。在第21天看到足部运动的统 计上显著的差异（3. 5±0. 58相对2. 4±1. 14 ;P〈. 05)，其中HIF-EP小鼠的足部运动评分显 著高于HIF-頂小鼠。pVAX-EP小鼠一直至第21天都显示最差的肢体功能恢复（图3C)。
[0155] 实施例4
[0156]HIF-1aDNA的体内EP和肢体坏死
[0157] 在接受HIF-1aDNA质粒的体内-EP介导的递送和HIF-1aDNA质粒的頂递送 的小鼠的缺血组织中检测肢体坏死。
[0158]图3D显示，在21天的过程中，在利用HIF-1a，接着EP处理的小鼠中临床肢体坏 死评分得到改善。将〇至4的临床评分系统用于测定股动脉结扎后肢体坏死率，具有多3 的评分的小鼠被认为具有严重的坏死，并将其无痛致死。当与HIF-EP和HIF-IM小鼠相比 较时，更多的pVAX-EP小鼠具有>3的肢体坏死，从而要求无痛致死。数据汇总为39只小鼠 直至21天的平均值土平均值的标准误差（误差条），（HIF-EP，n= 13 ;HIF-頂，n= 14 ; pVAX-EP，n= 12)，在P〈. 05时，统计上显著。
[0159] 这些数据表明，肢体功能恢复与坏死程度和/或因严重坏死或自离断而对无痛致 死的需要相关。HIF-EP小鼠显示如相较于HIF-IM小鼠（77% 612%相对43% 614%;P〈. 05) 以及相较于pVAX-EP(77% 612%相对17% 611 % ;P〈0. 01;图3D)的最低肢体坏死率（肢体 坏死评分〈3)和需要无痛致死的自离断。
[0160] 实施例5
[0161] 组织坏死、毛细血管密度、侧支血管和血管面积
[0162] 在接受HIF-1aDNA质粒的体内-EP介导的递送和HIF-1aDNA质粒的頂递送 的小鼠的缺血组织中检测组织坏死、毛细血管密度、侧支血管和血管面积。
[0163] 在第21天用苏木精和伊红以及免疫荧光染料针对坏死染色的收肌组织切片、 ⑶31阳性内皮细胞和a-SMA阳性的血管的代表性显微照片分别示于图5A和5C。图5A显 示在第21天利用苏木精和伊红（H&E)染色的收肌组织切片的代表性显微照片（原始放大 倍数，x200)，显示了相对于阳性对照组（低氧诱导因子肌肉注射[HIF-頂])在阴性对照组 (空骨架质粒DNA-电穿孔[pVAX-EP])中在结扎的肌肉中存在更大的坏死组织面积。在积 极处理组（HIF-EP)中存在更少的坏死炎症浸润细胞。
[0164] 图5C显示定量毛细血管密度的第21天针对⑶31+毛细血管染色的收肌组织的 代表性显微照片（原放大倍数，X200)。⑶31+毛细血管的数量相较于接受阴性对照治疗 (pVAX-EP)和阳性对照（HIF-頂）的那些结扎的肢体肌肉在接受HIF-EP处理的结扎的肢体 肌肉中更多。
[0165] 图5B显示汇总定量数据，该数据揭示相较于阳性对照组（HIF-頂）和阴性对照组 (pVAX-EP)在积极处理组（HIF-EP)中存在显著更少的百分比坏死组织面积。数据表示为平 均值土平均值的标准误差（误差条），将统计显著性设置在P〈. 05。*P〈. 001 (HIF-EP相对 HIF-頂）01 (HIF-IM相对pVAX-EP);和乍〈.0001 (HIF-EP相对pVAX-EP)。HIF-EP小鼠 相较于对照小鼠在第21天具有更少的收肌坏死（HIF-EP相对HIF-頂，20. 7% ±1. 75%相 对 44% ±3.73%，P〈. 001 ;HIF-EP相对pVAX-EP，20. 7% ±1.75%相对 60. 05% ±2. 17%; P〈. 0001 ;以及HIF-IM相对pVAX-EP，44% ±3. 73%相对 60. 05% ±2. 17%，P〈. 01 ;图 5B)。
[0166] 图?显示表明⑶31+毛细管在积极处理组（HIF-EP)中相较于阴性对照组 (pVAX-EP)和阳性对照组（HIF-頂）显著更高的定量数据汇总。数据表示为平均值土平均值 的标准误差，将统计显著性设置在P〈. 05。*P〈. 001 (HIF-EP相对HIF-頂）；#P〈. 001 (HIF-頂 相对pVAX-EP);和 #P〈. 0001 (HIF-EP相对pVAX-EP)。相较于对照组（HIF-EP相对HIF-頂， 96. 83±5. 72 根血管 / 高倍视野[hpf]相对 62. 87±2. 0 根血管/hpf;P〈. 001 ;HIF-EP相 对VAX-EP，96. 83±5. 72 根血管/hpf相对 39. 37±2. 76 根血管/hpf;P〈. 0001 ;和HIF-IM 相对pVAX/EP，62. 87±2. 0 根血管/hpf相对 39. 37±2. 76 根血管/hpf;P〈. 001 ;图叨），在 HIF-EP小鼠的收肌中毛细血管密度（⑶31+内皮细胞）得以增加。
