其中3组小鼠，分别 灌胃无菌过滤后的低、中、高剂量拟康氏木霉胞外多糖溶液（分别是50、100、200mg/kg/d)， 每次灌胃0. 5ml，肿瘤模型组则灌胃等体积的灭菌生理盐水。连续给药7d后，多糖处理组W 及肿瘤模型组小鼠于右蔽下接种瘤株，继续给药14d，常规饲养，给药后，禁食不禁水2地， 称重，取血并处死小鼠。剥取荷瘤小鼠的肿瘤组织并称重，计算抑瘤率，剥取荷瘤小鼠免疫 器官（胸腺与脾脏）并称重，计算免疫器官指数。
[0055] 抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数计算方法同上。
[0056] 治疗期间每天观察动物的精神、活动、饮食、皮毛等征象。
[0057] 实验结果表明：
[0058] 肿瘤模型建立开始，小鼠皮毛光滑，进食进水正常，反应灵活，组间差异不明显。
[0059] 随着肿瘤组织的增大，和给药治疗，组间出现不同程度的差异；肿瘤模型组小鼠 摄食量明显下降，精神萎靡，活动迟缓且毛发发黄；5-RJ给药组小鼠体格极度瘦弱，活动颤 栗，毛发混乱不均；而EPS给药组小鼠生存状况明显较其他组好，且生存质量随拟康氏木霉 胞外多糖剂量增加而提高。
[0060] 由表1和图1可知，5-RJ组、EPS高剂量组小鼠的瘤重与肿瘤模型组的差异显著 (P<0. 01，P<0. 001)，说明EPS在体内具有较好的抑制肿瘤作用，而5-RJ组体重明显降低， EPS给药组小鼠体重未显示出明显异常，提示化疗药物5-RJ对机体有极强的毒性，EPS给药 组的小鼠体重高于5-RJ组，和肿瘤模型组小鼠体重接近，说明EPS对机体并无毒性。
[0061] 表1EPS对CT26结肠癌小鼠体重、瘤重及抑瘤率的影响（η= 7，）
[0062]
[0064]与肿瘤模型组相比，**P<0. 01，***P<0. 001 阳0化]表2预防途径给药中EPS对CT26结肠癌小鼠体重、瘤重及抑瘤率的影响（η=7, jT±s )
[0066]
[0067] 与肿瘤模型组相比，冲<0. 05,*冲<0. 01 W側由表2和图2可知，在预防给药途径中，多糖中、高剂量组瘤重明显低于肿瘤模型 组（P<0. 05,P<0. 01)，说明预防性的摄入EPS同样增强了机体抗肿瘤的能力。 W例如图3A可知，5-即组脾脏指数和胸腺指数明显较肿瘤模型组低（P<0. 001)，EPS中 剂量组脾脏指数明显较肿瘤模型组高（P<〇. 05)，所有的EPS给药组小鼠的胸腺指数均高于 肿瘤模型组，尤其是在预防给药途径实验的小鼠体现的更为明显（图3B)。
[0070]如图4可知，与肿瘤模型组相比，5-即组的IL-2和TNF-α水平明显降低(Ρ<0. 01)，相反，EPS组小鼠血清的IL-2和TNF-α水平高于肿瘤模型组并呈剂量依赖性。 [00川如图5可知，在无有丝分裂刺激的淋己细胞增值实验中，EPS给药组小鼠脾淋己细 胞增值率明显高于肿瘤模型组并呈剂量依赖性（P<0. 001)，在刀豆蛋白A(ConA，5μ gAiL) 或脂多糖（LPS，10yg/mL)刺激下，EPS组小鼠的脾淋己细胞增值率明显较肿瘤模型组高 (P<0. 01)，但5-RJ组淋己细胞增值率显著降低（P<0. 05)。 阳07引如图6A-图6F可知，EPS给药明显提升了小鼠CD8叮细胞占总T淋己细胞的比例 并呈剂量依赖性，而5-RJ给药降低了CD8+T细胞的比例。 阳07引实施例2
[0074] EPS联合5-氣尿喀晚对结肠癌裸鼠移植瘤生长抑制作用
[007引通过对BALB/C小鼠接种结肠癌细胞株，建立结肠癌小鼠移植瘤模型，采用灌胃方 法，对结肠癌小鼠进行治疗，观察EPS联合化疗药物5-FU对结肠癌荷瘤小鼠的作用。
[0076] 实验方法：
[0077] 建立结肠癌移植瘤小鼠模型，方法同实施案例1。
