一种华绒苞藤提取物的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种云南特色植物华绒荀藤（(?/??? cAifleftsis) 提取物的制备方法及其在制备选择性抗肿瘤治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是一类严重威胁人类健康的致死性疾病，其发病机制尚未完全阐明，治疗效 果亦不尽人意。目前常规用于肿瘤治疗的大部分药物，均是针对细胞增殖过程中DNA复制 或细胞骨架的调控来设计的。这些药物在对快速增殖的肿瘤细胞进行杀伤的同时，对人体 功能维持所需的正常增殖细胞(如骨髓干细胞等等）也有很大的毒性，导致接受治疗的病人 机体正常功能严重受损，对于肿瘤的抵抗能力反而下降，难以取到很好的治疗效果。因此， 利用分子靶向筛选技术，针对肿瘤细胞特异性基因突变产物，筛选可以抑制这些肿瘤特异 突变分子活性或表达水平的小分子化合物，从而开发形成低毒、高效的靶向个性化治疗药 物，已经成为肿瘤治疗药物研发的最新趋势。已证实突变P53为抗肿瘤药物的靶点，目前， 针对突变P53为靶点设计的抗肿瘤药物研究已经进入临床试验。因此，开发具有自主知识 产权的低毒、高效的靶向个性化治疗药物，也成为国内肿瘤转化医学研究者的重要方向。
[0003] 正常情况下细胞内p53蛋白的含量很低，而突变p53在肿瘤细胞中通常有较高水 平的表达，从而成为区别于正常细胞的一个特异性抗肿瘤靶点。目前，针对突变P53的治疗 方法主要是依靠在肿瘤细胞中重新激活野生型P53的表达或将突变p53恢复成野生型p53 的办法，还有就是靶向突变p53使其降解的策略来靶向突变p53的治疗，主要是多肽，小分 子化合物等，这些化合物都是国外根据P53的结构设计发现的，本发明主要是从云南省特 有的植物资源分离提取发现具有能激活野生型P53的化合物。将p53启动子连接GFP报 告基因的检测方法可通过检测荧光的变化直观的筛选出能作用于P53启动子的化合物，特 别是将此系统运用到植物化合物的筛选报道很少。
[0004] 云南省是世界生物多样性的热点地区之一，各种生物种类占全国的50%以上，为 天然药物的研究和开发提供了重要的物质基础。同时云南26个民族在与疾病的长期斗争 中积累了丰富的民族民间用药经验，为云南天然药物研究提供了宝贵的传统知识、药物背 景信息和资料，也为我们开发和研究靶向治疗肿瘤的天然药用植物提供了丰富的来源。
[0005] 华绒荀藤（(???? 产自云南屏边和西双版纳，常生长在海拔 700-1450米的沟谷林边，主要作为观赏植物。迄今为止，未见关于华绒苞藤提取物活性组分 有抗肿瘤活性的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明为了拓展云南特色植物研究的新领域，充分利用我国植物资源，开发其新 用途，提供了一种华绒苞藤提取物的制备方法；通过以下步骤实现： (1)粉碎和浸提 将植物华绒苞藤粉碎后，用药用级甲醇室温浸提4-5天，抽滤，滤液浓缩，得甲醇浸提 物粗样，用乙酸乙酯和水萃取分离，得到水层浸膏； (2)分离和纯化 将水层浸膏经过非极性大孔树脂柱色谱分离，溶剂系统为乙醇-水混合液，收集合并 乙醇：水体积比为8:2的洗脱部分，浓缩，得到华绒苞藤粗提物Fr-3组分，将粗提物Fr-3 组分用水溶解，甲醇沉淀，过滤，并用甲醇洗涤沉淀3次，沉淀经过ODS柱色谱分离，溶剂系 统为甲醇-水混合液，收集合并甲醇：水体积比为8:2的洗脱部分，浓缩，得到华绒苞藤提 取物。
[0007] 该提取物呈白色，无味，易溶于水，溶于二甲基亚砜，微溶于乙醇和甲醇，用TLC分 析时，以氯仿：甲醇=1:1为展开剂，在高为5cm正向Silica板上，其Rf值约为0. 5-0. 6,该 样品在210nm波长下具有紫外吸收峰，华绒苞藤中的含量是0. 05%。。
[0008] 本发明的另一个目的是将上述提取物应用于制备抗肿瘤个性化治疗药物，制备对 正常细胞无毒性的药物。
[0009] 本发明所述的提取物对野生型小鼠的胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF)无明显的细胞毒性。
[0010] 本发明的有益效果在于： (1) 有机溶剂浸提、溶剂分配、开口色谱柱分离得到，制备方法具有简单快速等优点； (2) 本发明利用转基因小鼠细胞重组靶向基因构建P53启动子-GFP分子报告载体靶向 筛选鉴定一种云南特色植物华绒苞藤提取物活性组分对P53基因的激活情况；研究数据表 明，该组分能够明显激活GFP荧光，具有潜在的抗肿瘤活性； (3) MEF作为对照细胞，这种正常对照细胞在药物筛选体系中的应用可以排除因为细胞 毒性作用导致的细胞杀伤效应，筛选对肿瘤细胞有选择性杀伤，而对正常细胞没有毒性的 天然活性物质； (4) 细胞药理学实验证明，华绒苞藤提取物可以杀死大部分的肿瘤细胞，而对MEF细胞 毒性较小，说明其抗肿瘤作用具有良好的选择性。
