包含缺氧诱导因子-1α的组合物及其使用方法
【专利说明】包含缺氧诱导因子-1a的组合物及其使用方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/800,703的优先权，其 全部内容在此通过引用并入。
[0003] 政府利益的声明
[0004] 本发明是在由美国国家卫生研究院授予的合同号K12HL083772-01下借助政府资 助进行的。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
[0005] 本发明涉及包含缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)的组合物和治疗缺氧或局部缺血 的方法。
【背景技术】
[0006] 在哺乳动物中，胚胎发育和成人动态平衡的维持依赖于向哺乳动物的组织和细胞 提供氧气（〇 2)和其他营养物质的功能性血管系统的建立。氧气至这些组织的和细胞的局 部递送是由循环系统通过预存血管的紧张度的瞬间变化、新血管的建立（血管生成）和现 有血管的重塑（以接受增加的血流）（动脉生成）来调节的。生理和病理状况下的组织灌 流由缺氧诱导因子-l(HIF-l)调节。
[0007]HIF-1是由氧调节a亚基（HIF-1a)和组成型表达的0亚基（HIF-1 0 )组成的 异二聚体转录因子。HIF-1通过指导通过对血管紧张度的作用、血管生成和/或动脉生成参 与血管内平衡的基因的转录来介导后生生物的有核细胞的对缺氧和局部缺血的适应性响 应。在病理状况诸如严重肢体缺血（CLI)下，HIF-1可被抑制，从而导致减少的组织灌流、 静止时缺血性疼痛的表现、溃疡和/或坏疽，并最终导致截肢。
[0008] 因此，存在对用于治疗与局部缺血和/或缺氧相关的治疗的组合物和方法（包括 增加患病组织的组织灌流和恢复对局部缺血和缺氧的正常生理响应）的鉴定和开发的需 要。
【发明内容】
[0009] 本发明涉及一种包含缺氧诱导因子_la(HIF-a)的治疗剂。本发明还涉及治疗 有此需要的受试者的缺氧或局部缺血的方法。所述方法可以包括向所述受试者施用所述治 疗剂。
【附图说明】
[0010] 图1显示举例说明缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)蛋白的特征的示意图。
[0011] 图2显示举例说明实验性研究设计的概要的示意图。EP，电穿孔；HIF-la，缺氧诱 导因子1a;頂，肌内注射；LDPI，激光多普勒灌注成像仪；pVAX，空骨架质粒DNA。
[0012] 图3显示（A)利用激光多普勒灌注成像仪记录的代表性图像；(B)将股动脉结扎 后天数相对肢体灌注率（结扎的/未结扎的）绘图的曲线图；(C)将股动脉结扎后天数相 对肢体运动评分绘图的曲线图；和（D)将处理组相对小于3的肢体坏死评分的百分比绘图 的曲线图。
[0013] 图4显示⑷利用编码HIF-1a的DNA与电穿孔（EP)的组合处理的小鼠、⑶利 用编码HIF-1a的DNA的肌内（頂）注射处理的小鼠、（C)pVAXlDNA(空载体对照）和EP的 组合处理的小鼠和（D)假处理的肢体的后肢术后恢复的总体描绘。在图4A-图4D的每一 个图中，箭头指示患病肢体。
[0014] 图5显示（A)用苏木精和伊红（H&E)染色的收肌组织切片的代表性显微照片（原 始放大倍数，x200) ;(B)将处理组相对组织坏死（面积百分比）绘图的曲线图；（C)针对 ⑶31+毛细血管染色的收肌组织的代表性显微照片（原始放大倍数，x200);和（d)将处理 组相对毛细血管密度（⑶31+细胞/HPF)绘图的曲线图。
[0015] 图6显示（A)将处理组相对总动脉数（SMA+血管/HPF)绘图以及（B)将处理组相 对血管面积（ym2)绘图的曲线图。
[0016] 图7显示（A)编码小鼠HIF-1a的核酸序列，其中下划线标示起始密码子和编码 IgE前导序列的核苷酸，双下划线和粗体标示编码代替脯氨酸的丙氨酸的密码子；和（B)小 鼠HIF-la的氨基酸序列，其中下划线标示起始甲硫氨酸和连接于HIF-la氨基酸序列的 IgE前导序列，双下划线和粗体标示已替代了HIF-1a的氨基酸序列中的野生型脯氨酸残 基的丙氨酸残基。
[0017] 图8显示（A)编码小鼠HIF-1a的核酸序列，其中5'末端上的下划线标示用于克 隆目的的BamHI限制性位点（S卩，GGATCC)和Kozak序列（S卩，GCCACC)，3'末端上的下 划线标示终止密码子（即，TGATAA)和用于克隆目的的Xhol限制性位点（即，CTCGAG)， 双下划线和粗体标示编码替代脯氨酸的丙氨酸的密码子；和（B)小鼠HIF-1a的氨基酸序 列，其中双下划线和粗体标示已替代了HIF-1a的氨基酸序列中的野生型脯氨酸残基的丙 氨酸残基。
[0018] 图9显示（A)编码人HIF-1a的核酸序列，其中双下划线和粗体标示编码替代脯 氨酸的丙氨酸的密码子；和（B)人HIF-1a的氨基酸序列，其中双下划线和粗体标示已替代 了HIF-la的氨基酸序列中的野生型脯氨酸残基的丙氨酸残基。
【具体实施方式】
[0019] 本发明涉及用于治疗缺氧或局部缺血的治疗剂。所述治疗剂可以包含缺氧诱导因 子-la(HIF-la)。所述治疗剂可以促进或诱发血管形成。相较于未被施予所述治疗剂的 受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的毛细血管密度、侧支血管形成、血 管尺寸或其组合。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治 疗剂的受试者的组织灌流。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可减少被施 予所述治疗剂的受试者的组织坏死。
[0020] 因此，所述治疗剂可用于治疗缺氧或局部缺血的方法。缺氧或局部缺血可与严重 肢体缺血相关。
[0021] 1?定义
[0022] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员 理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件（包括定义）为准。下文中描述了优 选的方法和材料，尽管可在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的那些方法和材料类 似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引 用整体并入。本文中公开的材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并非意在限制。
[0023] 如本文中所用，术语"包含/包括"、"包括"、"具有"、"有"、"可以"、"含有"及其变 型意欲为不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文 另有明确说明，否则单数形式"一个（a) "、"和（and)"以及"该（the)"包括复数参考物。本 公开还涵盖"包含/包括"本文中提出的实施方案或组件、"由所述实施方案或组件组成"和 "基本上由所述实施方案或组件组成"的其它实施方案，无论是否明确地显示。
[0024] 如本文中所用，"编码序列"或"编码核酸"意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核 酸（RNA或DNA分子）。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个体或哺乳动 物的细胞中指导表达的调控元件（包括启动子和多聚腺苷酸化信号）的起始和终止信号。
[0025] 如本文中所用，"互补"或"互补的"意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的 沃森-克里克（Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
[0026] 如本文中可互换使用的"电穿孔"、"电-透化"或"电动增强"（"EP"）意指使用 跨膜电场脉冲来诱发生物膜中的微观通路（孔）；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核 苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。
