体 的体积。
[0124] 所述装置还可包含：用于支持针的基座；和用于在其中接受基座的壳体，其中所 述基座相对于壳体是可移动的，以便当基座相对于壳体位于第一向后位置时将针在壳体内 收回，以及当基座位于壳体内的第二向前位置时针伸出壳体。这对于用户是有利的，因为可 将所述壳体在患者的皮肤上排成一列，随后可通过相对于基座移动壳体将针插入患者的皮 肤。
[0125] 如上所述，期望实现速率受控的流体注射，以便当将针插入皮肤时，流体在针的长 度上均匀分布。所述流体递送装置可包含被适配成以受控速率注射流体的活塞驱动装置。 活塞驱动装置可以例如通过伺服马达来驱动。然而，活塞驱动装置可通过相对于壳体在轴 向方向上移动的基座来驱动。应理解，可提供用于流体递送的备选装置。因此，例如，可提 供可被挤压以以受控或非受控速率进行流体递送的封闭容器来替代注射器和活塞系统。
[0126] 上述设备可用于任何类型的注射。然而设想其在电穿孔领域中是特别有用的，因 此其还可包含用于对针施加电压的装置。这使得针不仅能用于注射而且还可在电穿孔过程 中用作电极。这是特别有利的，因为这意味着电场被施加至与注射流体相同的区域。历来 存在关于电穿孔的问题，因为极难精确地将电极与先前注射的流体对齐，所以用户意欲在 更大面积上注射比所需的体积更大的体积的流体，和在更高的区域上施加电场以试图保证 注射物质与电场之间的重叠。通过使用本发明，可减小注射的流体体积和施用的电场的尺 寸，同时实现电场与流体之间的良好拟合。
[0127] 本发明具有通过下列非限定性实施例说明的多个方面。
[0128] 4.实施例
[0129] 实施例1
[0130] 用于实施例2-5的材料和方法
[0131] 在下述实施例2-5中描述的实验使用实施例1中在此描述的方法，和调查组织缺 血期间血管生成的刺激。具体地，调查检测在组织缺血期间HIF-1a对血管生成的刺激。通 过单独的体内电穿孔（EP)或肌内（頂）注射施用编码组成型表达的HIF-1a基因（如上文 中所描述的，从而包含脯氨酸至丙氨酸的取代）的DNA质粒。
[0132] 方法概述
[0133]在分配至 3 个组：（l)HIF-EP(n= 13);⑵HIF-頂(n= 14)和（3)空质粒 (pVAX)-EP(n= 12)的小鼠中进行左肌动脉结扎。将单次剂量的HIF-la或PVAXDNA(每 种20yL，5yg/yL)注射入缺血的收肌，随后进行EP(组1和3)。组2中的小鼠接受单独 的HIF-la质粒DNA的頂注射。从结扎前至结扎后第0、3、7、14和21天，如下文中更详细 地描述的，测量利用激光多普勒灌注成像仪定量的肢体灌流恢复、肢体功能和肢体坏死。在 第21天，处死存活的小鼠（4-5只/组），使用苏木精和伊红对收肌的坏死进行染色，并且如 下文中更详细描述的，经由抗-a-平滑肌肌动蛋白抗体的毛细血管密度（抗-CD31抗体）。
[0134] 详细方法
[0135] 实验方案。进行（图2)实验以评估下列变量：（1)使用超声激光多谱勒仪评价肢 体灌流随时间的恢复；（2)调查肢体保留和存活离自离断的程度；和（3)评估组织的组织学 特性（包括组织坏死的程度）的改善。将39只年龄和性别匹配的野生型Balb/c小鼠分配 至以下3个处理组的一个组中：（1) 13只小鼠（积极处理，HIF-laDNA/EP) ; (2) 14只小鼠 (阳性对照，11正-1&0嫩/頂）；和（3)12只小鼠（阴性对照，空质粒研4乂]0嫩/^)。左肢接 受干预，然而右肢不接受干预以允许测量的变量的小鼠内比较和调整。在第21天结束时， 在最终的组织分析中包括每组平均4至5只动物。
[0136] 股动脉结扎。关照上述称重为25g至30g的小鼠（TheJacksonLaboratory,Bar Harbor，Me)，并且在根据宾夕法尼亚大学医学院的大学机构动物护理和使用委员会的指导 方针批准后对其进行手术。手术前，以0.lmL/10g的体重（0. 25mL至0. 30mL/小鼠）使用 氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（l〇〇mg/kg的氯胺酮丨)l〇mg/kg的甲苯噻嗪）的腹膜内注射来麻 醉小鼠。如先前所述进行股动脉结扎。7, 8。简言之，以无菌方式暴露左股动脉，将其与股 神经和静脉分离，使用6. 0丝缝合线（FisherScientific,Pittsburgh,Pa)在股深动脉起 源的远端将其结扎。随后利用间断的4.0丝缝合线（FisherScientific)缝合皮肤。
