拟康氏木霉胞外多糖治疗和预防结肠癌的应用、及其联用化疗药物治疗结肠癌的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体设及拟康氏木霉胞外多糖治疗和预防结肠癌的应用、 及其联用化疗药物治疗结肠癌的应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是众所周知的严重危害人类生命健康W及威胁人类社会发展的严重疾病。随 着当今社会人类生活环境日益污染，人民生活压力的提高，人口老龄化W及人民生活日常 饮食习惯变化等导致癌症的死亡率升高。消化道肿瘤是世界范围内的常见恶性肿瘤，主要 包括胃癌、食管癌、结直肠癌W及肝癌等。
[0003] 在美国，结直肠癌在癌症发病率和死亡率中均排列第Ξ位，在2014年大约有 71830男性和65000名女性将被诊断为结直肠癌，并且将有26270名男性和24040名女性将 死于运种恶性疾病，而我国已经成为消化道肿瘤高发地区，其发病率和死亡率一直位于恶 性肿瘤前列。
[0004] 化疗药物是治疗肿瘤的传统药物，而目前临床上大部分的化疗药物在杀伤肿瘤细 胞的同时也杀死了机体正常的细胞，缺乏祀向性，对造血系统、免疫系统等造成很大伤害。
[0005]天然多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗福射等多种生物活性且毒性 很低，现已成为开发癌症治疗药物的重要来源之一。50年代末开始人们发现多糖具有抗肿 瘤活性W后，对多糖药理作用的研究逐渐开展起来。免疫调节是多糖最重要的生物学活性。 研究表明，多糖对机体的免疫调节作用，包括激活巨隧细胞，激活B细胞和T细胞，激活补 体，促进干扰素的形成，促进白细胞介素的形成，诱生肿瘤坏死因子，抑制肿瘤的作用等。
[0006]具有抗肿瘤活性的天然动物及植物多糖广泛存在于自然界中，而将其开发成为一 种新型抗肿瘤药物往往要W开发及消耗其他的天然资源为代价来获得。许多研究表明霉菌 来源的多糖也同样具有多种生物学活性，因其开发所需成本低廉、生长所需环境简单、消耗 资源少、培养易操作等优势而备受关注。自从1969年日本学者报道香茹多糖具有抗肿瘤活 性后，天然真菌多糖越来越受到国内外学者的广泛关注，之后又有约二百多种具有抗肿瘤 活性的真菌多糖陆续被发现，我国真菌资源丰富，对真菌多糖的研究近年取得很大的进展。
[0007]菌种保藏号为CGMCCNo. 1443 的拟康氏木霉（TrichodermapseudokoningU) 真菌是从玉米賴杆中分离获得的，具有很强的生长优势，液体发酵培养过程中分泌大量的 胞外多糖。中国专利文献CN101220101A(申请号为200810014047. 8)公开了一种拟康氏 木霉胞外多糖，该多糖的特征在于：（1)通过高效凝胶过滤层析检测，其具有单一对称峰， 分子量为18325 ; (2)通过改良的硫酸-苯酪法和间苯基苯酪法检测，其中性多糖含量为 65. 2%，糖醒酸含量为32. 6% ; (3)通过糖醇乙酸醋的GC分析，其单糖组成为鼠李糖、葡萄 糖和半乳糖，摩尔比为RHA :化C:GAL= 5. 6 :2. 7 :1. 0。该多糖完全还原后，鼠李糖、葡萄糖 和半乳糖的摩尔比为3齡：化(：：641=14.5:9.3:1.0，并且其含有摩尔含量为26.6%的葡 萄糖醒酸。运种拟康氏木霉胞外多糖的制备方法包括粗多糖的制备和多糖的纯化。
[0008] 目前，拟康氏木霉胞外多糖的功能性研究已成为拟康氏木霉菌研究的热点，但该 多糖对抗实体瘤，特别是抗结肠癌肿瘤活性的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的内容为拟康氏木霉胞外多糖作为治疗和预防结肠癌的应用W及拟康氏 木霉胞外多糖联合化疗药物治疗结肠癌的应用。
