Comm. 333:207 ;Round, J. L 等.（2005)]\￡叉卩.]^(1.201:419;13〇86，（1 等（2005)Am.J.Physiol.Gastr.L.289:G926;Chen，A?和 Xu，J.(2005)Am.J.Physiol. Gastr. L. 288:G447。LDH活性被确定为在限定的时间段中的NADH氧化或INT还原。结果示 在图14中，且表明SS-31不影响HTM细胞和GTM细胞的存活能力。
[0328] 可用在本发明的研究中的利用TMRM测定线粒体膜电位的方法已经由文献 "Andrea Rasola和 Massimo Geuna, A flow cytometry assay simultaneously detects independent apoptotic parameters, Cytometry 45:151-157,2001 ;Mitoprobe? JC-lKit for Flow Cytometry, Molecular Probes, Invitrogen, USA"描述。图 16 显不了 GTM 细胞中 的结果。这些结果共同地表明，利用SS-31进行治疗提高了在给药SS-31之前暴露于双氧 水的细胞的线粒体膜电位。
[0329] 组A。当在SS-31给药之前这些细胞暴露于双氧水时，研究HTM细胞和GTM细胞的 线粒体膜电位（△ itm)。首先，利用标记有四甲基罗丹明甲酯（TMRM，50nM x 30分钟）的细 胞的共焦显微镜测试来测定线粒体膜电位（图15)。还可通过利用线粒体选择性探针一四 甲基罗丹明甲酯（TMRM，50nM x 30分钟）标记细胞使用流式细胞仪测定线粒体膜电位（图 16-17)。
[0330] 组B。当在给药双氧水之前使细胞暴露于SS-31时，研究GTM细胞的形态。图18 显示了给药各种浓度的SS-31的细胞的倒置相差显微镜的结果。结果表明，SS-31以浓度 依赖性与时间依赖性的方式防止细胞由双氧水介导的形态变化。也就是说，在暴露于SS-31 肽的细胞中，双氧水介导的细胞消亡和圆形化得到减弱。当在给药双氧水之前这些细胞暴 露SS-31时，还研究了 HTM细胞和GTM细胞的线粒体膜电位（A itm)。利用标记有四甲基罗 丹明甲酯（TMRM，50nM x30分钟）的细胞的共焦显微镜来测量线粒体膜电位（图19-21)。 这些结果显示SS-31的剂量依赖性的预处理提高了暴露于双氧水的细胞的线粒体膜电位。 因此，SS-31提供了防止GTM细胞中发生氧化压力的保护作用。
[0331] 研究了 SS-31减轻GTM细胞和HTM细胞中的急性氧化损伤的作用。图36显示了 利用FACS分析的GTM细胞和HTM细胞的TMRM的荧光强度。与H 202中的GTM对照相比， 10 6M的SS-31、10 7M的SS-31、10 SM的SS-31中的荧光强度的百分比分别为35. 2±2. 12%、 56. 2±4. 04 %、50. 3±4. 46 %、47. 5±2. 82 %，n = 4 ;HTM 组分另IJ 为 37. 4±0. 725 %、 57.7±1.80%、50.6±3.06%、49.4±2.27%，n = 4。** 表示与 GTM H202相比，P〈0.01 ;* 表示与GTM H202组相比，P〈0. 05 ;▲▲▲表示与HTM H 202组相比，P〈0. 001。
[0332] 图37显示利用FACS分析的对照组和SS-31治疗组中的GTM细胞和HTM细胞 的R0S的荧光强度。与GTM H202中的GTM对照相比，10 6M的SS-31组、10 7M的SS-31 组、10 SM的SS-31组的细胞内R0S产生的百分比分别为146. 0±2. 27%、84. 5±8. 75%、 102. 0±5. 69 %、133. 0±5. 17 % (n = 3) ;HTM 组分别为 153. 0±3. 46 %、79±2. 39 %、 91.8±3.49%、129.0±8.24% (n = 4)。GTM 组和 HTM H202组与对照组相比，P〈0.001;*** 表示与GTM H202组相比，P〈0. 001 ;▲▲▲表示与HTM H202组相比，P〈0. 001 ;▲▲表示与HTM H202组相比，P〈0. 01。图38显示SS-31降低了由H 202引起的细胞凋亡的量。
