一种多西紫杉醇纳米载药颗粒、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物材料与纳米技术领域，具体涉及一种具有较高包封率和载药量、高生物安全性，并且能够缓慢释放药物多西紫杉醇的多西紫杉醇纳米载药颗粒、其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]癌症是世界范围内仅次于心血管疾病的第二大严重威胁人类健康和生命的疾病。而乳腺癌的发病率在整个癌症中排名第二，是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。目前对于乳腺癌的治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗和分子靶向治疗，但仍以手术切除为主。分子靶向治疗能够提高肿瘤化疗药物疗效，降低其毒副作用，是近年来乳腺癌治疗研究领域最为活跃的部分，对于提高乳腺癌临床治疗效果具有极其重要的意义，并有可能成为今后乳腺癌药物研发的主要方向(http://www.haodf.com/jibing/ruxiana1.htm)。
[0003]多西紫杉醇(docetaxel，DTX)又名多西他赛，是新一代紫杉醇烷类抗肿瘤药物。它通过作用于细胞微管与聚合的管蛋白作用并抑制其解聚，使肿瘤细胞停止在有丝分裂期而死亡，有效抑制肿瘤细胞的复制。临床研究表明，多西紫杉醇可以单独或与其他抗肿瘤药物合用治疗非小细胞性肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等癌症。由于多西紫杉醇具有亲脂性，基本不溶于水，因此上市的静脉注射剂多西紫杉醇浓溶液中含有大量的吐温80，且需要用13%乙醇稀释后方能注射。由于吐温80具有溶血性且黏度较大，临床试验中大多数患者产生明显的过敏反应，并且药物本身也具有一定的毒副作用，容易引起骨髓抑制，神经毒性反应，心脏毒性反应，关节或者肌肉疼痛，肝脏肾脏毒性反应等。因此近年来开发新型多西紫杉醇制剂一直是研究的热点。
[0004]纳米药物载体通过将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，能增加生物膜的透过性，改变在体内的分布，提高生物利用度等，为改善抗肿瘤药物疗效和降低肿瘤耐药性提供了新的思路。而且纳米载药颗粒还有另一优势，实现纳米粒介导的靶向治疗。纳米粒介导的靶向治疗是通过纳米粒子作为载体，包裹药物(核苷酸、蛋白或小分子化合物)，同时在纳米粒表面连接具有导向功能的靶头，将药物递送到靶向部位，提高药物在局部的浓集和释放，从而实现靶向干预治疗。靶向释药系统能够克服或部分的解决抗肿瘤药物毒副作用大、水溶性差、半衰期短、生物利用度低等传统化疗中存在的问题，在改善化疗药物的体内分布特性和药代动力学特性，增加药物效力，降低药物毒性，减少肿瘤多药耐药性产生从而提高治疗指数和肿瘤化疗效果方面有着独特的优势，在肿瘤治疗中有着非常良好的应用前景。
[0005]组织因子(tissue factor, TF)又称凝血因子III，是外源性凝血系统的启动因子，是人体内活性最强的促凝物质之一。经研究发现TF除了在正常生理状态下表现的功能外，在肿瘤的发展过程中起着重要的作用。TF的过度表达经常被与肿瘤的发生相关联，TF在转移性癌细胞比在非转移癌细胞表达水平可高达1000倍以上，提示TF在肿瘤转移的直接作用。目前已知的TF在人脑胶质瘤、转移性乳腺癌、大肠癌、胰腺癌等癌症细胞上过度表达。肿瘤细胞上过度表达的TF与肿瘤的血管生成、肿瘤发生转移、肿瘤侵袭以及肿瘤患者预后等有密切关联。根据TF在肿瘤细胞及肿瘤血管细胞表面的高表达状态，其作为肿瘤分子靶向治疗的靶点已经收到了广泛关注。目前有关TF及其配体FVE的研究发现，FVE上类表皮生长因子 I 区多肽(First epidermal growth factor-likedomain, EGFl)是与 TF 结合的重要配体，该肽段具有结合TF功能而无促凝活性，因此EGFl肽可基于配/受体的相互作用而成为靶向TF制剂的导向功能基。
[0006]目前已有很多研究以FVE突变体(其中氨基酸突变)作为靶向功能基修饰于载药纳米颗粒表面或者与细胞免疫蛋白融合表达，靶向癌细胞表面过表达的组织因子，从而达到治疗的目的。另外也有以EGFl作为靶向多肽，修饰于紫杉醇纳米颗粒表面用于脑胶质瘤的治疗。但是EGFl-多系紫杉醇纳米载药颗粒的研究尚未见报道。因此本专利是在该方面的创新，制备了一种新颖的革E向纳米载药颗粒。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供通过超声乳化/溶剂挥发法，构建针对药物包裹多西紫杉醇的纳米载药系统，解决多西紫杉醇水溶性、缓释性、吸收性、存在的问题，同时在该纳米颗粒表面修饰一种靶向性多肽，直接靶向肿瘤细胞，提高对肿瘤的治疗效果。
[0008]为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:
一种多西紫杉醇纳米载药颗粒，其包括纳米颗粒、包裹在所述的纳米颗粒内的多西紫杉醇、通过共价键修饰于所述的纳米颗粒表面的巯基化的EGFl蛋白，所述的纳米颗粒是由马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙醇酸聚合物形成。