[0167] 图6A描绘定量数据汇总，该数据显示平滑肌肌动蛋白（SMA) +血管（血管重塑/ 络脉）在积极处理组（缺氧诱导因子-电穿孔[HIF-EP])中相较于阴性对照组（空骨架质 粒DNA-EP[pVAX-EP])和阳性对照组（低氧诱导因子-肌内注射[HIF-頂])中显著更高。 数据表示为平均值土平均值的标准误差，将统计显著性设置在P〈. 05。*P〈. 0001 (HIF-EP 相对HIF-頂）0001 (HIF-頂相对pVAX-EP);和 #P〈. 001 (HIF-EP相对pVAX-EP)。侦J 支血管数量/血管重塑在HIF-EP小鼠中相较于对照组也获得增加（HIF-EP相对HIF-頂， 76. 33±L94 根血管/hpf相对 37. 5±L56 根血管/hpf;P〈. 0001 ;HIF-EP相对pVAXEP， 76. 33 ±1. 94 根血管/hpf相对 18. 5 ±1. 34 根血管/hpf;P〈. 00001 ;和HIF-IM相对 pVAX-EP，37. 5 ±1. 56 根血管/hpf相对 18. 5 ±1. 34 根血管/hpf;P〈. 001 ;图 6A)。
[0168] 图6B描绘显示SMA+血管在积极处理组（HIF-EP)中相较于阴性对照组（pVAX-EP) 和阳性对照组（HIF-頂）在总面积（ym2)上显著更大的定量数据汇总。将统计显著 性设置在P〈. 05。*P〈. 001 (HIF-EP相对HIF-頂）05 (HIF-頂相对pVAX-EP);和 #P〈. 0001 (HIF-EP相对pVAX-EP)。总血管面积在HIF-EP中相对于对照更大（HIF-EP相 对HIF-IM，15,521.67±1298. 16ym2相对 7788.87±392.04ym2;P〈.001 ;HIF-EP相对 pVAX-EP，15, 521. 67±1298. 16ym2相对 4640. 25±614. 01ym2;P〈. 0001 ;和HIF-IM相对 pVAX-EP，7788. 87±392. 04ym2相对 4640. 25±614. 01ym2;P〈. 05 ;图 6B)。
[0169] 实施例6
[0170] 实施例2-5的结果的概述
[0171] 概括上述调查，HIF-1a质粒DNA的体内EP-介导的递送在肢体缺血的小鼠模型 中改善了新生血管形成。具体地，所述调查表明HIF-1aDNA的体内EP显著改善肢体灌 流（HIF-EP:1. 03±0. 15 相对HIF-頂：0? 78±0. 064 ;P〈. 05,相对pVAX-EP:0? 41±0. 019 ; P〈. 001)、肢体功能恢复（HIF-EP:3. 5±0. 58 相对HIF-頂，2. 4±L14 ;P〈. 05,相对 pVAX-EP:2.4±l. 14;P〈.001)和第 21 天的肢体自离断（HIF-EP:77% ±12%相对HIF-IM: 43% ±14% ;P〈.05,相对pVAX-EP:17% ±11% ;P〈.01)。
[0172] 所述调查还表明收肌坏死得以减少（HIF-EP:20. 7 % ± 1. 75 %相对HIF-頂： 44 % ±3. 73 ;P〈. 001，相对pVAX-EP:60. 05 % ±2. 17 % ;P〈. 0001)，毛细血管密度得以 增加（HIF-EP:96. 83±5. 72根血管/高倍视野[hpf]相对HIF-頂：62. 87±2. 0根血 管/hpf;P〈. 001，相对pVAX-EP:39. 37±2. 76 根血管/hpf;P〈. 0001)，侧支血管形成 得以增加（HI-EP:76. 33±L94 根血管/hpf相对HIF-IM:37. 5±L56 根血管/hpf; P〈. 0001，相对pVAX-EP: 18. 5±1. 34 根血管/hpf;P〈. 00001)，以及血管更大（HIF-EP: 15,521.67±1298.16 ^1112相对11正-頂：7788.87±392.04 41112;?〈.001相对？￥八父-￡?: 4640. 25±614. 01ym2;P〈. 0001)。
[0173] 因此，这些数据表明直至研究的终点（即第21天）接受HIF-1a质粒DNA的体内 EP-介导的递送的小鼠中的肢体灌流恢复、生理肢体功能的统计上显著的改善，以及毛细血 管水平上的改善的血管供应、血管重塑和组织形态学特性。接受HIF-1a质粒DNA的頂递 送的小鼠没有保持这些收益直至研究的终点（即第21天）。这些数据还表明，接受HIF-1a 质粒DNA的体内EP-介导的递送的小鼠具有显著更低的肢体坏死和自离断率。
[0174] 应理解，前文详述和所附实施例仅是例举性的并且无意被视为对本发明的范围的 限制，所述范围仅由所附权利要求和它们的等同物确定。
[0175] 对公开的实施方案的各种改变和改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。可 在不背离其精神和范围的情况下进行这样的改变和改进，包括但不限于与本发明的化学结 构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些改变和改进。
