OS释放的量。具体操作步骤 为：DCFH-DA以纯甲醇溶解，配制成浓度为IOmM的母液，临用前再用Hank's平衡盐溶液 (HBSS)将母液稀释500倍至20yM的终浓度。取加药处理过后的N9细胞，吸除上清液，用 该20yM的DCFH-DA溶液孵育lh，HBSS洗三次以除去未进入细胞内的DCFH-DA，最后用多 功能酶标仪检测激发波长485nm、发射波长528nm处的荧光强度。
[0049] 检测方法：取对数生长期的N9细胞，以新鲜的无血清DMEM培养液将细胞接种于6 孔板内，细胞密度为3XIO5ceIIs/ml，接种量600y1/wel1，置于培养箱内在37°C、5% 0)2的 条件下培养。细胞贴壁培养3h后小心吸出培养液，按照实验分组，分别换成无血清的DMEM 培养液配置的不同药物来孵育细胞，同时设空白对照组，每组设3个复孔，之后吸除上清 液，用20yM的DCFH-DA溶液孵育lh，PBS洗去未进入细胞内的DCFH-DA，最后用多功能酶 标仪检测激发波长485nm、发射波长528nm处的荧光强度。
[0050] 实验结果：柴胡阜苷a、bl、b2、c、d可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞ROS的释 放。
[0051] 实施例3 :新物体辨别（NovelObjectRecognition，N0R)实验考察柴胡皂苷a对 LPS诱导的学习记忆损伤小鼠新物体辨别能力的影响；结构如图1所示：
[0052] 材料动物：ICR雄性小鼠，18_22g;
[0053] 药物：LPS;柴胡皂苷a;盐酸多奈哌齐；
[0054] 方法：取ICR小鼠，随机分为6组，每组12只：空白对照组，模型对照（LPS)组，柴 胡皂苷a高中低剂量组和阳性对照组（盐酸多奈哌齐）。各组动物用水合氯醛轻微麻醉后 固定头部，进行侧脑室注射。模型组、柴胡皂苷a低剂量（2mg/kg)组、柴胡皂苷a中剂量 (4mg/kg)组、柴胡皂苷a高剂量（8mg/kg)组和阳性对照组（5mg/kg)注射LPS溶液（5mg/ ml，3y1/只），空白对照组小鼠注射等体积的生理盐水。自LPS注射后次日起，各柴胡皂苷a剂量组小鼠根据其体重的大小每天灌胃柴胡皂苷a溶液，阳性对照组的小鼠每天灌胃盐 酸多奈哌齐溶液，空白组和模型组的小鼠每天灌胃给予等体积的生理盐水。第8天开始进 行新事物辨别实验。测定每只小鼠的偏爱指数。计算公式如下：
[0056] 结果：在NOR实验中，侧脑室注射LPS能够使小鼠对新事物的偏爱指数明显降低。 柴胡皂苷a(2-8mg/kg)和阳性药盐酸多奈哌齐5mg/kg治疗后能够明显增加小鼠对新事物 的偏爱。实验结果表明，柴胡皂苷a能够明显增加LPS诱导的学习记忆损伤小鼠新物体辨 别能力。
[0057] 实施例4 :Y迷宫实验考察柴胡皂苷a对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠工作记忆能 力的影响；结果如图2所示：
[0058] 材料动物：ICR雄性小鼠，18_22g;
[0059] 药物：LPS;柴胡皂苷a;
[0060] 方法：取ICR小鼠，随机分为6组，每组12只：空白对照组，模型对照（LPS)组，柴 胡皂苷a高中低剂量组和阳性对照组（盐酸多奈哌齐）。各组动物用水合氯醛轻微麻醉后 固定头部，进行侧脑室注射。模型组、柴胡皂苷a低剂量（2mg/kg)组、柴胡皂苷a中剂量 (4mg/kg)组、柴胡皂苷a高剂量（8mg/kg)组和阳性对照组（5mg/kg)注射LPS溶液（5mgl/ ml，3y1/只），空白对照组小鼠注射等体积的生理盐水。自LPS注射后次日起，各柴胡皂苷 a剂量组小鼠根据其体重的大小每天灌胃柴胡皂苷a溶液，阳性对照组的小鼠每天灌胃盐 酸多奈哌齐溶液，空白组和模型组的小鼠每天灌胃给予等体积的生理盐水。第9天开始进 行Y迷宫实验。测定每只小鼠的自发交替反应率。计算公式如下：
[0061]
[0062] 结果：在Y迷宫实验中，LPS模型组小鼠的自发交替反应率明显低于空白组，说明 侧脑室注射LPS能够明显损伤小鼠的学习记忆能力。柴胡皂苷a(2-8mg/kg)和阳性药盐酸 多奈哌齐5mg/kg治疗后能够明显增加小鼠在Y迷宫中的自发交替反应率。实验结果表明， 柴胡皂苷a能够明显增加LPS诱导的学习记忆损伤小鼠的工作记忆能力。
[0063] 实施例5 =Morris水迷宫实验考察柴胡皂苷a对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠空 间学习记忆能力的影响；结果如图3和图4所示：
[0064] 材料动物：ICR雄性小鼠，18_22g;
[0065] 药物：LPS;柴胡皂苷a;