[0333] 检测了 SS-31对GTM细胞和HTM细胞的持续性氧化损伤的作用。利用10 6M、10 7M、 10 SM的SS-31预处理细胞1小时，接着用200 yM的H202温育24小时以研究SS-31对持续 性氧化压力的保护作用。图39和表13显示了 SS-31对来自GTM细胞和HTM细胞的持续性 氧化损伤的R0S产生的作用。图40和表14显示了各个处理组中的GTM细胞和HTM细胞中 的MMP变化。
[0334]表13. %02处理的GTM3细朐和iHTM细朐中的R0S产牛
[0335]
[0338] 这些结果共同表明，在10 4M对GTM细胞和HTM细胞都没有细胞毒性，由双氧水引 起的持续的且急性的氧化压力可以通过SS-31(>10 9M)得到防止。因此因此，本发明的芳香 族阳离子肽可用在预防或治疗人类对象中的青光眼的方法中。
[0339]实施例4-SS-31预防原代视网腊色素h皮细朐中的氣化压力
[0340] 培养原代视网膜色素上皮（RPE)细胞以测试本发明的芳香族阳离子肽在预防或 降低这些细胞中的氧化损伤的作用。已描述了用于研究原代视网膜色素上皮细胞的方 法。参见：Dunn 等，ARPE-19, A Human Retinal Pigment Epithelial Cell Line with Differentiated Properties, Experimental Eye Research, 1996, 62 (2) : 155-170。首先， 显示了 SS-31没有不良地影响这些细胞。原代培养的人类RPE细胞与不同浓度的SS-31单 独地温育24小时，通过MTT分析来测定细胞存活能力（图22)。
[0341] 接着，在tBHP和各种浓度的SS-31的存在情况下，测试原代RPE细胞的存活能力。 于96孔板中以每孔10000个细胞的对细胞进行涂板并培养24小时，然后切断营养24小 时。之后，将细胞暴露于浓度增大的tBHP(图23A)，或者以不同浓度的SS-31预温育4小 时、用tBHP刺激6小时（图23B)。这些结果表明SS-31响应于tBHP的给药而增强细胞活 性。还利用FACS分析来研究了三组RPE细胞中的细胞内R0S产生。图31A显示了对照RPE 细胞中的R0S产生；图31B显示了利用500 y M的tBHP处理3小时的RPE细胞中的R0S产 生；以及图31C显示了利用500 yM的tBHP处理3小时以及利用1 yM的SS-31处理的RPE 细胞中的ROS产生。图32显示了在FACS分析中由TC-1标记的MMP。分析三个不同浓度的 SS-31组。在用500 yM tBHP处理3小时的组中，红色和绿色的比率为1.08,在10nM SS-31 处理4小时并用500 y M tBHP处理3小时的组中的红色和绿色的比率为1. 25 ;在用100nM SS-31处理4小时并用500 yM tBHP处理3小时的组中，红色和绿色的比率为1.4 ;以及在用 1 ym SS-31处理4小时并用500 yM tBHP处理3小时的组中，红色和绿色的比率为2. 28。 图33A-图33D显示了 1 y M的SS-31对tBHP引起的MMP减少的影响。图33A :对照组，R/ G 为 3. 63±0. 24 ;图 33B:用 500 yM tBHP 处理 3 小时的组，R/G 为 1. 08±0. 11 ;图 33C :用 1 yM的SS-31处理4小时并用500 yM的tBHP处理3小时的组，R/G是2. 38±0. 18。图 33D是比较不同组的荧光比率的图。*P〈0. 01，C相对于B。
[0342] 图34A-图34D显示了 SS-31对用250 y M的tBHP处理24小时引起的细胞凋亡的 作用。图34A:对照组；（Q2+Q4) %= 1. 27±0. 3%;图34B :用250 yM的tBHP处理24小时的 组；（Q2+Q4)%= 15.7±0.6%;图 34C:用 lyM SS-31 处理4小时并用 250 yM 的 tBHP 处理 24小时的组；（Q2+Q4) %= 8. 4±0. 8%。图34D是比较不同组的荧光比率的图。*P〈0. 05, C 相对于B。图35是显示3组RPE细胞中的由tBHP引起的MDA水平。（*P〈0. 05)。
