一种抗流感病毒的珍珠菜提取物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药提取物领域，具体涉及一种珍珠菜提取物及含有该提取物的药物 制剂，该提取物可以应用于抗流感病毒领域，治疗和预防流行性感冒。
【背景技术】
[0002] 从天然产物中寻找结构新颖或药理作用独特的生物活性物质，并以此为先导化合 物通过结构改造等方法发现新药已是公认的新药研发的重要手段之一。在1981-2010年 间批准上市的1073种小分子药物中，有50%来源于天然产物或者与天然的先导结构有关。 自上世纪开始，许多在临床上广泛应用的药物均从天然产物中发掘出来，如青蒿素、紫杉醇 等。
[0003] 我国运用天然药物具有悠久的历史，并形成了自己独特医学理论，很多传统的中 药方剂至今还在临床应用中表现出良好的效果。与此同时，我国地域广阔，各地气象差异悬 殊，天然产物资源丰富，种类繁多，中药资源更是多达12000多种。因此，随着天然药物愈来 愈受到重视，从中草药中提取活性化学成分，经药理、临床试验确定其疗效，然后制成各种 制剂供临床使用，已经成为我国加入WT0以后，发现自主知识产权新药、壮大我国医药产业 的重要手段。
[0004] 珍珠菜LysimachiaclelhroidesDuby为报春花科珍珠菜属植物，又名扯根菜，红 根草等。全草入药，广泛分布于华北及长江以南各省区，具有清热解毒、活血调经、利水消肿 等功效，在民间用于治疗水肿、热淋、黄疽、带下、经闭、跌打骨折、乳痛疗拖、蛇咬伤等。现代 科学研宄证明珍珠菜属主要化学成分为黄酮和三萜皂苷，还有苯骈内酯、醌类、酚酸、生物 碱、甾体皂苷及木脂素等，主要具有细胞毒、抗菌消炎、免疫调节等多种生物活性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种珍珠菜提取物，其制备方法和液相分析方法，含有该 提取物的药物制剂及利用该提取物制备抗流感病毒药物的用途。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] -种珍珠菜提取物，该提取物由以下方法制备：
[0008] (a)将干燥的珍珠菜用70 %乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得 到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤（a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用15%乙醇冲洗8个 柱体积除去大极性成分，再用70 %乙醇洗脱10个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩，即得 珍珠菜提取物。
[0009] 进一步地，步骤（C)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
[0010] 为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同批次制备的提取物的批间差 异，所述提取物的液相分析方法为：
[0011] 色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18 柱（4. 6mmX250mm，5ym);
[0012] 流动相：A为乙腈，B为0. 4%磷酸溶液；
[0013] 梯度洗脱程序：0? 01 ~lOmin，A10%- 15% ;10 ~30min，A15%-48% ;30 ~ 55min，A48%- 78% ;55 ~65min，A78%- 10% ;
[0014] 流动相流速：1.OmL?minS
[0015] 检测波长：260nm;
[0016] 柱温：30°C;
[0017] 进样量：10yL。
[0018] 药物制剂，含有治疗有效量的所述提取物和药学上可接受的载体。
[0019] 所述的提取物在制备抗流感病毒的药物中的应用。
[0020] 所述的药物制剂在制备抗流感病毒的药物中的应用。
[0021] 本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。
[0022] 所述药物制剂含有治疗有效量的本发明珍珠菜提取物，其余为药物学上可接受 的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0023] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0024] 本发明的优点：本发明通过对珍珠菜进行提取、除杂、富集处理，能得到具有抗流 感病毒作用的提取物；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用 于控制不同批次制备的提取物的批间差异。
【附图说明】
[0025] 图1为珍珠菜提取物HPLC液相图谱。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0027] 实施例1 :提取物制备
[0028] 药材来源：珍珠菜购自安徽亳州中药材市场，产地河北。
[0029] 主要试剂：食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；医药级AB-8大孔树脂购 自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级，购于TEDIA;85 %磷酸为HPLC级，购于TEDIA; 色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。
[0030] 制备方法：将10kg干燥的珍珠菜用70%乙醇溶液热回流提取（25LX3次），合 并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液（2. 5L);将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至 4L，依次用石油醚（4LX3次）、乙酸乙酯（4LX3次）和水饱和的正丁醇（4LX3次）萃取， 减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物258g; (c)正丁醇萃取 物用1. 5L水溶解，医用脱脂棉过滤，用AB-8大孔树脂（2kg，柱体积1. 5L)富集活性成分，先 用15 %乙醇冲洗8个柱体积（12L)除去大极性成分，再用70 %乙醇洗脱10个柱体积（15L)， 收集70%洗脱液，减压浓缩，即得珍珠菜提取物123g。
[0031] 实施例2:液相色谱分析
[0032] 供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加 30mL10%乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加10%乙腈水溶液定容。
[0033] 分析方法：
[0034] 高效液相色谱仪：Agilent1260,二元栗；
[0035] 色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18 柱（4. 6mmX250mm，5ym);
[0036] 流动相：A为乙腈，B为0. 4%磷酸溶液；
[0037] 梯度洗脱程序：0? 01 ~lOmin，A10%- 15% ;10 ~30min，A15%-48% ;30 ~ 55min，A48%- 78% ;55 ~65min，A78%- 10% ;
[0038] 流动相流速：1.OmL?minS
[0039] 检测波长：260nm;
[0040] 柱温：3(TC;
[0041] 进样量：1〇yL。
[0042] 用制备的10批次的珍珠菜提取物进行分析，进行色谱峰匹配，结果1~7号峰在 10批样品色谱图中均出现。因此标定7个峰为共有色谱峰，据此建立该提取物的HPLC质量 控制图谱，结果见图1。该10批次的珍珠菜提取物药理活性相似。
[0043] 实施例3 :提取物药理试验
[0044] 一、材料与方法
[0045] 1、药物及试剂：
[0046] 珍珠菜提取物按实施例1方法制备；病毒唑：浙江亚太药业股份有限公司生产，批 号：130901。
[0047] 2、动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体重20~24g，SPF级，由广东省医学实验动物中 心提供，动物合格证号：粵监证字2013A018。
[0048] 3、病毒株及细胞：甲型流感病毒、流感病毒亚甲型鼠肺适应株（FM1)，购自中国预 防医学科学院病毒学研究所;MDCK细胞株，购自中山大学实验动物中心细胞室。
[0049] 4、细胞培养液和维持液：细胞培养液为含100U/mL的青霉素、100yg/mL的链霉素 和10%胎牛血清的DMEM培养液；细胞维持液除含2%胎牛血清外，其他成分同培养液。
[0050] 5、方法
[0051 ] (1)珍珠菜提取物在体外对MDCK培养细胞的毒性试验
[0052] 将珍珠菜提取物母液用细胞培养液做等比稀释后，加到已长成单层MDCK细胞培 养板中，100yL/孔，每个稀释度药液做4个复孔