[0078] 45只建模成功的雌性BALB/C小鼠平均随机分成肿瘤模型组（对照组）、5-即组 (20mg/kg/d)，EPS低、中、高剂量联合5-即组，分别给药量EPS50mg/kg/d巧-即20mg/kg/ d、EPSlOOmg/kg/d巧-即20mg/kg/d、EPS200mg/kg/d巧-即 20mg/kg/d。每日固定时间灌胃 给药一次，连续给药10天。末次给药后禁食不禁水12h，称重，脱颈处死，75%酒精浸泡，剪 开其蔽下皮肤及胸腔，剥离肿瘤组织和胸腺脾脏，分别称重记录。计算抑瘤率、脾脏指数和 胸腺指数。
[0079] 抑瘤率=[(肿瘤模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）/肿瘤模型组平均瘤 重]X100%
[0080] 脾脏指数二脾脏重量（mg) /终体重（g)
[0081] 胸腺指数二胸腺重量（mg)/终体重（g)
[0082] 末次给药后，称重并脱颈处死，75%酒精浸泡，剪开其胸腔，剥离屯、脏、肝脏及其肾 脏，分别称重记录。
[0083] 实验结果表明：
[0084] 本研究在对小鼠肿瘤治疗的日常观察中发现，单纯灌胃5-FU给药组的小鼠体态 日渐瘦弱，毛色发黄无光泽且凌乱，行动及反应迟缓，嗜睡，而联合给药组小鼠生存状态明 显较好，体态较5-RJ给药组丰盈，毛色自然柔顺，行动及反应迅速，说明EPS在一定程度上 减轻了 5-FU治疗肿瘤中给机体带来的毒性伤害，改善了小鼠生存质量 阳0财表3联合用药对CT26结肠癌小鼠体重、瘤重及抑瘤率的影响（η=7，i主S)「00861
[0087] 与肿瘤模型组相比，*P< 0. 05,叩< 0. 01，< 0. 001;与5-即组相比，#P < 0. 05, < 0. 01，< 0. 001
[0088] 结果如表3所示，和肿瘤模型组相比，各用药组小鼠平均体重均明显下降，其中 5-即组下降最为明显，说明单独5-即用药毒性最大；但和5-即组相比，各联合用药组小鼠 平均体重均明显上升。实验结果也显示，5-RJ组和联合用药组均能明显减少CT26小鼠的 瘤重，且和5-RJ组相比，联合用药中、高剂量组的瘤重均明显比5-RJ组较低，且呈剂量依赖 性，其中EPS高剂量（200mg/kg/d)联合5-即(20mg/kg/d)组瘤重最低（P<0.001)，抑瘤率最 高，达72. 24%，说明EPS联合5-RJ用药对CT26结肠癌具有更好的疗效。
[0089] 表4显示，与肿瘤模型组相比，各用药组的胸腺和脾脏重量均明显降低，但和5-FU 组相比，各用药组的胸腺和脾脏重量均上升，说明EPS的摄入提高了小鼠机体的免疫器官 重量，提升了小鼠免疫指数，增强了小鼠机体的免疫力。
[0090] 表4联合用药对CT26结肠癌小鼠免疫器官的影响（η= 7, )
[0091]
W92] 与肿瘤模型组相比，*P<0. 05，叮<0. 01，***P<0. 001 ;与5-即组相比，#P<0. 05， 拙P<0. 01
[0093] 如表5所示，和肿瘤模型组相比，各用药组的脏器重量均下降，其中5-RJ肝脏重量 下降显著（p<0. 01)，肾脏重量下降更为显著（p<0. 001)，提示5-RJ对CT26结肠癌小鼠肝脏 和肾脏毒性最大；和5-RJ组相比，各联合用药组脏器重量均高于5-RJ组，虽然无统计学差 异，但在一定程度上说明EPS可W缓解5-RJ对机体屯、脏、肝脏和肾脏带来的毒性，对运些脏 器具有一定的保护作用。
[0094] 表5联合用药对小鼠屯、脏、肝脏、肾脏的影响（η= 7,i±s) 阳0巧]
[0097] 与肿瘤模型组相比，*P<0. 05,叮<0. 01，*叮<0. 001
[0098] 实施例3
