用于预防或治疗眼科病症的方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2010年08月23日、申请号为"201080048139. 3"、发明名称为 "用于预防或治疗眼科病症的方法和组合物"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的夺叉引用
[0003] 本申请要求2009年8月24日提交的第61/236440号美国临时申请、2009年8月 28日提交的第61/237745号美国临时申请和2010年5月26号提交的第61/348470号美国 临时申请的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0004] 本发明总体涉及预防或治疗眼科疾病或眼科病症的组合物和方法。具体地，本发 明涉及给药有效量的芳香族阳离子肽来预防或治疗哺乳动物对象中的眼科疾病或眼科病 症，例如糖尿病视网膜病变、白内障、色素性视网膜炎、青光眼、脉络膜新生血管和氧诱导视 网膜病变。
【背景技术】
[0005] 提供以下描述来便于读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献都不能被认为 是本发明的现有技术。
[0006] 视神经和视网膜的疾病和退化性病症是世界上失明的主要原因。视网膜的显著退 化病症是与年龄相关的黄斑变性（ARMD)。ARMD是美国超过50岁的人群中失明的最常见原 因，其患病率随年龄增长。ARMD分为湿性（新生血管性）或干性（非新生血管性）；该疾病 的干性形式更为常见。黄斑变性发生于中央视网膜已变形并变薄（通常与年龄有关）时， 而且其特征为眼内炎症和血管新生（仅湿性ARDM)和/或眼内感染。随后产生自由基，导 致氧化性组织损伤、局部炎症和产生生长因子（比如VEGF和FGF)以及炎症介质，这引起和 湿性形式的ARDM -样的不恰当的新生血管。
[0007] 视网膜病变是I型糖尿病中的失明的主要原因，而且也常见于II型糖尿病。视网 膜病变的程度取决于糖尿病的持续时间，并且通常在患上糖尿病十年或更长时间后发生。 糖尿病性视网膜病变可以进行如下分类：非增生性的，其中这类视网膜病变的特征是毛细 血管通透性增强、出现水肿和渗出物；或者增生性的，其中这类视网膜病变的特征是新生血 管从视网膜扩展至玻璃体、结疤、纤维组织沉积以及可能的视网膜脱离。糖尿病性视网膜病 变被认为是由高血糖引起的糖基化蛋白的发展导致的。一些其他较不常见的视网膜病变包 括脉络膜新生血管膜（CNVM)、囊样黄斑水肿（CME)、视网膜前膜（EMR)和黄斑裂孔。
[0008] 青光眼是通过损伤视神经而导致视力减退的眼科疾病的集合。因眼睑分泌物不足 而引起的眼压升高（I0P)是青光眼的主要原因。青光眼通常随着眼睛老化而形成，或者其 可能因眼外伤、炎症、肿瘤或在白内障或糖尿病的晚期中发生。其也可由用类固醇治疗导致 的I0P升高而引起。已证实，通过减少玻璃液形成或通过促进眼排液进行的药物治疗在青 光眼降低I0P方面是有效的。这样的制剂通常是血管舒张药，并因此作用于交感神经系统 且包括肾上腺髓素拮抗物。
【发明内容】
[0009] 本发明的技术总体上涉及通过将治疗有效量的芳香族阳离子肽给药至需要治疗 或预防的对象来治疗或预防哺乳动物中的眼科疾病或眼科病症。
[0010] 在一个方面中，本发明提供了一种用于治疗或预防需要治疗或预防的哺乳动物对 象中的眼科病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的D-Arg-2' 6' -Dmt-Lys-Phe-NH2S Phe-D-Arg-Phe-Lys_NH2肽给药至所述对象。在一个实施方式中，所述眼科病症选自糖尿病 性视网膜病变、白内障、色素性视网膜炎、青光眼、黄斑变性、脉络膜新生血管、视网膜变性 和氧诱导视网膜病变。
[0011] 在一个方面中，本发明提供了一种用于治疗或预防哺乳动物对象中的眼科病症的 方法，所述方法包括将治疗有效量的所述芳香族阳离子肽给药至所述哺乳动物对象。在一 些实施方式中，所述芳香族阳离子肽是具有以下特点的肽：
