0064] 小鼠HIF-la可以是核酸序列SEQIDN0:1，其编码SEQIDN0:2(图7A和图7B)。 SEQIDN0:2是小鼠HIF-1a的氨基酸序列，其中两个脯氨酸残基已被丙氨酸被替代。这种 替代可防止或减少HIF-la的羟化，从而防止或减少HIF-la被pVHL识别。SEQIDN0:2 是通过肽键连接于IgE前导序列的小鼠HIF-1a的氨基酸序列。
[0065] 在一些实施方案中，小鼠HIF-la可以是在SEQIDN0:1中所示的核酸序列的 完整长度上具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的核酸序列。在其它 实施方案中，小鼠HIF-la可以是编码在SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列的完整长度上 具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠 HIF-la可以是在SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的氨基酸序列。
[0066] 在一些实施方案中，小鼠HIF-la可以是核酸序列SEQIDN0:3,其编码SEQID 勵:4(图8六和88)。5￡〇10勵:4是小鼠11正-1€ [的氨基酸序列，其中两个脯氨酸残基已 被丙氨酸替代，如图8B中显示的。该替代可防止或减少HIF-1a的羟化，从而防止或减少 ^1正-1<1被1^1识别。3￡010勵:4是未通过肽键连接于18￡前导序列的小鼠11正-1€ [的 氨基酸序列。
[0067] 在一些实施方案中，小鼠HIF-la可以是在SEQIDN0:3中所示的核酸序列的 完整长度上具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的核酸序列。在其它 实施方案中，小鼠HIF-la可以是编码在SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列的完整长度上 具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠 HIF-la可以是在SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的氨基酸序列。
[0068] 人HIF-1a可以是核酸序列SEQIDN0:5,其编码SEQIDN0:6(图9A和图9B)。 SEQIDN0:6是人HIF-la的氨基酸序列，其中两个脯氨酸已被丙氨酸替代，如图9B中显示 的。该替代可防止或减少HIF-la的羟化，从而防止或减少HIF-la被pVHL识别。
[0069] 在一些实施方案中，人HIF-la可以是在SEQIDN0:5中所示的核酸序列的完整 长度上具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的核酸序列。在其它实施方 案中，人HIF-la可以是编码在SEQIDN0:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少 约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的氨基酸序列的核酸序列。人HIF-la可以 是在SEQIDN0:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99 %或100 %的同一性的氨基酸序列。
[0070] 一些实施方案涉及SEQIDN0:1、SEQIDN0:3和SEQIDN0:5的片段。片段可包 含SEQIDNO: 1、SEQIDN0:3 和 / 或SEQIDN0:5 的至少 60%、至少 65%、至少 70%、至 少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至 少99%。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列例如免疫球蛋白的前导序列诸如IgE 前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。
[0071] 可提供具有与SEQIDN0:1、SEQIDN0:3和/或SEQIDN0:5的片段具有同一 性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含与SEQIDNO: 1、SEQIDN0:3和/或SEQ IDNO: 5具有95 %或更高同一性的核酸的至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。一些 实施方案涉及与本文中的HIF-a核酸序列的片段具有96%或更高同一性的片段。一些实 施方案涉及与本文中的HIF-a核酸序列的片段具有97%或更高同一性的片段。一些实施 方案涉及与本文中的HIF-a核酸序列的片段具有98%或更高同一性的原性片段。一些实 施方案涉及与本文中的HIF-a核酸序列的片段具有99%或更高同一性的片段。在一些实 施方案中，片段可包含编码前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列的序列。 在一些实施方案中，片段可不含编码前导序列的编码序列。
[0072]可提供SEQIDN0:2、SEQIDN0:4 和SEQIDN0:6 的片段。片段可包含SEQID N0:2、SEQIDN0:4 和 / 或SEQIDN0:6 的至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。在 一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在其 它实施方案中，片段可不含前导序列。
[0073] 可提供具有与SEQIDN0:2、SEQIDN0:4和/或SEQIDN0:6的片段具有同一性 的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含与SEQIDN0:2,SEQIDN0:4和/或SEQ IDNO: 6具有95 %或更大的同一性的蛋白质的至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。 一些实施方案涉及与本文中的HIF-1a蛋白质序列的片段具有96%或更大的同一性的片 段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-1a蛋白序列的片段具有97%或更大的同一性的片 段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-1a蛋白序列的片段具有98%或更大的同一性的片 段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-1a蛋白序列的片段具有99%或更大的同一性的片 段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如免疫球蛋白的前导序列，诸如IgE前导序 列。在其它实施方案中，片段可以不含前导序列。
[0074] b?载体
