温育40分钟，用PBS洗涤3次除去未结合的抗体，用含DAPI(Invitrogen，USA)的antifade试剂封片，用指甲油密封，并进行显微镜分析。照片用Photoshop CS?处理。
[0108]蛋白质提取、分级分离、蛋白质印迹法和免疫共沉淀通过将细胞悬浮于5体积的悬液缓冲液(0.1 M NaClUO mM Tris-HCl，pH 7.5,1mM EDTA、lmM DTT, pH 8.0、蛋白酶抑制剂)中，然后加入5体积的Laemmli缓冲液(0.1 MTris-HCl,pH 7.0,4% SDS、20%甘油、I mM DTT、蛋白酶抑制剂)，煮沸5分钟，来制备完整细胞裂解物。
[0109]如所述将细胞分级分离(Mendez和Stillman，2000)。简单地说，将细胞悬浮于100μ? 冰冷的缓冲液 A (10 mM HEPES, pH 7.9、10 mM KCU1.5 mM MgCl2、0.34 M 蔗糖、10% 甘油、I mM DTT、蛋白酶抑制剂)中。在加入0.1% Triton X-100后，将细胞悬液轻轻混合，在冰上温育5分钟，在4°C下以1300 X g离心4分钟。将上清液(SI)转移到新的管中，通过高速离心(12000 X g，10分钟，4°C)澄清。剩余的核沉淀(Pl)用100 μ?缓冲液A洗涤一次，然后重新悬浮于补充I mM CaCljP 2单位的微球菌核酸酶的100 μ?缓冲液A中，在37°C下温育15分钟。通过加入I mM EGTA终止反应，然后在4°C下将悬液以1300 x g离心4分钟。将所得沉淀重新悬浮于100 μ?缓冲液B (3 mM EDTA、0.2 mM EGTA、1 mM DTT)中，在4°C下以1700 X g离心4分钟。将含有核质和染色质结合的蛋白质的全部可溶性组分的上清液(S2’)转移到另一个管中；将含有全部核基质组分的剩余的沉淀(P2’)悬浮于100 μι Laemmli缓冲液中，煮沸5分钟。
[0110]如前所述进行蛋白质印迹法(Liu等，2005)。通过Image Γ测量相对条带强度，并按标示，归一化至相应的野生型或未治疗对照。
[0111]对于统计学分析，使至少3个独立的免疫印迹量化，对于Ztt采用斯氏(student)
T检验。
[0112]对于免疫共沉淀，使细胞裂解入预冷却的含有300 mM或500 mM NaCl和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中。将第一抗体或合适的对照IgG加入裂解液中，在摇床上在4°C下温育2小时后，加入琼脂糖珠粒，并温育0/N。将珠粒用RIPA缓冲液洗涤两次，重新悬浮于Laemmli缓冲液中，并煮沸，通过离心收集蛋白质悬液，保存待进一步分析。
[0113]体外SIRTl脱乙酰测定法
按照生产商说明书，用 SIRTl Fluorimetric Drug Discovery Kit (B1mol，Hamburg，Germany)对焚光团缀合的合成p53肽进行SIRTl脱乙酰测定法。如上所述对细胞进行分级分离，只是不包括蛋白酶抑制剂，将核基质级分悬浮于供应商提供的测定缓冲液中。在SIRTl Fluorimetric Drug Discovery Kit的反应混合物中加入不同的细胞级分或重组人核纤层蛋白A (rhLamin，Diatheva, Italy)，在37°C下温育20分钟，然后终止反应，检测焚光信号。使用得自Sigma (USA)的SIRTl测定试剂盒，测定对天然靶标的SIRTl脱乙酰酶活性。将编码FLAG-p53和HA-p300的构建体共转染至HEK293细胞中；通过抗FLAG M2琼脂糖(Sigma)使FLAG-p53免疫沉淀，接着用FLAG肽(Sigma)洗脱。在rhLamin A或白藜芦醇存在或不存在时，将纯化的乙酰FLAG-p53与重组人SIRTl (rhSIRTl)和NAD+ —起在37°C下温育30分钟。用泛抗乙酰基赖氨酸抗体，通过蛋白质印迹法测定FLAG-p53的乙酰化水平。
实施例
[0114]下面是说明用于实施本发明的实施方案和程序的实施例。实施例不应解释为限制性的。所有百分比以重量计算，所有溶剂混合物比例以体积计算，除非另有说明。