[0099] 拟康氏木霉胞外多糖对CT26结肠癌小鼠生存期延长实验 阳100] 通过建立CT26结肠癌小鼠动物模型，观察拟康氏木霉胞外多糖EPS在lOOmg/kg/ d用药剂量及其联合5-RJ用药对CT26荷瘤小鼠生存期的影响， 阳101] 实验方法： 阳102] 建立结肠癌移植瘤小鼠模型，方法同实施例1。将小鼠随机分为4组，每组7只，即 模型对照组（生理盐水），多糖处理组（lOOmg/kg/祀PS)，5-即组（20mg/kg/d)，联合用药组 (lOOmg/kg/dEPS+20mg/kg/d5-即)，灌胃给药。接种第2天开始固定时间给药，每天一次， 共lOd。停药后观察至小鼠死亡。观察小鼠精神状态、活动、饮食、毛发等，并记录小鼠生存 时间。
[0103] 实验结果表明：
[0104] 制得的拟康氏木霉胞外多糖体内给药，在接种第4天，各组小鼠开始明显出现肿 瘤小块，模型对照组小鼠肿瘤块生成速度明显快于EPS(l〇〇mg/kg/d)给药组及其联合5-即 用药组。实验过程中模型对照组动物反应迟缓，饮食减少。接种第7天后，各实验组小鼠不 同程度的出现毛色欠光泽，毛发颤栗，騰缩抱团，觅食减少等。拟康氏木霉胞外多糖给药组， 及其联合5-RJ用药组一般情况好于模型组与5-RJ组。
[01化]生命延长率=[(给药组平均生存时间-模型对照组平均生存时间）/模型对照组 平均生存时间]X100% 阳106] 结果见表6,按照计算公式，多糖给药组CT26结肠癌小鼠生存时间为（42. 1 + 1. 2) 天，生命延长率为131. 31 %，与模型对照组比较，具有统计学意义（P<0. 01)，与5-RJ组比 较，具有统计学意义（P<〇. 05) ;EPS联合5-RJ用药组同样延长CT26结肠癌小鼠生存时间， 生命延长率为97. 25%，与模型对照组比较，具有统计学意义（P<0. 05)。 阳1 〇7] 表6EPS对CT26结肠癌小鼠生存期的影响（η= 7,；的:） 阳10引
[0109]与模型对照组相比，冲<0. 05, *冲<0. 01，与5-即组相比，#Ρ<0. 05
[0110] 从W上数据可W得到，拟康氏木霉胞外多糖具有预防和治疗结肠癌的作用，并且 可W延长结肠癌小鼠生存时间。
【主权项】
1. 拟康氏木霉胞外多糖治疗结肠癌的应用。2. 拟康氏木霉胞外多糖预防结肠癌的应用。3. 拟康氏木霉胞外多糖联合5-氟尿嘧啶治疗结肠癌的作用。
【专利摘要】本发明公开了拟康氏木霉胞外多糖治疗和预防结肠癌的应用、及其联用化疗药物治疗结肠癌的应用。拟康氏木霉胞外多糖(EPS)可以明显抑制结肠癌肿瘤小鼠的肿瘤块的生长，提高小鼠免疫器官指数和小鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，提升了小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CD8+T细胞)占总T淋巴细胞的比例，显著激活小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞，具有治疗结肠癌的作用；预防性的摄入EPS也可以有效的提高机体抗肿瘤的能力。并且和现有化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)联合用药抗肿瘤疗效明显高于单独5-FU用药的抗肿瘤效果。而且，可以提高结肠癌小鼠生存质量，延长其寿命。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/06, A61K31/513, A61K31/715
【公开号】CN105412155
【申请号】CN201510890388
【发明人】陈靠山, 朱磊, 陈国创, 芦静波, 房芳
【申请人】皖南医学院
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月2日