[0075] 所述治疗剂可包含一种或多种包含编码所述药剂的异源核酸的载体。所述一种或 多种载体可以能够表达药剂。所述载体可包含编码所述药剂的异源核酸。所述载体可具有 含有复制起始点的核酸序列。所述载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染 色体。所述载体可以是自主复制的染色体外载体或整合进宿主基因组的载体。
[0076] 所述一个或多个载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞的 质粒。一旦表达载体在细胞内，由所述基因编码的蛋白质由细胞转录和翻译机器核糖体复 合物产生。所述质粒通常被工程化以含有充当增强子和启动子区域调控序列并导致表达载 体上携带的基因的高效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，从而表达蛋白质。
[0077] 所述载体可具有表达信号诸如强启动子、强终止密码子、启动子与克隆的基因之 间的距离的调整以及转录终止序列和PTIS(可携带的翻译起始序列）的插入。
[0078] (1)表达载体
[0079] 所述载体可以是环状质粒或线性核酸。所述环状质粒和线性核酸能够在适当的主 题细胞中指导特定核苷酸序列的表达。所述载体可具有有效地连接于编码药剂的核苷酸序 列的启动子，所述编码抗原的核苷酸序列可有效地连接于终止信号。所述载体还可含有核 苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其 组件的至少一个对于其至少一个其它组件是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组 成型启动子或诱导型启动子的控制之下，仅当将宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时 所述诱导型启动子才启动转录。在多细胞生物体的情况下，所述启动子还可于对特定的组 织或器官或发育阶段是特异性的。
[0080] (2)环状和线性载体
[0081] 所述载体可以是环状质粒，其可通过整合进细胞基因组转化靶细胞或存在于染色 体外（例如，具有复制起始点的自主复制质粒）。
[0082] 所述载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA或佐剂并 使得细胞能够将所述序列翻译成被免疫系统或佐剂识别的抗原的任何其它表达载体。
[0083] 本文中还提供了能够经由电穿孔被有效地递送至受试者，并且表达期望的药剂的 线性核酸或线性表达盒（"LEC"）。所述LEC可以是不存在任何磷酸主链的任何线性DNA。 所述DNA可编码药剂。所述LEC可含有启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信 号。所述药剂的表达可受启动子控制。所述LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸 主链。所述LEC可以不含与期望的药剂基因表达无关的其它核酸序列。
[0084] 所述LEC可来源于任何能够被线性化的质粒。所述质粒可以能够表达药剂。所述 质粒可以是pNP(PuertoRico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。所述质粒可以是WLV009、 pVAX、pcDNA3. 0或provax，或任何其它能够表达编码所述药剂的DNA并使得细胞能够将所 述序列翻译成药剂的表达载体。
[0085] 所述LEC可以是pcrM2。所述LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别来源于 pNP(PuertoRico/34)和pM2(NewCaledonia/99)〇
[0086] (3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号
[0087] 所述载体可具有启动子。所述启动子可以是能够驱动基因表达和调控分离的核酸 表达的任何启动子。此类启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶的转录所需的顺式作用序列 元件，所述RNA聚合酶转录本文中描述的药剂序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选 择取决于特定应用。可将启动子在载体中置于离转录起始位点与其在天然背景中离转录起 始位点的距离大约相同的距离。然而，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变 化。
[0088] 所述启动子可有效地连接于编码所述药剂和转录物的高效多腺苷酸化所需的信 号、核糖体结合位点和翻译终止的核酸序列。所述启动子可以是CMV启动子、SV40早期启 动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、 多角体蛋白启动子或显示对于在真核细胞中的表达是有效的另一种启动子。
[0089] 所述载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。所述载体可 含有在结构基因下游的转录终止区以提供高效终止。所述终止区可获自与启动子序列相同 的基因或可获自不同的基因。
[0090] c.赋形剂和治疗剂的其它组分
[0091] 治疗剂还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分 子诸如媒介物、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活 性剂，诸如免疫刺激复合物（ISC0MS)、弗氏不完全佐剂（Freundsincompleteadjuvant)， LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、 脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进 剂。
[0092] 转染促进剂是多聚阴离子、多聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐（LGS)或脂质。转染 促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸可以以低于6mg/ml的浓度存在于治疗剂 中。转染促进剂还可包括表面活性剂诸如免疫刺激复合物（ISC0MS)、弗氏不完全佐剂，LPS 类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，并且还可将透 明质酸与基因构建体结合施用。所述DNA质粒治疗剂还可包括转染促进剂，诸如脂质、脂质 体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物（参见例如 W09324640)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进 剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐（LGS)或脂质。治疗剂中的转 染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于lmg/ml、低于0. 750mg/ml、低于0. 500mg/ml、低 于 0. 250mg/ml、低于 0. 100mg