，同时设正常细胞对照、病毒对照和病毒唑 对照。将培养板置37°C5%C02培养箱中培养4d，每日于倒置显微镜下观察细胞病变情况。 按Reed-Muench法计算半数细胞毒性浓度（TCJ。
[0053] (2)珍珠菜在体外对流感病毒所致细胞病变的影响（CPE法）
[0054] 取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，加入相应稀释度的药液，100yL/孔， 每个稀释度平行做4个复孔。置37°C5%C02培养箱中作用lh后倒掉药液，接种100倍 TCID5。（半数感染量）的病毒液，50yL/孔，置37°C5%C02培养箱中吸附lh后倒掉病毒液， 用细胞维持液冲洗细胞2次，再加入相应稀释度的药液，同时设病毒对照、病毒唑对照及正 常细胞对照，置37°C5%C02培养箱中培养，每日于倒置显微镜下观察细胞病变情况。细胞 病变程度（Cytopathiceffect，CPE)按以下6级标准判断为细胞生长正常，无病变出 现；" 土"为细胞病变占整个单层细胞的0%~10% "为细胞病变约占整个单层细胞的 10%~25% 为细胞病变约占整个单层细胞的25%~50% ;"+++"为细胞病变约占 整个单层细胞的50%~75% ;"++++"为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。当病毒 对照组细胞病变为"++++"时记录实验结果，经秩和检验与病毒对照组比较P〈〇. 05 (CPE为 "++"以下）判断为有效。并按Reed-Muench计算半数有效浓度（IC50)和治疗指数（TI)。 TI=TC50/IC50。
[0055] (3)珍珠菜提取物体内对小鼠流感病毒性肺炎的影响
[0056] 取昆明种小鼠60只，随机分成正常对照组、病毒感染对照组、病毒唑组、珍珠菜提 取物低、中、高3个剂量组，共6组，每组10只。除正常对照组外，其余各组小鼠用乙醚轻 度麻醉，选用流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1的15个LD5。病毒浓度，滴鼻感染小鼠，每只 0. 05mL。从感染前Id开始按0.lmL/10g的剂量灌胃给药每天2次，连续5d，病毒感染对照 组以等体积蒸馏水灌胃。第6d称取小鼠体重后解剖，肉眼观察肺部病变，记录肺部肝样实 变的程度，摘取全肺称重，与体重计算肺指数值，并求出肺指数抑制率。计算公式如下：
[0057] 肺指数=[肺重（g)/体重（g)]X100%
[0058] 肺指数抑制率=(病毒对照组肺指数均值-试验组肺指数均值）/病毒对照组肺 指数均值X100%
[0059] (4)珍珠菜提取物对流感病毒致小鼠死亡的影响
[0060] 取昆明种小鼠90只，随机分成病毒感染对照组、病毒唑组、珍珠菜提取物低、中、 高3个剂量组，共5组，每组18只。各组小鼠用乙醚轻度麻醉后，以2个LD5。病毒浓度的流感 病毒亚甲型鼠肺适应株FM1病毒液滴鼻感染，每只0. 05mL。从感染前Id开始按0.lmL/10g 的剂量灌胃给药，每天2次，连续5d，病毒感染对照组以等体积蒸馏水灌胃。观察并记录感 染后小鼠的死亡数，计算死亡率、保护率、平均存活天数及生命延长率。计算公式如下：
[0061] 死亡保护率=(病毒感染对照组死亡率-试验组死亡率）/病毒感染对照组死亡 率
[0062] 生命延长率=(试验组平均存活天数-病毒感染对照组平均存活天数/病毒感染 对照组平均存活天数）X100%
[0063] (5)统计学方法
[0064] 采用SPSS10. 0软件包进行统计分析，肺指数值、存活天数的比较采用组间t检验； 保护率的比较用x2检验。
[0065] 二、结果分析
[0066]1、珍珠菜提取物体外抗流感病毒作用
[0067] 实验结果表明，较大浓度的珍珠菜提取物对MDCK细胞具一定毒性，主要表现为细 胞增殖缓慢、颗粒增多、形态改变、折光性增强等，其TC5。生药为24. 91mg/ml;珍珠菜提取物 在体外能抑制流感病毒所致的细胞病变，其IC5。生药为3. 33mg/ml。提示珍珠菜提取物在 体外对流感病毒具有抑制作用，其TI为7. 48。
[0068] 2、珍珠菜提取物对小鼠流感病毒性肺炎的影响
[0069] 由表1可见，珍珠菜提取物低、中、高剂量组小鼠的肺指数值明显低于病毒感染对 照组，与病毒感染对照组比较有显著性差异（P〈〇. 01或〇. 05)，提示珍珠菜提取物对流感病 毒引起的小鼠肺部炎症有明显抑制作用。注：与正常对照组比较，##P〈〇. 01 ;与病毒感染对 照组比较，*P〈〇. 05,，〈0. 01。
[0070] 表1珍珠菜提取物对小鼠流感病毒性肺炎的影响
[0071]
[0072] 3、珍珠菜提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