[0027] 如本文中所用，"片段"意指编码能够改变或影响哺乳动物中的血管内平衡的变化 (例如，但不限于通过对血管紧张度的作用、血管生成和/或动脉生成）的多肽的核酸序列 或其部分。所述片段可以是选自编码下文中所示的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一 个的DNA片段。所述片段可以是选自编码下文中所示的蛋白质片段的各种核苷酸序列的 至少一个的DNA片段。片段可包含下文中所示的核酸序列的一个或多个的至少10%、至少 20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95%。在一些实施方案中，片段可包含下文中所示的核酸序列的至少一个的至少20个核苷 酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至 少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷 酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、 至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400 个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸 或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至 少750个核苷酸或更多、至少800个核苷酸或更多、至少850个核苷酸或更多、至少900个 核苷酸或更多、至少950个核苷酸或更多或至少1000个核苷酸或更多核苷酸。
[0028] 关于多肽序列的"片段"意指能够改变或影响哺乳动物中的血管内平衡的变化 (例如，但不限于通过对血管紧张度、血管生成和/或动脉生成的作用）的多肽。所述片段可 以是选自下文中所示的各种氨基酸序列的至少一个的多肽片段。片段可包含下文中所示的 蛋白质的一个或多个的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少95 %。在一些实施方案中，片段可包含下文中所示的 蛋白质的至少一个的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸 或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少 80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸 或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至 少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个 氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或 更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多氨基 酸。
[0029] 如本文中所用，"遗传构建体"或"构建体"是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的 DNA或RNA分子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中 指导表达的调控元件（包括启动子和多聚腺苷酸化信号）的起始和终止信号。如本文中所 用，术语"可表达的形式"是指基因构建体或构建体，所述基因构建体或构建体含有有效地 连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码 序列将被表达。
[0030] 如本文中所用，"缺氧"意指环境氧气（02)浓度的降低。
[0031] 如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，"相同的"或"同一 性"意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比：将 两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基的 位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及将 结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或多 个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计算 的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶（T)和尿嘧啶（U)认为是等同的。 人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST2. 0来获得同一性。
[0032] 如本文中所用，"局部缺血"意指其中组织灌流被缩减，使得氧气（02)的可用度不 足以满足组织代谢需要的状况。
[0033] 如本文中所用，核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"意指共价连接在一起的至少两 个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补链。核 酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相同的核 酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严 格杂交条件下杂交的探针。
[0034] 核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基 因组和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及碱 基（包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异 鸟嘌呤）的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。
[0035] 如本文中所用，"有效连接的"意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控制 下。启动子可位于在其控制下的基因的5'（上游）或3'（下游）。启动子与基因之间的距 离可与在所述启动子来源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如在 本领域中是已知的，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。
[0036] 如本文中所用，"肽"、"蛋白质"或"多肽"可意指氨基酸的连接的序列，并且可以是 天然的、合成的或者经修饰的或者天然和合成的组合。
[0037] 如本文中所用，"启动子"意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成 或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强所述序列 的表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含与转录起始位点相距多 达数千碱基对的远端增强子或阻遏子元件。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫 和动物的来源。启动子可针对表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生所处的发育阶 段，或响应外部刺激（诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