口炎清活性成分群及其指纹特征图谱的构建和质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及口炎清制剂的活性成分分析及质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 中药的生物活性评价与其安全性、有效性直接相关，中药的药效物质基础是中药 中与生物活性密切相关的化学成分群，因此对中药的生物活性成分的研究，阐明其药效物 质基础是促进中药发展和应用的必经之路。早在2004年，美国FDA的《植物药研制指导原则》 就明确指出，研究植物药应在已知成分的基础上提高和药物作用的研究，运体现了对中药 的生物活性成分监控的重要性，表明对中药生物活性成分的研究已成为中药走向现代化的 关键技术。将含有化学特征信息的中药指纹图谱与药效相关联，分析化学成分变化与药效 变化的关联性，能够科学地掲示生物活性成分，阐明药效物质基础，是中药质量控制的一个 重大进步，在加速中药现代化的进程中发挥着至关重要的作用。
[0003] 口炎清颗粒是由广州白云山和记黄捕中药有限公司独家生产的治疗口腔炎症疾 病的超亿元中成药。该产品由山银花、玄参、麦冬、天冬、甘草5味药材组成，可滋阴清热、解 毒消肿，临床用于治疗阴虚火旺的口腔炎症疾病，对复发性口腔溃瘍、口腔黏膜炎、口腔扁 平苔薛、碟口疮等多种口腔黏膜疾病均有良好疗效。口炎清颗粒收录在《国家基本药物目 录》(2012年版），是6个治疗咽喉、口腔病的国家基本用药之一。自1989年上市销售后，口炎 清颗粒临床用药效果显著，安全性高，一直深受医生和患者欢迎，带来了很大的社会效益和 经济效益。
[0004] 口炎清颗粒HPLC指纹图谱技术于2012年获得国家发明专利授权，公开号为 101518616B。该指纹图谱共检出23个共有峰，确证了7个已知成分，同时监测了山银花、玄 参、甘草3味药材，但麦冬和天冬的相关特征成分研究尚未完善。该指纹图谱方法不足之处 在于：（1)指纹图谱所提供的化学信息及化学解释均较少，共检出23个共有峰，确证了 7个已 知成分，仅监测了山银花、玄参、甘草3味药材，而未检测麦冬和天冬的相关特征成分。（2)指 纹图谱中的各特征峰所对应化学成分的生物活性不明确，不能有效监控口炎清颗粒有效成 分含量，无法确保产品的安全性及有效性。
[000引综上所述，现有口炎清颗粒指纹图谱构建方法尚存在较多不足，在进一步完善其 化学信息的基础上，需重点关注其中的核屯、活性成分群，并完善质量检测手段。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，用超快速高效液相色谱仪与四级 杆-飞行时间质谱仪串联检测技术对口炎清制剂抗炎药效的活性成分进行分析，进一步构 建了指纹特征图谱和活性成分群，并提供了相关质量检测方法。
[0007] 口炎清制剂抗炎药效的活性成分的分析及其指纹特征图谱的构建方法，包括W下 步骤：
[0008] (1)通过体外炎症模型筛选抗炎药效学检测指标；
[0009] (2)在口炎清制剂配方比例约束下，W五味原药材的质量百分含量为五个因素，均 匀设计构建若干口炎清制剂差异样品；
[0010] (3似补骨脂素为内标校正，用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪 串联技术，获得所述差异样品及原配方口炎清制剂已确证化学成分的相对峰面积，构建指 纹特征图谱；
[0011] (4)针对步骤（1)所筛选的抗炎药效学检测指标，分别获得所述差异样品的抗炎药 效特征数据；
[0012] (5)利用数理统计方法综合分析步骤(3)所述化学成分与各差异样品抗炎药效差 异的关联性，确定所述口炎清制剂抗炎药效活性成分群。
[0013] 所述的抗炎药效学检测指标分别为促炎因子TNF-a、比-8、比-6、比-10的含量。
[0014] 口炎清制剂差异样品的若干数量应符合统计学要求，科学合理反映实验结果。
[0015] 所述步骤(5)中具体方法为W步骤(3)所指证的特征峰的相对峰面积为自变量，W 差异样品的抗炎药效为因变量，利用灰色关联分析或主成分分析或偏最小二乘法综合分析 两变量间关联性，W确定所述口炎清制剂抗炎药效活性成分群。
[0016] 其中，步骤(3)所述日炎清制剂差异样品进样品的制备方法为:按照《中华人民共 和国药典》2010年版口炎清颗粒标准生产工艺制备各差异样品浸膏;取适量浸膏加入50% 甲醇9mL，超声30min，补充50 %甲醇定容至IOmL，经0.22皿微孔滤膜过滤后，用50 %甲醇稀 释，使终浓度为0.15g/mL，得目标样品；