[0011] 本发明开拓了华绒苞藤提取物活性组分新的药物用途，为肿瘤的个性化治疗提供 新的低毒、高效的药物。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明中阴性对照1% DMSO的微分干涉相差图DIC (A图)和GFP荧光图（B 图）； 图2是加入实施例1华绒苞藤提取物活性组分经72小时处理后p53 / -p53-GFP MEF细 胞的微分干涉相差图DIC (A图）和GFP荧光图（B图）； 图3是加入实施例1华绒苞藤提取物活性组分，经72小时处理后，A549细胞中p53蛋 白表达明显增多； 图4是本发明中阴性对照1% DMSO的微分干涉相差图DIC (A图)和GFP荧光图（B图)； 图5是本发明实施例5中华绒苞藤提取物活性组分的微分干涉相差图DIC (A图）和 GFP荧光图（B图）； 图6是本发明中实施例5华绒苞藤提取物活性组分能够明显增加 A549中p53蛋白的 表达结果。
【具体实施方式】
[0013] 下面通过对该活性组分制备实例的实施方式和附图、附表再对本发明作进一步 详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常 规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。
[0014] 实施例1:华绒苞藤提取物活性组分的制备 2014年12月从云南省屏边苗族自治县采集云南华绒苞藤地上部分样品lkg，植物种名 由云南省农业科学院药用植物研究所研究员鉴定，生药标本存放于云南省农业科学院药用 植物研究所。
[0015] 从植物华绒苞藤中获得具有显著抗肿瘤活性的活性组分的制备方法，具体步骤 为： (1) 粉碎和浸提 将Ikg云南药用植物华绒苞藤地上部分晒干粉碎后，用IOL甲醇(药用级）室温下浸提 5天(偶尔震荡)，抽滤滤液浓缩后，再用乙酸乙酯（400ml)和水（400ml)萃取三次，将三次水 层萃取液合并后浓缩，得到水层浸膏备用； (2) 分离和纯化 将水层浸膏经非极性大孔树脂DlOl柱分离（以下溶剂系统均按体积比，乙醇：水 =0:100 ;40:60 ;80:20 ;100:0)，所需活性组分主要在乙醇：水=80 : 20的洗脱部分，合并 浓缩该部位，得到活性组分粗提取Fr-3(3. 2g)。将Fr-3组分用水（20mL)溶解，甲醇（50mL) 沉淀，过滤，并用甲醇洗涤沉淀3次，得沉淀Fr-3c (0. 137g)。Fr-3c经过ODS柱色谱分离， 溶剂系统为甲醇：水（〇:1〇〇,50:50,80:20，100:0)，收集合并甲醇 ：水=80:20的洗脱部分， 浓缩，得到华绒苞藤活性提取物（50mg)。
[0016] 经上述方法制备得的活性组分，呈白色，无味，易溶于水，溶于二甲基亚砜，微溶于 乙醇和甲醇，用TLC分析时，以氯仿：甲醇=1:1为展开剂，在高为5cm正向Silica板上，其 Rf值约为〇. 5-0. 6,该样品在210nm波长下具有显著的紫外吸收峰，华绒苞藤中的含量是 0· 05%0〇
[0017] 实施例2:实施例1华绒苞藤提取物活性组分激活p53 / -p53-GFP MEF细胞中GFP 荧光实验，具体实验操作如下： (1) P53-GFP-报告载体的构建，具体方法如下： 1) 采用BgLII及NotI双酶切将绿色荧光蛋白GFP报告基因从pAcGFPl-Nl质粒(购 买于Clontech)上切下，替换掉pGL4. 82 (购买于Promega)中Luciferase报告基因，制得 pGL4 -GFP 载体； 2) 设计 p53 基因启动子区引物（5'TGGCTCGAGGTCTTTACAGAGAGTG3'， 5' CGAGATCTCGGAGAAGCGTGACA 3'）扩增启动子序列并连入pGL4 -GFP载体，这样就得到以 P53基因启动子与GFP融合的报告载体-----P53-GFP-报告载体； (2) 将p53基因启动子与GFP融合的报告载体转入小鼠成纤维细胞（MEF)中，具体方法 如下： 1)通过TIANGEN BIOTECH质粒大提试剂盒提取质粒得到pGL4. 82-p53promoter-GFP质 粒，并测定其浓度； 2)培养p53 /的小鼠 MEF细胞，常规条件下培养即DMEM培养基与10%FBS (胎牛血 清)，转染前按每皿2 X IO6个（IOcm)-天传代，第二天在细胞汇合率到达90%时用脂质体转 染试剂Lipofectamine?2000 (购买于Invitrogen)进行转染，具体内容如下： A、 将24 μ g pGL4. 82-p53promoter_GFP质粒加入到3mL无胎牛血清的DMEM培养基中， 得到A混合液； B、 将60 μ L Lipofectamine2000加入3mL无血清的DMEM培养基，室温下放置20分钟， 得到B混合液； C、 将A液与B液混合，配成24 μ g质粒：60 μ L Lipofectamine2000混合液，轻柔混勾 后，室温下放置20分钟，得到C混合液； D、 吸去p53 /的小鼠 MEF细胞培养皿中的培养基并用IXPBS缓冲液清洗两次，加入 3mL无血清DMEM培养基，并