[0343] 这些结果共同表明SS-31防止了原代视网膜色素上皮细胞中的氧化压力。因此， 本发明的芳香族阳离子肽在预防或治疗对人类对象中的视网膜细胞的损伤的方法中是有 用的。
[0344] 实施例5-本发明的芳香族阳离子肽预防和治疗CNV小鼠樽铟中的脉络腊新牛血 笪
[0345] 为了进一步证明在一方面预防了脉络膜新生血管（CNV)以及在另一方面治疗 CNV，在CNV的小鼠模型上测试本发明的芳香族阳离子肽（图24)。用激光烧伤在眼睛中诱导 CNV。已在Reich的以下文献中描述了可用在本研究中的方法：Mol Vis 2003;9:210-216。
[0346] 简言之，用水合氯醛将五周到六周龄的C57BL/6雄性小鼠麻醉并利用托吡卡胺 使其瞳孔扩大。利用盖光片作为接触透镜，将四个激光光点（532nm、260mw、0. 01s、50 ym ; Novus Spectra, Lumenis,美国）施用于右眼中的视神经盘周围的环中的眼底。在激光凝固 术的前一天，开始每天腹膜内注射lmg/kg、9mg/kg的SS-31或媒介物。
[0347] 一周之后，小鼠深度麻醉并通过左心室灌注lml(50mg/ml)的PBS缓冲的荧光 素-葡聚糖。将眼睛摘除并固定在4%的多聚甲醛中2小时。在大圆处切开眼睛，前面的一 半和视网膜被除去。通过四至五次径向切割，将包括巩膜和脉络膜的眼后节分成四份，并安 装在载片上。通过荧光显微镜（AxioCam MRC;Carl Zeiss)检测所有的平载片。用图像分 析软件 _Image-Pro Plus 软件（Media Cybernetics, Silver Spring, MD)来测定每一 CNV 损伤的区域。
[0348] 在每一组中有48处新血管生成。利用IMAGE-PR0PLUS6. 0软件计算新血管生成的 面积。CNV模型、lmg/kg的SS-31组和9mg/kg的SS-31组中的新血管生成的面积分别为 0. 0130±0. 0034、0. 0068±0. 0025、0. 0067±0。这些结果表明，两种浓度的SS-31显著地降 低了脉络膜新血管生成的面积（P〈〇. 05)(图24A-图24D)。
[0349] 实施例6-本发明的芳香族阳离子肽预防和治疗氣诱导视网腊病夺（0IR)小鼠樽 铟中的0IR
[0350] 为了进一步证明对氧诱导视网膜病变（0IR)的预防，在患有0IR的小鼠模型中测 试本发明的芳香族阳离子肽（图25)。在该模型中，具有部分发育的视网膜脉管系统的7天 龄的幼鼠承受高氧（氧为75%)达5天，这使视网膜血管停止生长并引起明显的血管阻塞。 在出生后12天时，将幼鼠返回到室内空气中，到出生后17天时，出现显示出典型临床病症 的补偿性视网膜新生血管。病理学新血管生成的模型已广泛用作增生型糖尿病视网膜病变 的替代品。
[0351] 为了检测本发明的芳香族阳离子肽对于预防0IR的作用，在幼鼠中诱发0IR，同时 将芳香族阳离子肽（例如，SS-20或SS-31)对小鼠给药大约6周。其结果显示在图26A至 图26E中，表明利用SS-31治疗防止了补偿性视网膜新血管生成。因此，本发明的芳香族阳 离子肽可用在预防哺乳动物对象中的增生型糖尿病视网膜病变的方法中。
[0352]实施例7-抗氣化剂降低色素件视网腊炎的樽铟中的感光细朐死亡
[0353] 从小鼠的视网膜肿瘤获得视锥细胞特定品系661W。以前已描述了 661W细 胞的研究中使用的方法。通常参见：GearoidTuohy, Sophia Millington-Ward, Paul F. Kenna, Peter Humphries和 G. Jane Farrar, "Sensitivity of Photoreceptor-Derived Cell Line (661W) to Baculoviral p35, Z-VAD. FMK, and Fas-Associated Death Domain'，， Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2002;43:3583-3589。培养这些细胞 以测试本发明的芳香族阳离子肽在预防或降低视锥细胞中的氧化损伤的作用（图27A-图 27B)。首先，显示tBHP影响661w细胞的的存活率（图27A)。将不同剂量的tBHP给药对细 胞给药3小时。接着，显示不同剂量的SS-31降低了 tBHP诱发的661w细胞死亡（图27B)。