【主权项】
1. 一种包含缺氧诱导因子-I a (HIF-1 a )的治疗剂。2. 根据权利要求1所述的治疗剂，其中HIF-I a由如SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序 列、如SEQ ID N0:3中所示的核苷酸序列、如SEQ ID N0:5中所示的核苷酸序列、与SEQ ID NO: 1具有95%或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID N0:3具有95%或更大的同一性的 核苷酸序列或与SEQ ID N0:5具有95%或更大的同一性的核苷酸序列编码。3. 根据权利要求2所述的治疗剂，其中HIF-I a由如SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序 列编码。4. 根据权利要求2所述的治疗剂，其还包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、如 SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列、如SEQ ID N0:6中所示的氨基酸序列、与SEQ ID N0:2 具有95%或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO: 4具有95%或更大的同一性的氨基 酸序列或与SEQ ID N0:6具有95%或更大的同一性的氨基酸序列。5. 根据权利要求3所述的治疗剂，其还包含如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。6. 根据权利要求1所述的治疗剂，其中将HIF-I a突变，以便HIF-I a在细胞中不能被 羟化。7. 根据权利要求6所述的治疗剂，其中HIF-I a的脯氨酸残基在细胞中不能被羟化。8. 根据权利要求1所述的治疗剂，其还包含药学上可接受的赋形剂。9. 一种在有此需要的受试者中治疗缺氧或局部缺血的方法，所述方法包括向所述受试 者施用根据权利要求1所述的疫苗。10. 根据权利要求9所述的方法，其中施用所述疫苗包括电穿孔。11. 根据权利要求9所述的方法，其中施用所述疫苗包括肌内施用和皮内施用的至少 一种。12. 根据权利要求9所述的方法，其中所述缺氧或局部缺血与严重肢体缺血、外周动脉 疾病、伤口愈合、血管疾病、循环系统疾病、冠状动脉病、心血管疾病或糖尿病相关联。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述缺氧或局部缺血与严重肢体缺血相关联。14. 根据权利要求9所述的方法，其中相较于未被施予所述疫苗的受试者，毛细血管密 度、侧支血管形成或血管尺寸的至少一个在被施予所述疫苗的受试者中得以增加。15. 根据权利要求9所述的方法，其中相较于未被施予所述疫苗的受试者，组织灌流在 被施予所述疫苗的受试者中得以增加。16. 根据权利要求9所述的方法，其中相较于未被施予所述疫苗的受试者，组织坏死在 被施予所述疫苗的受试者中得以减少。17. -种核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:5和与SEQ ID NO:5具 有95%或更大的同一性的核苷酸序列。18. 根据权利要求17所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列是质粒。19. 一种氨基酸分子，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID N0:6和与SEQ ID N0:6 具有95 %或更大的同一性的氨基酸序列。
【专利摘要】本文中公开了包含缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的治疗剂。本文中还公开了治疗有此需要的受试者的缺氧或局部缺血的方法。所述方法可包括向有此需要的受试者施用疫苗。在哺乳动物中，胚胎发育和成人动态平衡的维持依赖于向哺乳动物的组织和细胞提供氧气(02)和其他营养物质的功能性血管系统的建立。
【IPC分类】A61K38/16
【公开号】CN105050616
【申请号】CN201480012490
【发明人】大卫·韦纳, 卡鲁皮亚·穆苏马尼, 埃米尔·莫勒, 杰弗里·乌马
【申请人】宾夕法尼亚大学理事会
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2898122A1, WO2014144731A2, WO2014144731A3