[0009]具体地，所述的马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙醇酸聚合物中的马来酰亚胺基与所述的巯基化的EGFl蛋白中的巯基形成所述的共价键。
[0010]一种所述的多西紫杉醇纳米载药颗粒的制备方法，包括依次进行的如下步骤: 步骤(I )、采用挥发性有机溶剂将所述的马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙醇酸聚合物与所述的多西紫杉醇溶解，得到有机相，而后在超声乳化仪超声的条件下将所述的有机相分散至水相中，得到水包油型乳液，搅拌使所述的有机溶剂挥发，得到纳米颗粒，离心后制得包裹有多西紫杉醇的纳米颗粒；
步骤(2)、将步骤(I)制得的包裹有多西紫杉醇的纳米颗粒与所述的巯基化的EGFl蛋白在孵育条件下以所述的共价键连接，制得所述的多西紫杉醇纳米载药颗粒。
[0011]具体地，所述的挥发性有机溶剂为二氯甲烷，所述的水相为质量浓度为0.5wt%~2wt%的聚乙烯醇水溶液，所述有机相与水相的体积之比为15~25:1。
[0012]具体地，所述的马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙醇酸聚合物与所述的多西紫杉醇的投料质量比为40~60:1。
[0013]具体地，步骤(I)中还包括在离心操作后，采用超纯水将包裹有多西紫杉醇的纳米颗粒洗涤干净、冻干的步骤。
[0014]具体地，步骤(2)中，所述的包裹有多西紫杉醇的纳米颗粒中的马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙醇酸聚合物与所述的巯基化的EGFl蛋白中的巯基的投料摩尔比为
1: 0.5?1.5o
[0015]具体地，步骤(2)的【具体实施方式】为:将所述的包裹有多西紫杉醇的纳米颗粒加入到磷酸盐缓冲液中，混匀后，加入所述的巯基化的EGFl蛋白，在10~35°C下避光、充氮气的情况下磁力搅拌10~16小时，然后在2~6°C、13500~14500rpm的条件离心，除去上清液后，加入磷酸盐缓冲液混匀，经Sepharose CL-4B柱，除去未结合的游离蛋白，收集洗脱液，所述的洗脱液经冷冻干燥得到所述的多西紫杉醇纳米载药颗粒。
[0016]更具体地，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.008-0.012mol/Lo
[0017]—种所述的多西紫杉醇纳米载药颗粒在制备治疗过度表达组织因子的肿瘤的药物中的应用。
[0018]优选地，一种所述的多西紫杉醇纳米载药颗粒在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
[0019]由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:采用简单易行的超声乳化溶剂挥发法制备纳米载药颗粒，该方法成本低廉，可重复性好，不需要超洁净实验环境，并可以大批量制备，具有操作方便、简单易行、成本低廉以及可重复性好等优势，这些优势可被广泛应用于多种疏水性药物的纳米载药颗粒制备。同时在制备的纳米颗粒表面修饰靶向性多肽，能够主动靶向肿瘤细胞，且与组织因子的胞外区具有较高的亲和力，不会引起凝血效应，提高药物在肿瘤部位的浓度，降低药物的毒性，生物安全性良好，且能有效延长药物释放时间，有效地提高多西紫杉醇的生物利用度，提供了一种新颖的肿瘤靶向药物治疗方式。
【附图说明】
[0020]附图1为多西紫杉醇纳米载药颗粒的制备流程示意图；
附图2为EGFl蛋白的诱导表达鉴定的SDS-PAGE电泳图，其中:M:Marker;带I为诱导后工程菌BL21;带2为未诱导菌；带3，4为纯化后洗脱液；
附图3为包裹有多西紫杉醇的纳米颗粒的粒径分布图；
附图4为多西紫杉醇纳米载药颗粒的粒径分布图。
【具体实施方式】
[0021]以下结合具体实施例对上述方案作进一步说明，应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中所采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。以下实施例中表示含量的百分比“ ％”均指的是质量百分含量。
[0022]实施例1:包裹多西紫杉醇的的纳米颗粒的制备包括以下步骤:
I)称取Img多西紫杉醇和50mg的马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙醇酸聚合物(Malemide-PEG-PLGA)溶于Iml二氯甲烷，振荡使其充分溶解，得到有机相。
[0023])在冰浴超声的条件下，在持续超声90s内将有机相用注射器缓慢均匀的加入到20ml的1%聚乙烯醇水溶液中，继续设置超声12min (参数设置，功率为300w，Is开Is关)得到0/W型乳液。
[0024])保鲜膜扎孔封口，磁力搅拌10h，使二氯甲烷缓慢的挥发，纳米颗粒均匀的固化。
[0025])将纳米颗粒混悬液进行高速离心(仪器参数设置:16000rpm，25°C，60min),将上清液倾倒出，得到包裹多西紫杉醇的的纳米颗粒。
[0026])超纯水洗涤包裹多西紫杉醇的的纳米颗粒，除去游离的药物，取部分添加5%(w/v)蔗糖作为冻干保护剂混合均匀，于冷冻干燥机中冻