[0012] 至少一个净正电荷；
[0013] 最少四个氨基酸；
[0014] 最多约20个氨基酸；
[0015] 净正电荷的最小数目（pj和氨基酸残基的总数目（r)之间的关系为：3 Pni是小于 或等于r+1的最大数；以及芳香族基团的最小数目（a)和净正电荷的总数目（pt)之间的关 系为：除了当a为1时，p t也可为1之外，2a是小于或等于p t+l的最大数。在特定的实施 方式中，哺乳动物对象是人类。
[0016]在一个实施方式中，2pm是小于或等于r+1的最大数，且可以等于pt。所述芳香族 阳离子肽可以是具有最少两个正电荷或最少三个正电荷的可溶于水的肽。
[0017] 在一个实施方式中，所述肽包括一种或多种非自然存在的氨基酸，例如一种或多 种D型氨基酸（右旋氨基酸）。在一些实施方式中，氨基酸的在C末端的C末端羧基被酰胺 化。在某些实施方式中，所述肽最少具有4个氨基酸。肽可以最多有约6个、最多约9个或 者最多约12个氨基酸。
[0018] 在一个实施方式中，所述肽可以具有式Phe-D-Arg-Phe-Lys_NH 2 (SS-20) 或2'，6' -Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在特定的实施方式中，芳香族阳离子肽具有式 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(也被称为 SS-3UMTP-131 或 Bendavia?) 〇
[0019] 在一个实施方式中，所述肽由如下式I所定义：
[0020]
[0021] 其中R1和R 2各独立地选自：
[0022] ⑴氢；
[0023] (ii)线性或支链的(；-(：6的烷基；
[0024] (iii)
[0025]
其中 m =1-3;
[0026] (iv)
[0027]
[0028] (v)
[0029]
[0030] R3、R4、R5、R6、R 7、R8、R9、R10、R11 和 R 12各独立地选自：
[0031] ⑴氢；
[0032] (ii)线性或支链的（；-(：6的烷基；
[0033] (iii)C「C6 的烷氧基；
[0034] (iv)氨基；
[0035] (v)CfC4的烷基氨基；
[0036] (vi)CfC^二烷基氨基；
[0037] (vii)硝基；
[0038] (viii)羟基；
[0039] (ix)卤素，其中"卤素"包括氯、氟、溴和碘；以及
[0040] n为1到5的整数。
[0041]在特定的实施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和 R12都为氢，且 n为 4。在另一实施方式中，匕匕^匕心匕匕匕矿和^都为氢"來^是甲基；!?11^ 羟基；且n为4。
[0042] 在一个实施方式中，肽由如下式II所定义：
[0043]
[0044] 其中，R1和R 2各独立地选自：
[0045]⑴氢；
[0046] (ii)线性或支链的(；-(：6的烷基；
[0047] (iii)
[0048]
其中 m= 1-3 ;
[0049] (iv)
[0050]
[0051] (v)
[0052]
[0053] R3和R4各独立地选自：
[0054]⑴氢；
[0055] (ii)线性或支链的CfC6的烷基；
[0056] (iii)C「C6 的烷氧基；
[0057] (iv)氨基；
[0058] (v)C「C4的烷基氨基；
[0059] (vDCfC,二烷基氨基；
[0060] (vii)硝基；
[0061] (viii)羟基；
[0062] (ix)卤素，其中"卤素"包括氯、氟、溴和碘；
[0063] R5、R6、R7、R8和R 9各独立地选自：
[0064] ⑴氢；
[0065] (ii)线性或支链的CfC6的烷基；
[0066] (iii)C「C6 的烷氧基；
[0067] (iv)氨基；
[0068] (v)CfC4的烷基氨基；
[0069] (vDCfC,二烷基氨基；
[0070] (vii)硝基；
[0071] (viii)羟基；
[0072] (ix)卤素，其中"卤素"包括氯、氟、溴和碘；以及