[0010] 所述的拟康氏木霉为CGMCCNo. 1443的拟康氏木霉灯richoderma pseudokoningii)〇
[0011] 所述的拟康氏木霉胞外多糖体内抑制结肠癌肿瘤生长的机制是通过提高肿瘤小 鼠免疫系统功能达到抗肿瘤的效果：灌胃给药后，小鼠免疫器官指数和小鼠血清中IL-2、 TNF-α水平得到了明显提高，小鼠CD8叮细胞占总T淋己细胞的比例得到提化同时拟康氏 木霉胞外多糖显著激活小鼠Τ淋己细胞和Β淋己细胞。
[0012] 本发明与现有技术相比，所述的拟康氏木霉胞外多糖可W在体内抑制结肠癌肿瘤 的生长，提高小鼠免疫脏器指数和淋己因子比-2水平，维持和促进小鼠CD8叮淋己细胞增 殖；提高了淋己因子TNF-α水平，杀伤肿瘤细胞，参与免疫调节；激活小鼠Τ淋己细胞和Β 淋己细胞，提升小鼠机体免疫力，从而达到体内抗肿瘤的目的。并且和现有化疗药物5-FU 联合用药抗肿瘤疗效明显高于单独5-RJ用药的抗肿瘤效果，同时明显改善小鼠生存质量， 对屯、、肝、肾脏具有一定的保护作用。另外在生命延长实验中，拟康氏木霉胞外多糖给药的 结肠癌小鼠生命得到了显著的延长。 阳〇1引说明书附图
[0014] 图1是拟康氏木霉胞外多糖EPS治疗给药途径对CT26荷瘤小鼠实体瘤的抑制作 用；
[0015] 图2是拟康氏木霉胞外多糖EPS预防给药途径对CT26荷瘤小鼠实体瘤的抑制作 用；
[0016] 图3A是拟康氏木霉胞外多糖EPS治疗给药途径下对CT26结肠癌小鼠免疫器官的 影响；
[0017] 图3B是拟康氏木霉胞外多糖EPS预防给药途径下对CT26结肠癌小鼠免疫器官的 影响； 阳01引图4是拟康氏木霉胞外多糖EPS对CT26结肠癌小鼠血清中细胞因子水平的影响；
[0019] 图5是拟康氏木霉胞外多糖EPS对CT26结肠癌小鼠脾淋己细胞增值的影响；
[0020] 图6A是肿瘤模型组对CT26结肠癌小鼠CD8叮淋己细胞比例；
[0021] 图她是拟康氏木霉胞外多糖EPS(50mg/kg)对CT26结肠癌小鼠CD8叮淋己细胞 比例的影响；
[0022] 图6C是拟康氏木霉胞外多糖EPS(l〇〇mg/kg)对CT26结肠癌小鼠CD8叮淋己细胞 比例的影响；
[0023] 图抓是拟康氏木霉胞外多糖EPS(200mg/kg)对CT26结肠癌小鼠CD8叮淋己细胞 比例的影响；
[0024] 图6E是5-氣尿喀晚对CT26结肠癌小鼠CD8叮淋己细胞比例的影响； 阳02引图6F是对CT26结肠癌小鼠CD8叮淋己细胞比例的影响的比较；
[0026]其中：
[0027] *表示t检验后，与肿瘤模型组相比呈显著性差异（P<0. 05);
[0028] **表示t检验后，与肿瘤模型组相比呈极显著性差异（P<0. 01);
[0029] ***表示t检验后，与肿瘤模型组相比呈极显著性差异（P<0. 001)。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
[0031] 实施例中，拟康氏木霉（Trichodermapseudokoningii)购自中国普通微生物菌种 保藏管理中屯、，菌种保藏号为CGMCCNo. 1443;
[0032] 拟康氏木霉胞外多糖为CN101220101A所制备的多糖；
[0033] RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗购自Gibco公司；
[0034]5-氣尿喀晚、刀豆蛋白A (ConA)、脂多糖（LP巧购自Sigma公司；
[0035]CD3 和CD8a抗体购自eBioscience公司；
[0036]CT26.WT小鼠结肠癌细胞购自中国科学院细胞生物学研究所；
[0037] 其他试剂均为本领域常用市售的，分析纯； 阳03引 BALB/C小鼠购自南京青龙山养殖基地；
