ocheFastStartUniversalProbeMaster(Rox)W及ABIhglVIan probes(C0L1A1，TGFB1，ACTA2,MMP2)配制成 20yl反应体系，使用ABI7500Fast Real-TimePCRSystem进行检测。结果显示，随着二氨丹参酬I剂量的增加，COLIAUTGFBI、 ACTA2、MMP2的表达量降低，并且在10ymmol/L时可在mRNA水平上显著抑制C0L1A1、 TGFB1、ACTA2、MMP2 的表达（图 1)。 阳02引 1. 3TGF0 1诱导后，继续培养24小时，6孔板中每孔加入1ml化pa裂解液（含1 % PMS巧提取蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度。W每孔25iig/20iil上样，经电泳、转膜、5% 脱脂牛奶封闭、抗体解育后，使用化emilmager5500imagingsystem获得所需蛋白条带。 结果显不，随着二氨丹参酬I浓度的升高，C0L1A1、TGFP1、a-smoothmuscleactin、MMP2、 MMP9的表达量降低，在10ymmol/L时可显著抑制上述标志物蛋白的表达（图2)。
[0029]《实施例2》SD大鼠胆总管结扎诱导的肝纤维化模型制备
[0030] 选体重在180-220g的SD雄性大鼠22只，随机分为假手术组、模型组、二氨丹参酬 I给药（25mg/kg)组，其中假手术组6只，模型组8只，二氨丹参酬I组8只。动物实验前禁 食不禁水1化后，用异氣烧麻醉动物进行手术。其中模型组和给药组行胆总管结扎度化） 术，在无菌操作台中，于上腹正中切口，抬高肝缘，拨开十二指肠，分离总胆管2-3畑1。在近 十二指肠处和近肝口处用000号手术缝合线各结扎两道，从中间剪断胆总管。假手术组仅 作上腹正中切口并缝合，不做胆总管结扎。动物麻醉清醒后，正常饮食，自由饮水，腹腔注射 青霉素及维生素K3天，W防感染和脏器出血，实验溫度（22±2)°C。造模后第2天开始腹腔 注射给药，分别给予生理盐水（假手术组、模型组）和二氨丹参酬I25mg/kg(二氨丹参酬I 给药组），每天1次，连续给药14天。
[0031]《实施例3》二氨丹参酬I对抓L诱导的大鼠血清ALT/AST/ 丫 -GT水平升高的抑制 作用
[0032] 取样前禁食不禁水12h，用10%水合氯醒麻醉大鼠，取腹主动脉血。150化pm离屯、 lOmin，取血清进行谷草转氨酶（AST)、谷丙转氨酶（ALT)和丫-谷氨酷转移酶（丫-GT)的活 性检测。结果显示，二氨丹参酬I能够明显抑制大鼠血清中ALT、AST和丫-GT的含量（表 1)，表明二氨丹参酬I能够改善大鼠肝功能。
[0033] 表1.二氨丹参酬I对抓L诱导的大鼠血清ALT/AST/丫-GT水平的影响
[0034]
[0035] 卸<0. 05与抓L组相比；邮<0. 05与假手术组相比。
[0036]《实施例4》二氨丹参酬I对抓L诱导的大鼠肝脏病理结构改变的抑制作用
[0037] 取样前禁食不禁水12h，处死大鼠，取肝脏组织，切下肝大叶组织块放入10 %福尔 马林中固定。经过脱水、石蜡包埋、切片、烤片等制作石蜡切片。使用苏木素-伊红（肥）染 色液进行染色，显微镜下观察大鼠肝脏组织病理结构变化情况。结果显示，假手术组大鼠肝 脏组织肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整，未见胆管增生；B化后大鼠肝脏组织病理结构发 生明显改变，胆管增生十分明显，组织坏死明显增多；二氨丹参酬I给药组的大鼠肝组织结 构病理改变缓解，胆管增生情况得到抑制，组织坏死程度显著降低（图3)。表明，二氨丹参 酬I能够明显改善抓L大鼠肝脏组织的病理结构。
