缓慢加入C混合液混合； E、 将细胞置于37 °C细胞培养箱培养5小时后，更换为含10%血清的全培养基进行培 养； F、 加入嘌呤霉素(嘌呤霉素，2 μ g/mL)筛选，设置对照(未进行转染的p53 /的小鼠 MEF 细胞，在未转染时对嘌呤霉素没有抗性，加入嘌呤霉素后死亡，质粒上带有嘌呤霉素抗性标 签)，筛选2周后可得稳定转染细胞； (3)筛选活性组分的方法：在稳定转染了 p53-GFP细胞中加入DMEM(10% FBS)体外传 代培养。取两种细胞各2皿，吸去上清，加5mL PBS (磷酸盐缓冲液)清洗一次，胰酶消化后， 加4mL培养基，收集细胞入离心管1200rpm，5min离心，弃上清，加7mL无血清的DMEM培养 基，重悬浮，取100 μ L进行细胞计数，按细胞数I X IO5每孔种入6孔板过夜培养，在细胞融 合率达到70%左右加入抗肿瘤化合物20 μ g/ml的华绒苞藤提取物活性组分进行处理，72 小时后观察细胞的荧光变化。
[0018] 实验结果：见图1、2,在20 μ g/ml的浓度下，72小时后华绒苞藤提取物活性组分 可以明显激活p53 / -p53-GFP MEF细胞中GFP荧光的表达。图1中A、B分别为阴性对照1% DMSO的微分干涉相差图DIC和GFP荧光图；图2中A、B分别为药物处理20 μ g/ml华绒苞 藤提取物活性组分的微分干涉相差图DIC和GFP荧光图。
[0019] 实施例3:实施例1的华绒苞藤提取物活性组分对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用， 对正常细胞（WT-MEF细胞）杀伤作用较弱 SRB (Sulforhodamine B，SRB)是一种粉色阴离子结合染料；它能特异性地与活细胞中 生物大分子的碱性氨基酸结合，在540nm波长处用酶联检测仪测定其吸光值，吸光值的大 小则表示活细胞的相对数量。与MTT相比SRB染色不容易变色，稳定性较好，细胞固定后以 及用用Tris-base溶解后也能保存较长时间，所以吸光值不会受到太大的影响。此外，在测 定带色素的药物时因为含有洗脱的过程，可以较大程度上排除色素的影响。本实验采用SRB 检测华绒苞藤提取物活性组分对A549细胞、HT29细胞和WT-MEF细胞增殖能力的影响。
[0020] 实验主要材料：A549细胞，HT29细胞，WT-MEF细胞，SRB染料 实验操作：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，将A549细胞和HT29细胞接种到96 孔板上，2500个/孔，WT-MEF接种5000个/孔，每孔溶液终体积200 μ L (边缘孔用培养 基填充)，5%C02, 37°C培养，12h后分别加入浓度梯度的本发明活性组分，对于肿瘤细胞活性 组分设置 6 个浓度，分别为 0 μ g/ml、0· 5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml、8 μ g/ml，对于 WT-MEF细胞活性组分设置的浓度梯度为O μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml、20 μ g/ml、40 μ g/ ml、80 μ g/ml，设3个平行孔，5% C02,37°C培养72小时后，每孔加入100 μ 1的三氯乙酸。 于4°C层析柜中固定2h ;吸干孔板中的液体，倒扣于吸水纸上，干燥Ih ;每孔加入100 μ 1的 SRB染料，反应30min。用1%的冰醋酸洗4次，倒置在吸水纸上干燥过夜。加入200 μ 1的 IOmM的Tris-base，摇床上低速震荡lOmin，使其充分溶解。酶联检测仪检测490nm波长下 的吸光值。
[0021] 实验结果(表1):华绒苞藤提取物活性组分有显著的抑制肿瘤细胞生长活性，A549 细胞1(：5。为3.51±0.26 4 8/1111，耵29细胞1(：5。为3.80±0.05 4 8/1111，对町-]\^?细胞的 抑制较弱，IC5。为14. 31 ±0. 34 μ g/ml，说明该活性组分对p53为野生型和突变型的肿瘤细 胞均具有潜在的抗肿瘤作用，对正常细胞(WT-MEF细胞）杀伤作用较弱。
[0022] 表1 :华绒苞藤提取物活性组分的选择性抗肿瘤活性结果
[0023] 实施例4:实施例1华绒苞藤提取物活性组分增加 A549细胞中p53蛋白的表达 实验主要材料：A549细胞 实验操作： 不同浓度（2. 5 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml)华绒苞藤提取物活性组分处理培养72h后 的A549细胞用0. 25%的胰蛋白酶消化，1500rpm/min离心5min，用PBS洗3次，加入细胞裂 解液。用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶对细胞样品进行电泳，电泳结束后将蛋白转移至聚偏二氟 乙烯膜（PVDF膜，MILLIPORE，美国），用含5%脱脂奶粉的TBS封闭lh，加入一抗（GAPDH购自 美国MILLIPORE生物技术公司，p53购自美国CST生物技术公司）4°C过夜，用TBS冲洗3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（GE，美国），室温2h。用化学发光检测系统(北京六一 生物技术有限公司，中国）检测。