[0017] 所述技术的检测条件为:采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，ISOmmX 4.6mm，3皿，柱溫40°C; WO. 1 %甲酸乙腊溶液-0.1 %甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，0-7分 钟，0.1 %甲酸乙腊溶液由2%变至10%，7-95分钟，0.1 %甲酸乙腊溶液由10%-41 % ,95-105分钟，0.1 %甲酸乙腊溶液由41%变至100% ,105-115分钟，0.1%甲酸乙腊溶液为 100%，流速为0.3mL/min;进样量为扣L，质谱工作参数:离子喷雾电压为5500V;离子源气体 1为55psi ;离子源气体2为55psi ;溫度为550°C;气帘气为35psi ;碰撞气体压力为IOpsi ;采 用ESI电喷雾离子源，正离子模式进行检测。
[0018] 在上述检测条件下，共检出相对峰面积大于1.5%的38个特征峰，指纹特征图谱如 图2所示;确证1号峰为赖氨酸、2号峰为精氨酸、4号峰为天冬氨酸、5号峰为瓜氨酸、8号峰为 白屈菜酸、10号峰为酪氨酸、11号峰为苯丙氨酸、12号峰为哈己巧、14号峰为绿原酸、16号峰 为咖啡酸、17号峰为甘草巧、18号峰为异搬皮巧、19号峰为木犀草巧、23号峰为安格洛巧C、 24号峰为异甘草巧、27号峰为哈己俄巧、28号峰为肉桂酸、29号峰为灰拉毛忍冬皂巧乙、31 号峰为川续断皂巧乙、32号峰为甘草次酸、33号峰为甘草酸、35号峰为费奠皂巧元、36号峰 为甲基麦冬二氨高异黄酬A、37号峰为鲁斯可皂巧元、38号峰为麦冬皂巧D;3号峰为k天冬 酷胺、6号峰为T-氨基下酸、7号峰为脯氨酸、9号峰为焦谷氨酸、13号峰为新绿原酸、15号峰 为隐绿原酸、20号峰为3,4-二咖啡酷奎尼酸、21号峰为3,5-二咖啡酷奎尼酸、22号峰为4,5-二咖啡酷奎尼酸、25号峰为W费奠皂巧元为巧元的皂巧1、26号峰为W费奠皂巧元为巧元的 皂巧2、30号峰为灰拉毛忍冬次皂巧甲、34号峰为甘草宁B。
[0019] 再W检出的38个特征峰的相对峰面积为自变量，W差异样品的抗炎药效为因变 量，利用灰色关联分析或主成分分析或偏最小二乘法综合分析两变量间关联性，构建口炎 清制剂抗炎药效活性成分的指纹特征图谱如图4所示;包括29个特征峰，其中1号峰为赖氨 酸、2号峰为精氨酸、3号峰为天冬氨酸、4号峰为丫-氨基下酸、5号峰为脯氨酸、6号峰为白屈 菜酸、7号峰为焦谷氨酸、8号峰为酪氨酸、9号峰为苯丙氨酸、10号峰为哈己巧、11号峰为新 绿原酸、12号峰为绿原酸、13号峰为隐绿原酸、14号峰为咖啡酸、15号峰为甘草巧、16号峰为 异搬皮巧、17号峰为木犀草巧、18号峰为3,4-二咖啡酷奎尼酸、19号峰为3，5-二咖啡酷奎尼 酸、20号峰为4,5-二咖啡酷奎尼酸、21号峰为安格洛巧C、22号峰为异甘草巧、23号峰为哈己 俄巧、24号峰为肉桂酸、25号峰为甘草次酸、26号峰为甘草宁B、27号峰为甲基麦冬二氨高异 黄酬A、28号峰为鲁斯可皂巧元、29号峰为麦冬皂巧D。
[0020] 确定其活性成分群为29个分别为:赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丫-氨基下酸、脯氨 酸、白屈菜酸、焦谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、哈己巧、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、 甘草巧、异搬皮巧、木犀草巧、3，4-二咖啡酷奎尼酸、3，5-二咖啡酷奎尼酸、4，5-二咖啡酷奎 尼酸、安格洛巧C、异甘草巧、哈己俄巧、肉桂酸、甘草次酸、甘草宁B、甲基麦冬二氨高异黄酬 A、鲁斯可皂巧元及麦冬皂巧D。
[0021] W上活性成分的指纹特征图谱可应用于口炎清制剂的质量检测方法，其特征在于 包括W下步骤：
[0022] (1)对照品溶液的制备:取精氨酸、绿原酸、木犀草巧、鲁斯可皂巧元对照品适量， 加50%甲醇制成每ImL含绿原酸50yg，精氨酸、木犀草巧、鲁斯可皂巧元各化g的对照品溶 液；
[0023] (2)供试品溶液制备:分别称取待测口炎清制剂样品1.3g，置具塞锥形瓶中，加入 50 %甲醇IOmL，精密称定，超声30min，放置至室溫，加50 %甲醇补足重量，摇匀，经0.22皿微 孔滤膜过滤后即得；