[0354] SS-31具有防止tBHP诱发的线粒体存活能力降低的能力，将100nm 〇l/L的SS-31 给药至661w细胞的培养基。结果显示在图30中，通过JC-1分析表明与未给药SS-31的细 胞相比，SS-31显著地增强了线粒体存活能力。
[0355]实施例8-在视网腊夺件的小鼠樽铟中的SS-31的作用
[0356] 为了进一步证实对视网膜变性的预防，在视网膜变性的小鼠模型上测试了本发明 的芳香族阳离子肽。用激光损伤在眼睛中诱发CNV(见实施例5)。寄希望了解感光细胞 死亡的原因，视网膜变性的小鼠模型已研究了很多年。已经发现呈现视网膜中的感光细胞 变性同时保留所有其他的视网膜细胞类型的自然出现的小鼠的突变体：视网膜变性（原名 rd，与无杆视网膜相同，r,现在ped6b rdl) ;Purkinje细胞变性（pcd);神经（nr);缓慢视 网膜变性（rds，现在Prph rd2);视网膜变性3(rd3);运动神经元变性（mnd);视网膜变性 4(rd4);视网膜变性5(rd5);白癜风（vit，现在mitf mi-vit);视网膜变性6(rd6);视网膜 变性7(rd7);神经元蜡样质脂褐质（nclf);视网膜变性8(rd8);视网膜变性9(rd9);视网 膜变性10(rdl0);锥感光细胞功能丧失（cpfll)。
[0357] 图28是显示在患有视网膜变性的小鼠模型中的对照鼠和SS-31处理的鼠中的视 网膜外核层（0NL)的厚度的系列显微照片图。结果表明与未处理过的小鼠比较，SS-31处 理过的小鼠0NL中保持很多行的细胞。染有花生凝结素（PNA)的视网膜平载片选择性地染 有核内段和核外段，其也显示了 SS-31处理过的小鼠中有较大的核细胞密度。这些结果表 明，利用SS-31处理防止了患有视网膜变性的小鼠模型中的视网膜外核层的补偿性损害。 因此，本发明的芳香族阳离子肽可用在预防哺乳动物对象中的视网膜变性的方法中。
[0358] 等同物
[0359] 本发明不限于在本申请中描述的特定实施方式，用作本发明的单独的方面的单一 说明。本领域技术人员将理解，可以不脱离本申请的精神和范围的情况下进行各种修改和 改动。根据以上描述，除了本文中列举的以外，本公开的范围内的功能上等同的方法和装置 对于本领域的本领域技术人员而言是明显的。这样的改动和修改意欲落在所附权利要求的 范围内。本公开仅受所附权利要求以及与这样的权利要求的的范围所等同的全部范围限 制。应当理解，本公开不限于特定的方法、试剂、组合物和生物系统，当然，所述方法、试剂、 组合物和生物系统可以变化。还可理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式，不 用来是限制性的。
[0360] 此外，在以马库什组的方式描述本公开的特征或方面的情况下，本领域的本领域 技术人员将意识到，本公开也是以马库什组中的任一单个成员或亚组成员的方式所描述 的。
[0361] 本领域的本领域技术人员将理解，为了任何或所有目的，尤其是提供说明书支持 方面，本文中描述的所有范围还可涵盖任何且所有的可能子范围及其子范围的组合。任何 列出的范围可以容易地看作充分公开并使其能够同一范围分成至少等半、三分之一、四分 之一、五分之一份、十分之一等的子范围。作为非限制性实施例，本文中描述的每一范围可 以容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，所有的 语言比如"上至""至少"、"大于"、"小于"等包括所本数且适用于可以随后被分成以上上 述所提及子范围的范围。最后，本领域技术人员将理解，范围包括每一单个成员。因此，例 如，具有1到3个单元的组指的是具有1个单元、2个单元或3个单元的组。类似地，具有1 到5个单元的组指的是具有1个单元、2个单元、3个单元、4个单元或5个单元的组，等等。
[0362] 本文所参考的或引用的所有专利、专利申请、在先申请和出版物通过引用而全文 并入本文，包括所有的附图和表格，使得它们不与本说明书的明确教导相矛盾。
[0363] 在以下的权利要求范围内提出其他的实施方式。
【主权项】