[0024] 实验结果：与DMSO对照组相比，华绒苞藤提取物活性组分能够明显增加 A549中 P53蛋白的表达，并且具有一定的浓度依赖性（图3)。
[0025] 实施例5:华绒苞藤提取物活性组分的制备 原料来源同实施例1，具体步骤为： (1) 粉碎和浸提 将Ikg云南药用植物华绒苞藤地上部分晒干粉碎后，用IOL甲醇(药用级）室温下浸提 4天(偶尔震荡)，抽滤滤液浓缩后，再用乙酸乙酯（800ml)和水（500ml)萃取三次，将三次水 层萃取液合并后浓缩，得到水层浸膏备用； (2) 分离和纯化 将水层浸膏经非极性大孔树脂AB-8柱分离（以下溶剂系统均按体积比，乙醇：水 =0:100 ;40:60 ;80:20 ;100:0)，所需活性组分主要在乙醇：水=80 : 20的洗脱部分，合并 浓缩该部位，得到活性组分粗提取Fr-3(3. lg)。将Fr-3组分用水（20mL)溶解，甲醇（50mL) 沉淀，过滤，并用甲醇洗涤沉淀3次，得沉淀Fr-3c (0. 128g)。Fr-3c经过ODS柱色谱分离， 溶剂系统为甲醇：水（〇:1〇〇,50:50,80:20，100:0)，收集合并甲醇 ：水=80:20的洗脱部分， 浓缩，得到华绒苞藤活性提取物（47mg)。
[0026] 经上述方法制备得的活性组分，呈白色，无味，易溶于水，溶于二甲基亚砜，微溶于 乙醇和甲醇，用TLC分析时，以氯仿：甲醇=1:1为展开剂，在高为5cm正向Silica板上，其 Rf值约为〇. 5-0. 6,该样品在210nm波长下具有显著的紫外吸收峰，华绒苞藤中的含量是 0· 05%0〇
[0027] 实施例6:实施例5华绒苞藤提取物活性组分激活p53 / -p53-GFP MEF细胞中GFP 荧光实验，具体实验操作同实施例2: 实验结果：见图4、5,在20 μ g/ml的浓度下，72小时后华绒苞藤提取物活性组分可以 明显激活p53 / -p53-GFP MEF细胞中GFP荧光的表达；图4中A、B分别为阴性对照1% DMSO 的微分干涉相差图DIC和GFP荧光图；图5中A、B分别为药物处理20 μ g/ml华绒苞藤提取 物活性组分的微分干涉相差图DIC和GFP荧光图。
[0028] 实施例7:实施例5华绒苞藤提取物活性组分对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，对 正常细胞（WT-MEF细胞）杀伤作用较弱 具体实验操作同实施例3: 实验结果(表2):华绒苞藤提取物活性组分有显著的抑制肿瘤细胞生长活性，A549细胞 IC5。为 3. 67 ±0. 29 μ g/ml，HT29 细胞 IC5。为 3. 68 ±0. 08 μ g/ml，对 WT-MEF 细胞的抑制较 弱，IC5。为15. 47±0. 26 μ g/ml，说明该活性组分对p53为野生型和突变型的肿瘤细胞均具 有潜在的抗肿瘤作用，对正常细胞(WT-MEF细胞）杀伤作用较弱。
[0029] 表2 :华绒苞藤提取物活性组分的选择性抗肿瘤活性结果
[0030] 实施例8:实施例5华绒苞藤提取物活性组分增加 A549细胞中p53蛋白的表达 具体实验操作同实施例4: 实验结果：与DMSO对照组相比，华绒苞藤提取物活性组分能够明显增加 A549中p53蛋 白的表达，并且具有一定的浓度依赖性（图6)。
【主权项】
1. 一种华绒苞藤提取物的制备方法，其特征在于按如下步骤进行： (1) 粉碎和浸提 将植物华绒苞藤粉碎后，用药用级甲醇室温浸提4-5天，抽滤，滤液浓缩，得甲醇浸提 物粗样，用乙酸乙酯和水萃取分离，得到水层浸膏； (2) 分离和纯化 将水层浸膏经过非极性大孔树脂柱色谱分离，溶剂系统为乙醇-水混合液，收集合并 乙醇：水体积比为8:2的洗脱部分，浓缩，得到华绒苞藤粗提物，将粗提物用水溶解，甲醇沉 淀，过滤，并用甲醇洗涤沉淀3次，沉淀经过ODS柱色谱分离，溶剂系统为甲醇-水混合液， 收集合并甲醇：水体积比为8:2的洗脱部分，浓缩，得到华绒苞藤提取物。2. 权利要求1所述华绒苞藤提取物的制备方法制得的提取物在制备抗肿瘤个性化治 疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种从云南特色植物华绒苞藤中提取的活性提取物的制备方法，该提取物通过有机溶剂浸提、萃取、开口色谱组分离得到，该提取物具有显著的抗肿瘤活性，能够靶向激活肿瘤抑制基因p53，同时对正常细胞无明显毒性，这一特性表明这种新型云南特色植物华绒苞藤的活性提取物组分可在制备低毒、高效的抗肿瘤个性化治疗药物中具有应用潜力。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/85
【公开号】CN105125748
【申请号】CN201510609261
【发明人】罗瑛, 李晚谊, 刘静, 张继虹, 黄文卉, 潘俊, 李智敏, 唐文如, 贾舒婷, 吴晓明, 周若宇, 盛苗苗
【申请人】昆明理工大学, 云南省农业科学院药用植物研究所
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月23日