UK Home Office guide lines)并在批准 许可下进行。雄性斯普拉-道来（Sprague-Dawley)大鼠（225_250g)每日口服施用（管 饲法（gavage))水、F0S (低聚果糖）（4g/kg)或 G0S (低聚半乳糖[Bimuno]) (4g/kg)5 周 (n = 8/组）。该给药方案基于先前的研究（Anthony等人；Food Chem Toxicol. ;M(6); 819-26(2006))和示出这些优化的益生元剂量提供最大微生物群生长的试验数据（未示 出）。最后一次喂填后24小时处死所有动物，收集躯干血（trunk blood)并取出脑。离心 血液以得到血浆，并将额叶皮质和海马从获得的一半脑中切出。将整个脑和分离的部分在 干冰上的异戊烷中迅速冷冻并在使用前用血浆储存在_80°C。
[0052] BDNF 分析
[0053] 来自所有组的皮质和海马组织在含有蛋白酶抑制剂（' Complete-Mini'，Roche) 的RIPA(放射免疫沉淀测定）缓冲液（l:10w/v，Sigma Aldrich，UK)中均质化。蛋白质浓 度使用Bradford试剂（Sigma，UK)测定。蛋白质提取物样品在用市售BDNF ELISA试剂盒 (BDNF Emax immunoassay system, Promega UK)分析之前，在去离子水中 l:5v/v 稀释。
[0054] 免疫印迹
[0055] 将来自益生元组和对照组的相同浓度的皮质、海马或小脑的蛋白质提取物 与上样缓冲液（50mM 1，4-二硫苏糖醇和0.025 %溴酚蓝）混合，并与分子量标记物 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)通过电泳在预制7. 5 % SDS/聚丙稀酰胺凝胶 (Biorad，UK)上分级，并转印（trans-blotted)至聚二氟乙稀（PVDF)膜（Immobilon_P，Mil lipore, Watford, UK)上。
[0056] 将膜用含有0. l%Tween的PBS (磷酸盐缓冲盐水）（PBST)中的5% (w/v)脱脂牛奶 封闭 45min，接着在含有针对 NR1 (AB9864, Millipore, UK)、NR2A(AB1555, Millipore, UK)和 NR2B(AB15362,Millipore，UK)三个NMDAR亚单位之一的一抗（1:1000稀释）和b-肌动蛋白 (Sigma-Aldrich，UK，1:50, 000稀释）的温育缓冲液（含2% [w/v]牛奶的PBST)中室温温 育lh。接着将膜在PBST洗涤三次10分钟，并在封闭缓冲液中的HRP (辣根过氧化物酶）-偶 联的二抗中温育 30min。使用 ECL-Plus 试剂盒（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)、并 将膜置于X-射线膜（Kodak BioMax AR film)上、通过化学荧光使免疫反应性条带（bands) 可视化。所有抗体产生期望分子量的单一条带。使用Alphalmager 3400测量条带的光密 度（0D)，并将数据表示为磷酸化：总NMDAR亚单位的0D比，或总NMDAR亚单位：b-肌动蛋 白的0D比。
[0057] 原位杂交组织化学（ISHH)
[0058] 将冷冻的大鼠脑半球在低温槽上冠状切片（140 ym)，融解放置于 Superfrost-plus玻片（Fisher Scientific)上并储存在_80°C。将含有额叶皮质的切片 如 Burnet 等人（Mol. Cell. Neurosci. ;46 ;167_75 ; (2011))所述预处理。
[0059] 与 BDNF(碱基 883-927，NM001270630. 1)、NR1(碱基 746-780，NM008169. 1)、 NR2A(碱基 1642-1676，NM008170.2)或 NR2B (碱基 1758-1792，NM010350.2)互补 的商业合成的（MWG，UK)寡脱氧核糖核苷酸用于现有的ISHH法（Eastwood等人； J. Psychopharmacol. ;11;635-644 ; (2007))。寡脱氧核糖核苷酸探针3' -端用末端过氧核 苷转移酶（Promega，UK)标记[35S]-dATP。将探针在杂交缓冲液中稀释，用移液器吸取至组 织切片上（1 X 106cpm/切片），盖上盖玻片，接着在34°C下在衬有滤纸的加盖珀斯佩有机玻 璃（Perspex)托盘上温育>16小时，滤纸浸有4XSSC(生理盐水柠檬酸钠）/50%甲酰胺。
[0060] 杂交后的洗涤包括：2XSSC室温冲洗以除去盖玻片；0. 5XSSC，20min(X3)55°C; 0.5XSSC 30min(X2)室温。将玻片于ddH20中冲洗、干燥并以14C-微量置于X射线膜 (Kodak, Biomax MS)上7-28天。使用计算机辅助图像分析测量各mRNA的横跨额叶皮质灰 质的深度的平均灰质密度（grey density)，并使用14C-微量标准转换为nCi/mg组织。
[0061] HPLC 分析
[0062] 皮层组织小碎片（50mg)单独在冰冷的甲醇（1:10w/v)中均质化并 以4 °C、13200rpm离心10分钟。将上清液（10 y I )注入惠普1100液相色谱 仪（Agilent Technologies, Palo Alto, CA)并如之前所述进行在线柱前衍生 (pre-column, derivatization) (Grant 等人；J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. ; Mi;278-282(2006))。简言之，样品（10yl)在柱分离之前与等体积衍生 试剂[0. 2ml的甲醇和0. 8ml 0. 4M的硼酸钠缓冲液（pH = 9)中的邻苯二甲醛（2mg)和 Boc_L-半脫氨酸（2mg)]反应5min。使用保持在 30°C的 Agilent Zorbax Eclipse )(DB-C18 柱（4. 6 X 150mm, 5 y m)和与 Morikawa 等人（J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. ：757： 119-25(2001))类似的分离方案实现分离。由乙腈（相A)和lOOmM醋酸钠缓冲液pH = 6(相B)组成的流动相以1.4ml/min栗过柱。使用下列梯度体系（min/%B) :0/91、35/84、 65/84。衍生的氨基酸通过焚光检测（发射：443nm;激发：344nm)检测。使用可靠标准品 (authentic standards) (0? 5 至 lOOOpmol)构建 D-和 L-氨基酸（Sigma Aldrich, UK)的 8 点校正曲线，在各情况中发现线性相关系数>0. 995。
[0063] 数据分析
[0064] 所有数据表示为平均值土标准平均误差（SEM)。用单因素方差分析（one-way AN0VA)、接着事后分析（post hoc analysis) (Tukey HSD)来进行各组之间的统计学比较。
[0065] MM.