[0137] 质粒。在左股动脉结扎后，立即使用具有30规针的胰岛素注射器在结扎位置远端 按照制造商的说明书（GenScriptUSAInc，Piscataway，NJ)用组成型表达的HIF-la质粒 DNA(经改良和优化的）或pVAX质粒DNA注射收肌。如下施用处理：（1)在实验组（HIF-EP) 的左收肌中施用20mL(5mg/mL)的HIF-la质粒DNA的頂注射，随后进行EP; (2)在阳性对 照组（HIF-頂）的左收肌中施用20mL(5mg/mL)的HIF-la质粒DNA的頂注射；和⑶在阴 性对照组（pVAXEP)的左收肌中施用20mL(5mg/mL)的pVAX质粒DNA的頂注射，随后进行 EP〇
[0138] 体内EP。在质粒DNA注射后，立即使用三电极阵列CELLECTRADNA递送装置 (InovioBiomedical,BlueBell,Pa)对治疗位置施用体内方波-脉冲EP。所述三电极阵列 由3个26规固体不锈钢电极以等腰三角形形式组成。具体的EP条件被恒定地设置在0. 1 安培的电流，2个脉冲，52ms/脉冲（50-100V)以及4秒的脉冲间隔。质粒注射与EP之间的 持续时间为20秒。用于质粒注射/EP的事件序列如下：（1)将一次性电极组件放置在手柄 的容器中，并按压手柄上的启动按钮；（2)使用具有30规针的胰岛素注射器施用20mL(5mg/ mL)的HIF-la质粒DNA的頂注射；（3)紧接着，将三个阵列针置于围绕注射部位的区域中； (4)随后按压手柄上的启动按钮，并且在4秒的倒计时后，脉冲被递送。随后从肌肉轻轻地 取下所述阵列。对于PVAX-EP组重复相同的顺序。
[0139] 肢体灌流测量。手术前使用激光多普勒灌注成像仪（LDPI)进行基线肢体 灌流测量，并立即重复股动脉的术后结扎。简言之，使用LDPI(MoorInstruments Inc,Wilmington,Del)在每一个时间点上进行系列灌流测量。在每一个时间点上计算灌流 比率（结扎/未结扎的肢体）和对于每一只小鼠获得的平均值。以（〇)至（1000)的范围 内的代码显示灌流信号。
[0140] 足部运动和坏死评分。为了评估后肢功能的恢复，基于活性步行运动的评分系统 由对治疗组不知情的盲观察者在每个时间点通过触摸连续进行。简言之，如下进行评分：评 分〇,无腿使用；评分1，腿的使用；评分2,积极的脚使用；评分3,完全的足的使用或脚趾的 伸展；和评分4,不受限制的运动。此外，由类似地盲目观察者对坏死的严重度进行评分以 评估每一个时间点上需要无痛致死的小鼠。简言之，如下进行评分：评分0,无坏死；评分1， 紫绀/变色；评分2,1至2个脚趾的坏死/损失；评分3 :3至5个脚趾的坏死/损失；评分 4,严重坏死（延伸至足背或更高）。无痛致死评分多3或具有肢体自离断的小鼠。
[0141] 组织收获以及坏死和血管生成的免疫组织化学。在第21天针进行组织收获和形 态学分析以进行坏死分析。进行毛细血管生长和侧支血管形成/重塑的免疫组织化学。 简言之，通过C02吸入对小鼠进行无痛致死，并用磷酸盐缓冲盐水，接着以4%多聚甲醛进 行心内灌注。对收肌进行解剖，将在4%多聚甲醛固定48小时，在使用低温恒温器切片 (10-15_的切片）之前，将其包埋在石蜡中。为了进行形态测定分析析，将切片用苏木精 和伊红染色，并将其封装在Fluoromount-G介质（SouthernBiotech,Birmingham,Ala)中， 以评估百分比组织坏死。进行免疫荧光染色。简单地说，使用抗人⑶31的小鼠单克隆抗 体（DakoCytomation,Inc,Carpentaria,Calif)进行⑶31的染色，并用德州红色焚光染 料（GeneLinkInc,Hawthorne,NY)进行复染以检测血管内皮细胞。使用抗a-SMA的小鼠 单克隆抗体（ResearchDiagnosticsInc,Flanders,NJ)，并用Alexa568 焚光染料（Life Technologies,GrandIsland,NY)进行复染以检测血管平滑肌细胞。进行微波福照以进行 抗原修复。将切片在0.3%过氧化氢中进行孵育以阻断过氧化物酶活性。使用Vectastain 试剂盒（VectorLaboratories,Burlingame,Calif)进行蛋白质封闭、与第二生物素化抗体 的孵育和阿瓦斯丁 -生物素的相互作用。在每组织载玻片量化坏死，毛细血管生长和侧支 血管形成执行上的平均5个随机选择的领域做了每组织切片200倍的放大倍数下在平均5 个随机选择的视野上进行坏死、毛细管生长和侧支血管形成的定量，并使用ImageJ软件进 行分析。