[0073] 由表2可见，在小鼠感染流感病毒后，病毒感染对照组94. 4%动物出现死亡，平均 存活8.Id。而低、中、高剂量珍珠菜提取物能明显抑制流感病毒感染所致的小鼠死亡（珍 珠菜提取物低、中、高剂量组死亡率与病毒感染对照组比较，P〈〇. 01或〇. 05)，且能明显延 长小鼠的平均存活天数（珍珠菜提取物低、中、高剂量组存活天数与病毒组比较，P〈〇. 01或 〇. 05)，提示中药珍珠菜提取物对流感病毒致小鼠死亡有明显保护作用。注：与病毒感染对 照组比较，*P〈〇. 05,，〈0. 01。
[0074] 表2珍珠菜提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
[0075]
[0076] 实施例4 :片剂的制备
[0077] 按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂， 制粒压片。
[0078] 实施例5 : 口服液的制备
[0079] 按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。
[0080] 实施例6 :胶囊剂或颗粒剂的制备
[0081 ] 按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制 成胶囊或颗粒剂。
[0082] 实施例7 :注射液的制备
[0083] 按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
[0084] 实施例8 :无菌粉针的制备
[0085] 按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗 过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
【主权项】
1. 一种珍珠菜提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备： (a)将干燥的珍珠菜用70 %乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙 醇提取浓缩液；(b)将步骤（a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和 水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物；（c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用15%乙醇冲洗8个柱 体积除去大极性成分，再用70 %乙醇洗脱10个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩，即得珍 珠菜提取物。2. 根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤（c)中所述大孔树脂为AB-8型大 孔树脂。3. 根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为： 色谱柱：AgilentZorbaxSB_C18 柱（4.6mmX250mm，5iim); 流动相：A为乙腈，B为0. 4%磷酸溶液； 梯度洗脱程序：〇? 01 ~l〇min，A10%- 15% ;10 ~30min，A15% - 48% ;30 ~55min， A48% - 78% ;55 ~65min，A78%- 10% ; 流动相流速：1. OmL ? min S 检测波长：260nm ; 柱温：30°C ; 进样量：10 yL。4. 药物制剂，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1所述的提取物和药学上可接 受的载体。5. 权利要求1所述的提取物在制备抗流感病毒的药物中的应用。6. 权利要求4所述的药物制剂在制备抗流感病毒的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种抗流感病毒的珍珠菜提取物，提取物制备方法包括：(a)将干燥的珍珠菜用70％乙醇溶液热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用大孔树脂富集活性成分，先用15％乙醇冲洗8个柱体积除去大极性成分，再用70％乙醇洗脱10个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，即得珍珠菜提取物。该提取物具有抗流感病毒作用，可以开发成抗流感病毒的药物。
【IPC分类】A61K36/185, A61P31/16
【公开号】CN105106254
【申请号】CN201510560415
【发明人】林天样
【申请人】林天样
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月5日