[0115]实施例1一SIRTl与核纤层蛋白A相互作用而前核纤层蛋白A或progerin破坏所述相互作用
为了确定SIRTl可能参与早衰，在表达异位加Flag标签的SIRTl的HEK293细胞中，通过免疫共沉淀检测核纤层蛋白A和SIRTl之间可能的相互作用。
[0116]在抗FLAG免疫沉淀中检出核纤层蛋白A，而在抗核纤层蛋白A/C免疫沉淀中检测到FLAG-SIRT1 (图1A)。在HEK293细胞、骨髓基质细胞(BMSC)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中证实了内源SIRTl和核纤层蛋白A/C间的相互作用，其中在抗SIRTl免疫沉淀中检出核纤层蛋白A，反之亦然(图1B，6A，6B)。
[0117]免疫荧光共焦显微术显示，大多数核SIRTl与核质核纤层蛋白A/C共定位于人成纤维细胞中的核内(图1C)。异位EGFP-SIRT1和DsRed-核纤层蛋白A始终共存在于核内(图1D)。这种相互作用似乎对核SIRTl有特异性，因为在抗GFP-核纤层蛋白A免疫沉淀中既未检测到胞质SIRTl也未检测到线粒体SIRT5 (图6C)。另外，SIRTl与核纤层蛋白A物理相互作用，因为在试管中通过重组人核纤层蛋白A (rhLamin A)检出重组人SIRTl(rhSIRTl)(图 1E)。
[0118]2#似的可变剪接产生不同的A型核纤层蛋白，其中核纤层蛋白A和C最丰富(Lin和Worman，1993)。核纤层蛋白A和C共有前566个氨基酸；核纤层蛋白A具有特定的98个氨基酸羧基尾，核纤层蛋白C具有独特的6个氨基酸羧基尾(Liu和Zhou，2008)。
[0119]虽然在HEK293细胞中核纤层蛋白C的水平比A高得多，但是在抗SIRTl免疫沉淀中几乎检不到核纤层蛋白C (图1B)，表明了核纤层蛋白A可能通过其C端结构域与SIRTl相互作用。这通过表达FLAG-SIRT1连同核纤层蛋白A或核纤层蛋白C的HEK293细胞的免疫共沉淀得到进一步证实。如图1F所示，在抗FLAG-SIRT1免疫沉淀中检测到核纤层蛋白A，而核纤层蛋白C可忽略。
[0120]被广泛公认的是，progerin或前核纤层蛋白A中未加工的C端尾负责HGPS和早衰小鼠模型中的早衰样特征。鉴于核纤层蛋白A与SIRTl通过其C端结构域相互作用，该实施例研究了与核纤层蛋白A相比，SIRTl和前核纤层蛋白A或progerin间的相互作用是否减弱。在表达FLAG-SIRT1连同A型核纤层蛋白(即野生型核纤层蛋白A)、前核纤层蛋白A或progerin之一的HEK293细胞中进行了免疫共沉淀。
[0121]如图1G、1H所示，与核纤层蛋白A相比，通过抗FLAG抗体检出显著较少的前核纤层蛋白A和progerin，尽管输入中存在相当或较高水平的FLAG-SIRT1和前核纤层蛋白A/progerin。结果表明，SIRTl优先与核纤层蛋白A相互作用，而前核纤层蛋白A或progerin与SIRTl的缔合显著减少。
[0122]实施例2 — SIRTl在早衰细胞中错定位
核纤层蛋白A是匪的主要组分之一。该实施例通过亚细胞分级分离研究了 SIRTl与匪的缔合。使用57无TV7细胞作为SIRTl蛋白特异性染色的阴性对照。KAP-1 (KRAB相关蛋白1，亦称为Trim28或Tifl β )和MCM3蛋白质用作亚细胞分级分离纯化的阳性对照。
[0123]KAP-1是一种异染色质因子，据报道与核中的大部分抗微球菌核酸酶级分缔合(Goodarzi等，2008 ；Ryan等，1999)。MCM3蛋白质在防止在S期内的过量DNA复制中是重要的，并且主要与染色质缔合(Mendez和Stillman，2000)。
[0124]正如预期的一样，Kap-1是抗MNase消化的，并保留在匪级分(P2’)中，而大部分Mcm3在MNase处理后释放到核质和染色质级分(S2’)中(图7A)。与其与核纤层蛋白A的相互作用一致，在MEF中，NM级分(P2’)富含SIRTl蛋白(图7B)。
[0125]因为与核纤层蛋白A相比，前核纤层蛋白A与SIRTl具有较低的结合能力，且SIRTl在干细胞中高表达(Saunders等，2010)，所以该实施例还在多能BMSC中通过亚细胞分级分离研究了 SIRTl在為细胞中