[0066] 方法：取ICR小鼠，随机分为6组，每组12只：空白对照组，模型对照（LPS)组，柴 胡皂苷a高中低剂量组和阳性对照组（盐酸多奈哌齐）。各组动物用水合氯醛轻微麻醉后 固定头部，进行侧脑室注射。模型组、柴胡皂苷a低剂量（2mg/kg)组、柴胡皂苷a中剂量 (4mg/kg)组、柴胡皂苷a高剂量（8mg/kg)组和阳性对照组（5mg/kg)注射LPS溶液（5mg/ ml，3y1/只），空白对照组小鼠注射等体积的生理盐水。自LPS注射后次日起，各柴胡皂苷 a剂量组小鼠根据其体重的大小每天灌胃柴胡皂苷a溶液，阳性对照组的小鼠每天灌胃盐 酸多奈哌齐溶液，空白组和模型组的小鼠每天灌胃给予等体积的生理盐水。第10天开始进 行Morris迷宫实验，持续4天。测定小鼠在定位航行实验和空间探索实验中的逃避距离、 逃避潜伏期。
[0067] 结果：在Morris水迷宫实验中，与空白组比较，LPS组小鼠定位航行实验第4天的 逃避潜伏期和逃避距离明显增加。与LPS组比较，柴胡皂苷a高中低剂量组和阳性药盐酸 多奈哌齐组在第4天的逃避潜伏期和逃避距离明显降低。各组动物在实验期间的游泳速度 无明显差别。实验结果表明，柴胡皂苷a能够明显增加LPS诱导的学习记忆损伤小鼠的空 间学习记忆能力。
[0068] 实施例6 :筑巢实验考察柴胡皂苷a对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠筑巢能力的 影响；结果如图5所示，
[0069] 材料动物：ICR雄性小鼠，18_22g;
[0070] 药物：LPS;柴胡皂苷a;
[0071] 方法：取ICR小鼠，随机分为6组，每组12只：空白对照组，模型对照（LPS)组，柴 胡皂苷a高中低剂量组和阳性对照组（盐酸多奈哌齐）。各组动物用水合氯醛轻微麻醉后 固定头部，进行侧脑室注射。模型组、柴胡皂苷a低剂量（2mg/kg)组、柴胡皂苷a中剂量 (4mg/kg)组、柴胡皂苷a高剂量（8mg/kg)组和阳性对照组（5mg/kg)注射LPS溶液（5mg/ ml，3y1/只），空白对照组小鼠注射等体积的生理盐水。自LPS注射后次日起，各柴胡皂苷 a剂量组小鼠根据其体重的大小每天灌胃柴胡皂苷a溶液，阳性对照组的小鼠每天灌胃盐 酸多奈哌齐溶液，空白组和模型组的小鼠每天灌胃给予等体积的生理盐水。第15天开始进 行筑巢实验。
[0072] 结果：在筑巢实验中，侧脑室注射LPS能够使小鼠的筑巢能力明显下降，表现为小 鼠的巢穴松散，面积大，不牢固。柴胡阜苷a(2-8mg/kg)和阳性药盐酸多奈哌齐5mg/kg治 疗后能够明显增加学习记忆损伤小鼠的筑巢能力，表现为小鼠巢穴紧凑且牢固，巢穴正中 有浅窝。
[0073] 表1柴胡皂苷对小胶质细胞炎症因子NO和ROS释放的影响
[0074]
[0075]与空白组比较**P<0? 01，***P<0? 001;与LPS组比较## #P< 0? 001
[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种柴胡皂苷类化合物在制备治疗神经退行性疾病药物中应用，其特征在于，该柴 胡皂苷类化合物在制备治疗神经退行性疾病药物中应用包括五种柴胡皂苷类化合物分别 为柴胡皂苷a、柴胡皂苷bl、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d。2. 如权利要求1所述的柴胡皂苷类化合物在制备治疗神经退行性疾病药物中应用， 其特征在于，制备得到的治疗神经退行性疾病药物包含柴胡皂苷a、柴胡皂苷bl、柴胡皂苷 b2、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d五种柴胡皂苷类化合物中的一种或几种。3. 如权利要求1所述的柴胡皂苷类化合物在制备治疗神经退行性疾病药物中应用，其 特征在于，治疗神经退行性疾病药物在抑制神经炎症方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了柴胡皂苷类化合物在制备治疗神经退行性疾病药物中应用，这五种柴胡皂苷类化合物分别为柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d；柴胡皂苷a、b1、b2、c、d可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症因子NO和ROS的释放；柴胡皂苷a能够使LPS诱导的学习记忆损伤小鼠的逃避潜伏期和逃避距离明显降低；在筑巢实验中，柴胡皂苷a能够明显增强LPS诱导的学习记忆损伤小鼠的筑巢能力；上述结果表明柴胡皂苷a对LPS诱导的AD小鼠学习记忆损伤具有明显的保护作用。因此，本发明中的柴胡皂苷a、b1、b2、c、d可用于神经退行性疾病的治疗和抑制神经炎症。
【IPC分类】A61K31/704, A61K31/7048, A61P25/00
【公开号】CN105079016
【申请号】CN201410737483
【发明人】李娟 , 姚遥, 李玮琦, 孙娜, 水栋
【申请人】宁夏医科大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年12月1日