[0024] (3)运用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联对上述对照品及 供试品进行检测并分别构建图谱；
[00巧]检测条件：色谱柱：Dionex Bonded Silica C18(3皿，150mmX4.6mm)，柱溫40°C; 流动相:A为0.1 %甲酸乙腊溶液，B为0.1 %甲酸水溶液j$0-7min(2-10%A)，7-95min(10-41%4)，95-105111111(41-100%4)，105-115111111(100%4)的梯度洗脱;进样量扣1^;流速0.3血/ min；
[0026] 质谱工作参数：离子喷雾电压为5500V;离子源气体1为55psi;离子源气体2为 55psi;溫度为550°C;气帘气为35psi;碰撞气体压力为lOpsi。采用ESI电喷雾离子源，正离 子模式进行检测；
[0027] 所述的指纹特征图谱如图4所示为对照特征图谱，供试品图谱中应呈现29个与对 照特征图谱相对应的色谱峰，其中2、12、17、28号峰的保留时间应与精氨酸、绿原酸、木犀草 巧、鲁斯可皂巧元对照品色谱峰的保留时间相对应;其余色谱峰的保留时间应与对照特征 图谱相应色谱峰的保留时间一致为合格品。
[0028] 本发明所述的口炎清制剂是W药典口炎清颗粒处方为基础，凡W 口炎清颗粒处方 为基本组分，相似药效的任何类型制剂的半成品或产品均适合本发明的所述的分析方法及 质量检测方法，均属于本发明所保护的范围之内。本技术的实施应用可为其他中药复方制 剂的研究提供范例。
[0029] 与现有技术相比。本发明具有如下优点：（1)采用超快速高效液相色谱仪与四级 杆-飞行时间质谱仪串联化化C-Q-T0F-MS/MS)技术研究口炎清制剂的化学成分，确证了指 纹图谱中25个化学成分，比原专利技术多确证了 18个化学成分；（2)筛选稳定、灵敏的药效 学检测指标对口炎清差异样品进行考察，更全面、客观科学和直接地反映药品的药效作用 特点；（3)本发明中利用香烟烟雾提取物刺激口腔黏膜角化细胞建立体外炎症模型进行药 效学实验，该模型灵活、快速、实验周期短，是抗炎药物药效筛选实验常用模型；（4)本发明 中综合运用数理统计方法如灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法等方法进行谱效分 析，有效避免自变量间共线性，分析结果直观、真实、可靠；（5)通过谱效结合分析明确了口 炎清制剂核屯、抗炎活性成分群，阐明了其药效物质基础，有效结合了指纹图谱化学信息与 生物学信息，有利于提高其安全性、有效性及质量均一性。（6)用于口炎清制剂的质量检测 更快捷和有效。
【附图说明】
[0030]图1是口炎清制剂原配方及差异样品1-11号的UFLC-Q-T0F-MS/MS图谱；
[0031 ]图2是口炎清制剂抗炎活性成分群的UFLC-Q-T0F-MS/MS指纹特征图谱，图中标女 为内标补骨脂素；
[0032]图3是口炎清制剂抗炎药效活性成分的指纹特征图谱；
[0033 ]图4是图3中1号到6号特征峰的局部放大图；
[0034] 图5是图3中7号到10号特征峰的局部放大图；
[0035] 图6是图3中21号特征峰的局部放大图；
[0036] 图7是图3中23到27号特征峰的部分放大图；
[0037] 图8是图2的1号到26号特征峰的局部放大图；
[0038] 图9是图2的27号到39号特征峰的局部放大图。
【具体实施方式】
[0039] W下通过具体的实施例对本发明作进一步说明。
[0040] 一、口炎清颗粒抗炎药效学检测指标的筛选。
[0041 ] 1、实验材料
[0042] 1.1实验药品与试剂
[0043] 口炎清浸膏（广州白云山和记黄捕中药有限公司，批号：20140515),牛黄解毒片 (NP,北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：13121398)，地塞米松(Dex，中国药品 生物制品检定所，批号：100129-201105 )，香烟（挪树牌，广东中烟工业有限公司），MTT (sigma，M2128-lG)，TNF-a、比-8、比-6、化-10 Elisa试剂盒（武汉优尔生公司），RPMI-1640 培养基化yclone)。
[0044] 1.2实验仪器
[004引净化工作台：苏州净化安泰技术有限公司HT-840型;光学显微镜:Motic AE21;C02 培养箱:FORMA Seris 303792-6714型；超低溫冰箱:海尔BCD-568W;十万分之一电子天平： Sartorius BP211D;电热恒溫水浴锅：上海一恒科学仪器有限公