[0073] n为1到5的整数。
[0074] 可以以各种方式将芳香族阳离子肽给药。在一些实施方式中，肽可以眼内给药、口 服给药、局部给药、鼻内给药、静脉内给药、皮下给药或经皮肤（例如离子电渗疗法）给药。
[0075] 在一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的 肽 D-Arg-2' 6' -Dmt-Lys-Phe_NH2S Phe-D-Arg-Phe-Lys_NH2，用于局部给药、离子电渗疗 法给药或眼内给药。
[0076] 在一个方面中，本发明提供了一种包括治疗有效量的肽 D-Arg-2' 6' -Dmt-Lys-Phe_NH2S Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH 2的眼科制剂。在一个实施方式 中，所述制剂可以溶解在眼睛的角膜、房水和晶状体中。在一个实施方式中，所述制剂还包 括防腐剂。在一个实施方式中，所述防腐剂以小于1%的浓度存在。
[0077] 在一个实施方式中，所述制剂还包括活性剂，该活性剂选自抗氧化剂、金属 络合物、消炎药、抗生素和抗组胺剂。在一个实施方式中，所述抗氧化剂是维生素A、 维生素C、维生素E、番茄红素、硒、a-硫辛酸、辅酶Q、谷胱甘肽或类胡萝卜素。在 一个实施方式中，所述制剂还包括活性剂，该活性剂选自乙氧喹环啶（aceclidine)、 乙酰唑胺（acetazolamide)、阿奈可他（anecortave)、阿可乐定（apraclonidine)、 阿托品（atropine)、法可林（azapentacene)、氮卓斯汀（azelastine)、枯草杆菌抗 生素（bacitracin)、苯咲洛尔（befunolol)、倍他米松（betamethasone)、倍他洛 尔（betaxolol)、比马前列素（bimatoprost)、溴莫尼定（brimonidine)、布林佐胺 (brinzolamide)、碳醜胆喊（carbachol)、卡替洛尔（carteolol)、塞来昔布（celecoxib)、 氯霉素（chloramphenicol)、氯四环素（chlortetracycline)、环丙沙星（ciprofloxacin)、 色甘酸盐（cromoglycate)、可玛林（cromolyn)、环喷托酯（cyclopentolate)、环抱 菌素（cyclosporin)、达哌挫（dapiprazole)、地美溴铵（demecarium)、地塞米松 (dexamethasone)、双氯芬酸（diclofenac)、双氯非那胺（dichlorphenamide)、肾上 腺素异戊酯（dipivefrin)、杜塞酰胺（dorzolamide)、乙膦硫胆碱（echothiophate)、 依美斯汀（emedastine)、依匹斯汀（epinastine)、肾上腺素（spinephrine)、红霉 素（erythromycin)、依索挫胺（ethoxzolamide)、尤卡托品（eucatropine)、氟氢可 的松（fludrocortisone)、氣甲龙（fluorometholone)、氣比洛芬（flurbiprofen)、 福米韦生（fomivirsen)、新霉素B(framycetin)、更昔洛韦（ganciclovir)、加替沙 星（gatifloxacin)、庆大霉素（gentamycin)、后马托品（homatropine)、氢化可的松 (hydrocortisone)、5_ 鹏脱氧尿苷（idoxuridine)、節甲新（indomethacin)、异氣磷 (isoflurophate)、酮略酸（ketorolac)、酮替芬（ketotifen)、拉坦前列素（latanoprost)、 左倍他洛尔（levobetaxolol)、左布诺洛尔（levobunolol)、左卡巴斯汀（levocabastine)、 左氧氟沙星（levofloxacin)、洛度沙胺（lodoxamide)、氯替泼诺（lotepridnol)、 甲轻松（medrysone)、醋甲挫胺（methazolamide)、美替洛尔（metipranolol)、莫西 