[0142] 统计分析。汇总统计表示为样本大小和平均均值土平均值的标准误差。用于分 析的计算的变量包括每一个图像的LDPI比率和每一个时间点上的每个小鼠的平均LDPI比 率。同时，评估临床足部运动、坏死评分和免疫组织化学分析结果。数据遵循具有一个重复 因子（日）和一个非重复因子（处理）的双因素混合效应实验设计与和。在认识到随着术后 日子的推进存在处理的效应修正的情况下，每一天通过进行适合于一元固定效果模型的方 差分析来评估处理对连续反应变量的简单效果。当在处理组之间发现统计学上显著的差异 时，每一天通过将Bonferonni调整应用于多重比较来评估处理组的成对比较之间的差异。 当用于方差分析的假设似乎是不合理时，进行Wilcoxon秩和非参数检验。肢体坏死得分对 处理组的列联表采用皮尔逊未修正卡方检验来分析，以评估处理组间的肢体坏死评分差异 的分布。对于假设的所有测试，为了宣告统计显著性，将I类误差（a)固定在.05。所有分 析均米用STATA(Intercooled)，11 版统计软件（STATACorp，LP,CollegeStation,Tex)来 进行。
[0143] 实施例2
[0144] HIF-1aDNA的体内EP和肢体血流恢复
[0145] 检查接受HIF-1aDNA质粒的体内-EP介导的递送和HIF-1aDNA质粒的頂递 送的小鼠的缺血组织中的肢体血流恢复。
[0146] 图3A显示在股动脉结扎，接着注射质粒（缺氧诱导因子-EP[HIF-EP]和空骨 架质粒DNA-EP[pVAX-EP])的电穿孔（EP)或单独的注射质粒（低氧诱导因子肌肉注射 [HIF-頂])后，后肢血流的时间过程。在图3A中，在指定的天上记录代表性激光多普勒灌注 成像仪（LDPI)，灌流信号以代码显示，即差的灌流为（0)，良好灌流为（1000)。
[0147] 在股动脉结扎后第0天，左肢（结扎的，白色箭头）中的血流的急性减少很明显 (图3A)。因此，这些LDPI测量显示相较于第0天的未结扎肢体，结扎的肢体中的急剧减少 的血流（图3A)。相较于另外两个组（HIF-頂和pVAX-EP)(图3A)，在利用HIF-EP处理的 组中观察到持续的血流恢复。
[0148] 此外，连续LDPI测量显示结扎的肢体中的稳定血流恢复（但以可变的速率和一致 性进行）。在积极处理组（HIF-EP)和阳性对照组（HIF頂）中，血流恢复在第3天至第7天 非常明显。恢复在第14天在两个组中减少，但其在第21天增加。总的来说，HIF-EP小鼠 相较于HIF-頂小鼠从第3天至第14天具有相似的血流恢复。
[0149] 图3B显示，利用缺氧诱导因子1a(HIF-1a)DNA，随后利用EP的处理改善了小鼠 的股动脉结扎后肢体灌流恢复。使用LDPI从术前一天至术后第21天连续进行肢体灌流恢 复。计算每一个时间点上每一只小鼠和每一个处理组的平均灌流比率（结扎/未结扎的肢 体）。为了评估直至第21天的统计显著性（P〈. 05)，将数据均表达为平均值土平均值的标 准误差（误差条贯穿每一个动物）3HIF-EP相对pVAX-EP;P〈. 001 頂相对pVAX-EP; P〈. 01 ;和aHIF-EP相对HIF-頂；P〈. 05。在第21天检测到HIF-EP与HIF-頂之间的肢体血 流的显著改善（1. 03±0. 15相对0. 78±0. 064 ;图3B)。血流恢复在pVAX-EP组中以慢得多 的速率维持。
[0150] 实施例3
[0151] 肢体功能恢复和HIF-1aDNA的体内EP
[0152] 在接受HIF-1aDNA质粒的体内-EP介导的递送和HIF-1aDNA质粒的頂递送 的小鼠的缺血组织中检测肢体功能恢复。
[0153] 图4A、图4B、图4C和图4D分别显示股动脉结扎后并分别用HIF-EP、HIF-頂、 pVAX-EP处理的和正常假处理的肢体的严重肢体缺血的恢复。图3C显示临床足部运动在利 用HIF-1aDNA，随后EP处理的小鼠中在股动脉结扎后得到改善。测定足部运动，并将其评 为0-4分作为功能读出参数，以评估缺血诱导后的功能缺损。积极的足部运动在pVAX-EP 小鼠中显著受损，但在第21天在HIF-EP小鼠中得到显著改善。对于统计显著性（P〈. 05)， 数据为平均值土平均值的标准误差（误差条贯穿每一只小鼠）。*HIF-EP相对pVAX-EP; P〈. 001 頂相对pVAX-EP;P〈. 01 ;和aHIF-EP相对HIF-頂；P〈. 05。
[0154] 这些数据显示，在第0天对于所有3个处理组，存在急剧的肢体功受损。HIF-EP和 HIF-頂小鼠从第3天至第14天显示相似的肢体功能的改善