[0038]《实施例5》二氨丹参酬I对抓L诱导的大鼠肝纤维化的抑制作用
[0039] 将石蜡切片用天狼星红染液染色，通过观察大鼠肝脏组织纤维化改变情况。结果 显示，B化后大鼠肝脏组织纤维化程度明显增加，二氨丹参酬I给药后，纤维化程度得到明 显抑制（图4)。表明，二氨丹参酬I能够明显抑制抓L诱导的大鼠肝纤维化。
[0040] 《实施例6》二氨丹参酬I对大鼠肝脏组织中径脯氨酸含量的影响
[0041] 取样前禁食不禁水12h，处死大鼠，取肝脏组织，精确称取60-100mg，按照南京建 成生物工程研究所径脯氨酸测试盒说明书进行操作。结果显示，与假手术组大鼠相比，抓L 组大鼠肝脏组织中径脯氨酸含量明显升高；与抓L组相比，给药二氨丹参酬I后，大鼠肝脏 组织中径脯氨酸含量显著降低（图5)。表明，二氨丹参酬I能够明显降低肝脏组织中径脯 氨酸的含量，即二氨丹参酬I能够明显抑制抓L大鼠中胶原纤维的产生。
[0042]《实施例7》二氨丹参酬I对抓L诱导的大鼠肝脏组织肝纤维化标志物的抑制作用
[0043] 取样前禁食12h，处死大鼠，取肝脏组织，切成小块于液氮中暂时保存，随后转移 到-80°C保存。准确称取组织重量，按照重量（g):体积（ml) = 1:10的比例加入Trizol和 化pa裂解液（含1 %PMSF)，于冰浴中研磨，制备10%肝脏组织匀浆，在3000-400化pm离屯、 l〇-15min，取匀浆上清提取总RNA及制备蛋白样品。进行Real-timePCR和WesternBlot 检测大鼠肝组织中COLlAl(Collal)、TGFPUTgfbl)、a-smoothmuscleactin(Acta2)和 MMP2(Mmp2)的表达量变化。结果显示，与假手术组的大鼠相比，B化组的大鼠肝脏组织中纤 维化标志物含量明显升高；与抓L组相比，二氨丹参酬I给药后，大鼠肝脏组织中纤维化标 志物含量显著降低（图6、图7)。表明，二氨丹参酬I能够明显抑制大鼠肝脏组织纤维化标 志物mRNA和蛋白水平的表达。
【主权项】
1. 二氢丹参酮I在制备抗肝纤维化药物中的应用。2. 权利要求1所述二氢丹参酮I为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在 制备抗肝纤维化药物中的应用。3. 权利要求1或2所述的应用，其特征是，临床用药可以制成二氢丹参酮I口服 剂型和非口服剂型；口服剂型包括片剂、胶囊、散剂、颗粒等，非口服剂型 可以是注射液针剂等。4. 权利要求1、2或3所述的应用，其特征是，二氢丹参酮I给药剂量可根据病 情轻重以及患者年龄等因素调整改变。
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及二氢丹参酮I在制备抗肝纤维化药物中的应用，通过对TGFβ1诱导LX-2细胞中纤维化主要标志物(COL1A1、TGFB1、ACTA2、MMP2)mRNA和蛋白水平的抑制作用、对BDL大鼠血清中ALT和AST含量的影响、对BDL大鼠肝脏组织病理变化的改善、对BDL大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响、对大鼠肝脏组织纤维化主要标志物mRNA和蛋白水平的抑制以及对大鼠肝纤维化程度的影响等系统研究证明，二氢丹参酮I具有良好的抗肝纤维化活性，有望研发成为新型的抗肝纤维化药物。
【IPC分类】A61K31/58, A61P1/16
【公开号】CN105213405
【申请号】CN201510742667
【发明人】邵荣光, 葛茂旭, 何红伟, 赵双双, 李娜仁, 张镱萱
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月5日