沙星（moxifloxacin)、萘甲挫林（naphazoline)、游霉素（natamycin)、奈多罗米 (nedocromil)、亲jf 霉素（neomycin)、诺氟沙星（norfloxacin)、氧氟沙星（ofloxacin)、 奥洛他定（olopatadine)、轻甲挫卩林（oxymetazoline)、吡喃司特（pemirolast)、哌加他 尼（pegaptanib)、苯肾上腺素（phenylephrine)、毒扁豆碱（physostigmine)、匹鲁卡品 (pilocarpine)、吲噪洛尔（pindolol)、吡诺克辛（pirenoxine)、多粘菌素 B(polymyxin B)、泼尼松龙（prednisolone)、丙美卡因（proparacaine)、雷珠单抗（ranibizumab)、 利美索龙（rimexolone)、莫菪喊（scopolamine)、司佐胺（sezolamide)、角藍胺 (squalamine)、横胺醋酰（sulfacetamide)、舒洛芬（suprofen)、丁卡因（tetracaine)、 四环霉素（tetracyclin)、四氢挫林（tetrahydrozoline)、四氢挫林（tetryzoline)、 噻吗洛尔（timolol)、妥布霉素（tobramycin)、曲伏前列素（travoprost)、曲安西龙 (triamcinulone)、三氣酉昔甲挫胺（trifluoromethazolamide)、曲氣尿苷（trifluridine)、 甲氧辛氨喃啶（trimethoprim)、托吡卡胺（tropicamide)、乌诺前列酮（unoprostone)、阿 糖腺苷（vidarbine)、丁；挫卩林（xylometazoline)、其药学上可接受的盐以及以上物质的 组合。
【附图说明】
[0078] 图1A和图1B显示了将不同浓度的SS-31(10nM，100nM，1 uM和10 uM)与30mM葡 萄糖（HG)共处理的作用。图1A显示了细胞凋亡的分析，在Armexin V/PI染色之后通过 流式细胞仪评估，其显示了处理24小时后的HREC的存活率（Q3)分别为99. 3%、83. 2%、 84.3%、90.7%、92.8%和94.3%。图1B为HREC的存活率的图形表示。100nM、luM和 10 UM的SS-31浓度的数据显著高于没有用SS-31共处理的情况下的暴露于高葡萄糖的细 胞所观察到的数据。*P〈〇. 05对30mM高葡萄糖处理组。
[0079] 图2A-2F是系列显微照片图，其显示了利用SS-31共处理降低了暴露于30mM葡萄 糖24小时和48小时的HREC中的细胞内活性氧（R0S)。利用二氢乙锭测定细胞内R0S。图 2A、图2D分别是24小时和48小时的正常培养基组；图2B、图2E分别是24小时和48小时的 30mM葡萄糖组；以及图2C和图2F分别是24小时和48小时的30mM葡萄糖+SS-31 (100nM) 组。
[0080]图3A和图3B显示了 SS-31防止高葡萄糖处理的HREC的线粒体电位损失。图3A 表示在JC-1荧光探针染色之后，利用流式细胞仪测定的HREC的A Wrn。高葡萄糖（30mM) 处理导致培养的HREC的线粒体膜电位在24小时和48小时的快速损失。相反的是，流式细 胞仪分析显示，与仅高葡萄糖组相比，利用30mM葡萄糖与SS-31共处理组提高了 AWm。图 3B显示30mM葡萄糖与SS-31共处理24小时和48小时的HREC中的A Wm的定量分析。仅 高葡萄糖处理不利地影响A Wm。反之，SS-31将A Wm修复至对照水平。值表示三次重复 进行的六个独立的试验的平均值土SD (标准偏差）。*P〈0. 05。
[0081] 图4A和图4D是共焦显微镜图像，其显示正常葡萄糖组中的HREC和SS-31共处理 组中的HREC在24小时或48小时具有更准确的重叠细胞色素c染色和HSP60染色，表明细 胞色素c和线粒体的共定位。在处理24小时或48小时后，在用30mM葡萄糖处理的HREC 的细胞质中的细胞色素c得到了显著地增加。图4B和图4E显示了通过免疫印迹法测定的 在线粒体和细胞质中的细胞色素c的含量。图4C和图4F显示了高葡萄糖和SS-31共处理 24小时和48小时的HREC的线粒体和细胞质中的细胞色素c含量的百分比的定量分析。