[0066] 对照和益生元大鼠粪粒中的双歧杆菌
[0067] 来自F0S-饲养大鼠的粪粒中的双歧杆菌数（表示为loglO/g)显著大于对 照（9. 498+0. 025vs 9. 354+0. 055，p〈0. 05)，而来自G0S-饲养动物的双歧杆菌的密度显 著大于对照（9. 624+0. 05vs 9. 354+0. 055, p〈0. 01)和 F0S-饲养大鼠（9. 624+0. 05vs 9. 498+0. 025, p〈0. 05)二者。
[0068] 益生元对大鼠额叶皮质和海马中的BDNF和NR1的作用
[0069] 额叶皮质提取物中的BDNF蛋白质水平在各组间并无差异（图1A)。然而，F0S施用 的大鼠的海马提取物中的BDNF显著高于对照和G0S饲养的动物的。免疫印迹揭示了，与对 照和F0S动物相比，G0S-饲养大鼠额叶皮质中含有显著高水平的NR1免疫反应性（图1B)。 然而海马的分析揭示了，尽管观察到G0S动物相对于对照的增加趋势（p = 0. 055)，但F0S 大鼠比其它组含有显著多的NR1亚单位。
[0070] 益生元对大鼠额叶皮质和海马中的NR2A和NR2B亚单位的作用
[0071] 在免疫印迹中，来自G0S-饲养动物的海马（而非皮质）的提取物与其它两组相比 含有显著高的NR2A免疫反应性（图2)。NR2B在额叶皮质和海马中的水平不受益生元饲养 的影响。
[0072] 益生元对海马中的BDNF和NR亚单位的mRNA的作用
[0073] 益生元施用相对于对照增加了海马齿状回中BDNF(图3A、C、E和图4A)和NR1 (图 3B、D、F)mRNA的丰度。还观察到G0S-饲养大鼠的CA3分区中BDNF mRNA的减少（图3C)。 光密度法证实了在益生元大鼠的齿状回中显著较高的BDNF和NR1表达（图4A，B)。G0S施用 导致与对照和F0S-饲养动物相比的齿状回和CA1分区中的NR2A (图4C)(而不是NR2B (图 4D)) mRNA 升高。
[0074] 益生元后的粪便、血浆和脑氨基酸浓度
[0075] 本研究试验了肠道细菌的升高是否通过升高肠道和循环中的中心D-丙氨酸的量 而增加了该D型氨基酸的浓度。G0S饲养大鼠的粪粒中游离D-丙氨酸的浓度显著高于对照 和FOS动物，其中FOS施用导致该D型氨基酸的中间水平（表1)。单独的益生元或GOS都 提高了包括D-丝氨酸和谷氨酸在内的其它氨基酸。在血浆中，与对照动物相比，D-丙氨酸 水平显著高于G0S-饲养大鼠（表1)，在F0S-饲养大鼠中观察到微小的、尽管并不显著的（p = 0.086)增加。益生元施用并不改变其它循环氨基酸的浓度（表1)。用G0S饲养的大鼠 在额叶皮质中与对照相比具有显著高的D丝氨酸浓度（表2)，尽管额叶皮质和海马中所有 其它氨基酸的水平在益生元饲养后并未改变。皮质D-丝氨酸和NR1蛋白质水平之间存在 整体显著相关（皮尔森的r = 0. 684,p= 0. 01)。单个组的分析揭示了该相关仅在G0S饲 养后显著（GOS:r= 0? 96,p= 0? 04 ;F0S:r= 0? 68,p= 0? 32 ;水：r= 0? 01，p= 0? 989)。
[0076] 表1重复口服水或益生元后大鼠粪粒和血浆中的氨基酸浓度。与水相比*p〈0. 05 ; 与FOS相比 +p〈0. 05
[0077]
[0078] 表2重复口服水或益生元后大鼠皮质和海马中的氨基酸浓度。与水相比*p〈0. 05
[0079]
[0080] 讨论
[0081] 我们观察到1)与G0S饲养大鼠和对照动物相比，F0S饲养大鼠中较大的海马BDNF 水平，尽管BDNFmRNA在F0S和G0S饲养大鼠的齿状回中都增加；2)G0S饲养大鼠的额叶皮 质中和益生元饲养动物的海马中升高的NR1蛋白质；3)与