[0039]PBS:-种缓冲液，由蒸馈水配制而成，每升含：憐酸二氨钟0.27g，憐酸氨二钢 1. 42g，氯化钢 8g，氯化钟 0. 2g，pH7. 4 阳040] 实施例1
[0041] 拟康氏木霉胞外多糖治疗及预防给药对结肠癌BALB/C小鼠肿瘤生长抑制作用
[00创通过对BALB/C小鼠接种CT26结肠癌细胞株，建立结肠癌裸鼠移植瘤模型，治疗途 径采用先接肿瘤，第二天分组给药进行试验；检测EPS对结肠癌肿瘤治疗作用
[0043] 预防途径采用先灌胃给药再接种瘤株继续给药的途径进行试验，旨在检测EPS对 结肠癌肿瘤预防的作用。
[0044] 具体实验方法：
[0045]实验一周前购买18-22g雌性BALB/C小鼠于动物房饲养（室溫23 ± 2°C，湿度50 % ±10%)，收集对数期的结肠癌CT26细胞，憐酸盐缓冲液（PB巧稀释至2X105个/mL。无 菌条件下，小鼠左蔽下接种0. 2mL结肠癌CT26细胞悬浮液，观察3-5山待蔽下出现米粒大小 较硬的结节作为建模成功的标准。
[0046] 治疗给药途径：BALB/C结肠癌移植瘤模型小鼠随机分成5组，每组7只，开始给药 治疗实验。实验组分别为：肿瘤模型组（生理盐水），拟康氏木霉低剂量组巧Omg/kg/d)，拟 康氏木霉中剂量组（lOOmg/kg/d)，拟康氏木霉高剂量组（200mg/kg/d)，5-即组（20mg/kg/ d)。每天定时灌胃给药一次，连续给药14d。
[0047] 末次给药后，禁食不禁水2地，称重，取血并处死小鼠。剥取荷瘤小鼠的肿瘤组织并 称重，计算抑瘤率，剥取荷瘤小鼠免疫器官（胸腺与脾脏）并称重，计算免疫器官指数。
[0048] 抑瘤率=[肿瘤模型组瘤重（mg)-给药组瘤重（mg)]/肿瘤模型组瘤重 (mg)X100%； W例脾脏指数二脾脏重量（mg) /终体重（g)
[0050] 胸腺指数二胸腺重量（mg) /终体重（g)
[0051] 末次给药后，将所有给药组小鼠的血液样本于1000化pm离屯、15分钟，取血清， ELISA法测定各组小鼠血清中白细胞介素-2(比-2)和肿瘤坏死因子（TNF-a)的浓度。
[0052] 末次给药后，制备小鼠脾细胞悬液（方法同上）置于RPMI-1640完全培养基中，制 成1 X 106个/mL的细胞悬液，取细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100 μ L，分为立组， 每组6个复孔，各组分别加入配置好的100 μ L刀豆蛋白A (ConA，5 μ g/血）和脂多糖（LPS， 10μg/mL)或RPMI-1640培养基，使得终体积为200μ以将细胞解育于C〇2培养箱中44h， 在每孔中加入MTT溶液10 μ L继续培养地，每孔吸去上清，然后加入150 μ L二甲基亚讽 (DMS0) W溶解甲琐，置于摇床混匀15min后，在酶标仪570nm波长读取每孔0D值。
[0053] 末次给药后，取各组小鼠的脾脏，无菌环境下将脾脏撕裂分开，用注射器适度地 娠压脾脏组织，使得单个脾细胞能通过尼龙筛过滤到含有红细胞裂解液的无菌小烧杯中， 离屯、，加入冷的RPMI-1640完全培养基，用舰化丙晚（PD/RNA酶染色运用流式细胞术确定 分离的脾细胞活力，随后将活力合格的300μL浓度为5X1〇5个/mL脾细胞与1. 5μLFITC 标记的抗小鼠CD3抗体和3.75μLPE标记的抗小鼠CD8a抗体混合放置于4°C冰箱中30分 钟，解育后未被标记的抗体用含有0. 05%叠氮钢的3mLPBS洗去，染色标记的脾细胞重悬 于200μL含有2%胎牛血清和0. 05%叠氮钢的FACS缓冲液中上样用流式细胞术检测脾细 胞中CD8叮细胞占总T淋己细胞比例。
[0054] 预防给药途径：BALB/C结肠癌移植瘤模型小鼠随机分成4组，