[0082] 图5A和图5B显示了用免疫印迹法所检测出的在高葡萄糖（HG)处理的HREC中的 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达的增加被通过SS-31共处理所降低。半胱氨酸天冬氨 酸蛋白酶-3的表达被标准化为P -肌动蛋白的表达。图5C-5E显示SS-31增加了在高葡 萄糖处理的HREC中的Trx2的表达。图5C显示了用SS-31处理24小时和48小时的暴露 于30mM葡萄糖的HREC中的Trx2的mRNA水平。图?显示了通过免疫印迹法测定的Trx2 蛋白质表达的水平。图5E显示了用高葡萄糖与SS-31共处理或未与SS-31共处理之后24 小时和48小时的HREC中的Trx2的蛋白质水平进行的定量分析。
[0083] 图6是SS-31对糖尿病大鼠的晶状体的作用的图。顶行：从糖尿病大鼠获取的晶 状体；底行：从用SS-31或SS-20处理的糖尿病大鼠获取的晶状体。
[0084] 图7是显示SS-31和SS-20对糖尿病大鼠的晶状体的作用图。糖尿病由高脂肪饮 食和链脲佐菌素（HFD/STZ)(顶行）或者单独链脲霉素（STZ)(底行）引起。
[0085] 图8是显示来自正常大鼠、糖尿病大鼠和利用SS-31治疗的糖尿病大鼠的晶状体 上皮的系列显微图。糖尿病由STZ引起。
[0086] 图9是显示来自正常大鼠、糖尿病大鼠和利用SS-31治疗的糖尿病大鼠的晶状体 上皮的系列显微图。糖尿病由HFD/STZ引起。
[0087] 图10是显示通过伊文思蓝外渗（Evans blue extravasation)分析得出的正常大 鼠（NRC)、糖尿病大鼠和利用SS-20或SS-31治疗的糖尿病大鼠的血视网膜屏障的完整性系 列图表。（A)STZ引起的糖尿病；(B) HFD/STZ引起的糖尿病。
[0088] 图11是显示正常大鼠（NRC)、糖尿病大鼠（HFD/STZ)和利用SS-31治疗的糖尿病 大鼠的视网膜微血管的系列显微照片图。
[0089] 图12是显示正常大鼠、糖尿病大鼠（STZ)和利用SS-31处理治疗的糖尿病大鼠的 视网膜微血管的系列显微照片图。
[0090] 图13A-13D是显示正常大鼠（A)、STZ大鼠（B)和STZ/SS-31处理的大鼠（C)或 STZ/SS-31处理的大鼠（D)中的视网膜微血管中的紧密连接蛋白claudin-5的分布的系列 显微照片图。
[0091] 图14是显示SS-31对来自未患病个体（HTM)的小梁网细胞和来自给药SS-31的 青光眼患者（GTM)的小梁网细胞没有细胞毒性的图。
[0092] 图15是系列共焦显微照片图，其显示用SS-31进行的共处理剂量依赖性地抑制了 来自青光眼患者（GTM)的小梁网细胞中由200 yM的H202引起的线粒体电位（A itm)的降 低。
[0093] 图16是显示SS-31的共处理抑制由200 yM的H202引起的青光眼患者（GTM)的小 梁网细胞中的线粒体膜电位（A Ttm)的降低的系列图，所述的线粒体膜电位由TMRM和流式 细胞仪测定。
[0094] 图17是将GTM中的线粒体膜电位（A $ m)与HTM细胞中的线粒体膜电位（A也m) 进行比较的图。
[0095] 图18是显示使用倒置相差显微镜所观察到的响应于SS-31处理的GTM细胞形态 变化的系列显微照片图。
[0096] 图19是显示通过使用共焦显微镜所观察到的SS-31的共处理以剂量依赖性的方 式降低了由400 yM的H202引起的GTM细胞中的线粒体膜电位损失的系列显微照片图。
[0097] 图20是显示通过TMRM和共焦显微镜（200x放大倍数）所观察到的SS-31的共处 理减少了 GTM细胞中的由400 yM的H202引起的线粒体膜电位（A itm)损失的系列显微照 片图。
[0098] 图21是显示通过倒置相差显微镜所显示出的GTM细胞响应于SS-31处理而形态 变化的系列显微照片图。
[0099]图22是显示SS-31对原代人类视网膜色素上皮