1. 肽在制备用于治疗或预防需要治疗或预防的哺乳动物对象中的眼科病症的药物中 的用途，其中，所述肽由式 D-Arg-2' 6' -Dmt-Lys-Phe-NH2S Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH 2表示， 其中，所述眼科病症选自视网膜水肿和视网膜血管阻塞。2. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述肽是D-Arg-2' 6' -Dmt-Lys-Phe-NH2。3. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述肽是Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。4. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述对象是人类。5. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物被配制成通过眼内给药、离子电渗疗法 给药、口服给药、局部给药、全身给药、静脉内给药、皮下给药或肌内给药。6. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物还包括第二活性剂。7. 根据权利要求6所述的用途，其中，所述第二活性剂选自抗氧化剂、金属络合物、消 炎药、抗生素和抗组胺剂。8. 根据权利要求7所述的用途，其中，所述抗氧化剂是维生素A、维生素C、维生素E、番 茄红素、硒、a-硫辛酸、辅酶Q、谷胱甘肽或类胡萝卜素。9. 根据权利要求6所述的用途，其中，所述第二活性剂选自：乙氧喹环啶、乙酰唑胺、阿 奈可他、阿可乐定、阿托品、法可林、氮卓斯汀、枯草杆菌抗生素、苯呋洛尔、倍他米松、倍他 洛尔、比马前列素、溴莫尼定、布林佐胺、碳酰胆碱、卡替洛尔、塞来昔布、氯霉素、氯四环素、 环丙沙星、色甘酸盐、可玛林、环喷托酯、环孢菌素、达哌唑、地美溴铵、地塞米松、双氯芬酸、 双氯非那胺、肾上腺素异戊酯、杜塞酰胺、乙膦硫胆碱、依美斯汀、依匹斯汀、肾上腺素、红霉 素、依索唑胺、尤卡托品、氟氢可的松、氟甲龙、氟比洛芬、福米韦生、新霉素B、更昔洛韦、加 替沙星、庆大霉素、后马托品、氢化可的松、5-碘脱氧尿苷、茚甲新、异氟磷、酮咯酸、酮替芬、 拉坦前列素、左倍他洛尔、左布诺洛尔、左卡巴斯汀、左氧氟沙星、洛度沙胺、氯替泼诺、甲羟 松、醋甲唑胺、美替洛尔、莫西沙星、萘甲唑林、游霉素、奈多罗米、新霉素、诺氟沙星、氧氟沙 星、奥洛他定、羟甲唑啉、吡嘧司特、哌加他尼、苯肾上腺素、毒扁豆碱、匹鲁卡品、吲哚洛尔、 吡诺克辛、多粘菌素B、泼尼松龙、丙美卡因、雷珠单抗、利美索龙、莨菪碱、司佐胺、角鲨胺、 磺胺醋酰、舒洛芬、丁卡因、四环霉素、四氢唑林、四氢唑林、噻吗洛尔、妥布霉素、曲伏前列 素、曲安西龙、三氟醋甲唑胺、曲氟尿苷、甲氧苄氨嘧啶、托吡卡胺、乌诺前列酮、阿糖腺苷、 丁苄唑啉、其药学上可接受的盐以及以上物质的组合。
【专利摘要】本发明公开了一种用于预防或治疗眼科病症的方法和组合物。本发明提供了肽在制备用于治疗或预防需要治疗或预防的哺乳动物对象中的眼科病症的药物中的用途，其中，所述肽由式D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH2或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2表示，其中，所述眼科病症选自视网膜水肿和视网膜血管阻塞。
【IPC分类】A61P27/12, A61P27/06, A61P27/02, A61P9/10, A61K45/00, A61K38/07, A61K38/04, A61K31/366
【公开号】CN105056206
【申请号】CN201510388677
【发明人】刘力平, 唐世博, 梁小玲
【申请人】康肽德生物医药技术有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2010年8月23日
【公告号】CA2772094A1, CN102625709A, EP2470191A1, EP2470191A4, EP2470191B1, EP2813235A1, EP2826487A1, EP2957291A1, US8470784, US9023807, US20110177047, US20140044689, WO2011025734A1