-6药效指标具 有显著的药效贡献，主要是玄参、麦冬的成分和一些氨基酸;P2、P8、P11、P12、P13、P16、P21、 P28、P36、P38也有一定的药效贡献，主要是山银花、天冬、麦冬、玄参的成分和一些氨基酸； 另外还显示山银花药材中P31所对应的成分并不是量越大药效越好。
[0266] 综上所述，结合灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法等方法进行综合分析， 共找出了 口炎清颗粒的29个抗炎活性成分，其中包括17个核屯、活性成分(表3-17):分别为 山银花的有机酸类。13、？14、？15、？16、？20、？21、？22)和黄酬类。18、？19)，玄参的环締酸祗 。12、？27)、苯丙素甘。23)和有机酸类。28)，麦冬的高异黄酬。36)和酱体皂巧类。37、 P38)，天冬/麦冬的有机酸类(P8)，甘草的黄酬类(P17、P24、P34)和皂巧类(P32)W及共有的 一些氨基酸。1、口2、口4、口6、口7、口9、口10、口11)。其中，山银花的有机酸类成分对1^-曰、化-8、 IL-6和IL-10均有药效贡献，黄酬类成分主要对TNF-a、比-10和IL-8有药效贡献；玄参的环 締酸祗、苯丙素甘和有机酸类成分主要对IL-10和IL-6有药效贡献;麦冬的高异黄酬和酱体 皂巧类成分主要对IL-10和IL-6有药效贡献;天冬/麦冬的有机酸类成分主要对TNF-a和IL-6有药效贡献;甘草的黄酬类和皂巧类成分主要对TNF-a有药效贡献;另外一些共有的氨基 酸对不同的药效指标有药效贡献，如PlO和Pl 1对TNF-a、比-10和IL-6有药效贡献;P2对IL-I 0和IL-6有药效贡献;Pl和P6对IL-6有药效贡献;P9对IL-8有药效贡献;P4和P7对TNF-a有药 效贡献，W上29个抗炎活性成分组成口炎清颗粒抗炎药效物质基础。在明确口炎清颗粒核 屯、抗炎活性成分群的基础上，用于控制药品生产中的安全性、有效性和质量均一性，所述活 性成分群的图谱图形如图3、图4、图5、图6及图7所示。
[0267] 本发明中明确了口炎清颗粒的核屯、抗炎活性成分群，科学地阐明其药效物质基 础，建立为其他中药复方制剂研究提供了研究思路与范例。
[0268] 表3-17 口炎清颗粒抗炎活性成分
[0270] 注:*代表核屯、活性成分。
[0271] S、口炎清颗粒样品的质量检测方法。
[0272] 抽取扣備09、扣備07、440)01的；批口炎清颗粒样品进行检测，方法步骤如下：
[0273] (1)对照品溶液的制备:取精氨酸、绿原酸、木犀草巧、鲁斯可皂巧元对照品适量， 加50%甲醇制成每ImL含绿原酸50yg，精氨酸、木犀草巧、鲁斯可皂巧元各化g的对照品溶 液；
[0274] (2)供试品溶液制备:分别称取待测口炎清制剂样品1.3g，置具塞锥形瓶中，加入 50 %甲醇IOmL，精密称定，超声30min，放置至室溫，加50 %甲醇补足重量，摇匀，经0.22皿微 孔滤膜过滤后即得；
[0275] (3)运用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联对上述对照品及 供试品进行检测。检测条件：色谱柱:Dionex Bonded Silica C18(3]im，150mmX4.6mm)，柱 溫40°C ;流动相:A为0.1 %甲酸乙腊溶液，B为0.1 %甲酸水溶液J$0-7min(2-10%A)，7-95min( 10-41 %A)，95-105min(41-100%A)，105-115min(l〇〇%A)的梯度洗脱;进样量扣!^; 流速0.3mL/min;质谱工作参数:离子喷雾电压为5500V;离子源气体1为55psi ;离子源气体2 为55psi;溫度为550°C;气帘气为35psi;碰撞气体压力为lOpsi。采用ESI电喷雾离子源，正 离子模式进行检测，样品检测结果构建图谱。
[0276] W图3所示的指纹特征图谱为对照特征图谱，在供试品色谱图中，精氨酸、绿原酸、 木犀草巧、鲁斯可皂巧元色谱峰与各自对照品色谱峰的保留时间相对应，其余色谱峰的保 留时间与对照特征图谱相应色谱峰的保留时间一致，为合格品。
[0277] 四、口炎清制剂29个抗炎棘性成分的结构式如下所示。
【主权项】
1. 口炎清制剂抗炎药效活性成分群，其特征在于，包括以下物质:赖氨酸、精氨酸、天冬 氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸、白屈菜酸、焦谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、哈巴苷、新绿原酸、绿 原酸、隐绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异槲皮苷、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰 奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸、安格洛苷C、异甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草次酸、甘草宁 Β、甲基麦冬二氢高异黄酮Α、鲁斯可皂苷元及麦冬皂苷D。2. 口炎清制剂抗炎药效活性成分群的分析及其指纹特征图谱的构建方法，其特征在于 包括以下步骤： (1) 通过体外炎症模型筛选抗炎药效学检测指标； (2) 在口炎清制剂配方比例约束下，以五味原药材的质量百分含量为五个因素，均匀设 计构建若干口炎清制剂差异样品。 (3) 以补骨脂素为内标校正，用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联 技术，获得所述差异样品及原配方口炎清制剂已确证化学成分的相对峰面积，构建指纹特 征图谱； (4) 针对步骤（1)所筛选的抗炎药效学检测指标，分别获得所述差异样品的抗炎药效特 征数据； (5) 利用数理统计方法综合分析步骤(3)所述化学成分与各差异样品抗炎药效差异的 关联性，确定所述口炎清制剂抗炎药效活性成分群。3. 如权利要求2所述的分析方法，其特征在于步骤(1)所述的抗炎药效学检测指标分别 为促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-Ιβ的含量。4. 如权利要求2所述的分析方法，其特征在于:所述步骤(5)中具体方法为以步骤(3)所 指证的特征峰的相对峰面积为自变量，以差异样品的抗炎药效为因变量，利用灰色关联分 析或主成分分析或偏最小二乘法综合分析两变量间关联性，以确定所述口炎清制剂抗炎药 效活性成分群。5. 如权利要求2所述的分析方法，其特征在于： 步骤(3)所述口炎清制剂差异样品进样品的制备方法为：按照《中华人民共和国药典》 2010年版口炎清颗粒标准生产工艺制备各差异样品浸膏;取适量浸膏加入50%甲醇9mL，超 声30min，补充50 %甲醇定容至10mL，经0.22μπι微孔滤膜过滤后，用50 %甲醇稀释，使终浓度 为0.15g/mL，得目标样品； 所述技术的检测条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，150mmX4 · 6mm，3μπι，柱温40°C;以0 · 1 %甲酸乙腈溶液-0 · 1 %甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，0-7分 钟，0.1%甲酸乙腈溶液由2%变至10%，7-95分钟，0.1%甲酸乙腈溶液由10%-41%，95_ 105分钟，0.1 %甲酸乙腈溶液由41%变至100%，105-115分钟，0.1%甲酸乙腈溶液为 100%，流速为0.3mL/min;进样量为5yL，质谱工作参数:离子喷雾电压为5500V;离子源气体 1为55psi;离子源气体2为55psi;温度为550°C;气帘气为35psi;碰撞气体压力为lOpsi;采 用ESI电喷雾离子源，正离子模式进行检测。6. 如权利要求5所述的分析方法，其特征在于:所述的检测条件下，共检出相对峰面积 大于1.5%的38个特征峰，指纹特征图谱如图2所示;确证1号峰为赖氨酸、2号峰为精氨酸、4 号峰为天冬氨酸、5号峰为瓜氨酸、8号峰为白屈菜酸、10号峰为酪氨酸、11号峰为苯丙氨酸、 12号峰为哈巴苷、14号峰为绿原酸、16号峰为咖啡酸、17号峰为甘草苷、18号峰为异槲皮苷、 19号峰为木犀草苷、23号峰为安格洛苷C、24号峰为异甘草苷、27号峰为哈巴俄苷、28号峰为 肉桂酸、29号峰为灰毡毛忍冬皂苷乙、31号峰为川续断皂苷乙、32号峰为甘草次酸、33号峰 为甘草酸、35号峰为菝葜皂苷元、36号峰为甲基麦冬二氢高异黄酮A、37号峰为鲁斯可皂苷 元、38号峰为麦冬皂苷D;3号峰为L-天冬酰胺、6号峰为γ-氨基丁酸、7号峰为脯氨酸、9号峰 为焦谷氨酸、13号峰为新绿原酸、15号峰为隐绿原酸、20号峰为3，4_二咖啡酰奎尼酸、21号 峰为3，5_二咖啡酰奎尼酸、22号峰为4,5_二咖啡酰奎尼酸、25号峰为以菝葜皂苷元为苷元 的皂苷1、26号峰为以菝葜皂苷元为苷元的皂苷2、30号峰为灰毡毛忍冬次皂苷甲、34号峰为 甘草宁Β。7. 如权利要求6所述的分析方法，其特征在于：以检出的38个特征峰的相对峰面积为自 变量，以差异样品的抗炎药效为因变量，利用灰色关联分析或主成分分析或偏最小二乘法 综合分析两变量间关联性，构建口炎清制剂抗炎药效活性成分的指纹特征图谱如图4所示； 确定其活性成分群为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸、白屈菜酸、焦谷氨 酸、酪氨酸、苯丙氨酸、哈巴苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异槲皮苷、木 犀草苷、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸、安格洛苷C、异 甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草次酸、甘草宁Β、甲基麦冬二氢高异黄酮Α、鲁斯可皂苷元及 麦冬皂苷D。8. 口炎清制剂抗炎药效活性成分指纹特征图谱，其特征在于：如图4所示，包括29个特 征峰，其中1号峰为赖氨酸、2号峰为精氨酸、3号峰为天冬氨酸、4号峰为γ-氨基丁酸、5号峰 为脯氨酸、6号峰为白屈菜酸、7号峰为焦谷氨酸、8号峰为酪氨酸、9号峰为苯丙氨酸、10号峰 为哈巴苷、11号峰为新绿原酸、12号峰为绿原酸、13号峰为隐绿原酸、14号峰为咖啡酸、15号 峰为甘草苷、16号峰为异槲皮苷、17号峰为木犀草苷、18号峰为3,4_二咖啡酰奎尼酸、19号 峰为3，5_二咖啡酰奎尼酸、20号峰为4,5-二咖啡酰奎尼酸、21号峰为安格洛苷C、22号峰为 异甘草苷、23号峰为哈巴俄苷、24号峰为肉桂酸、25号峰为甘草次酸、26号峰为甘草宁B、27 号峰为甲基麦冬二氢高异黄酮A、28号峰为鲁斯可皂苷元、29号峰为麦冬皂苷D。9. 口炎清制剂质量检测方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 对照品溶液的制备：取精氨酸、绿原酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元对照品适量，加 50%甲醇制成每lmL含绿原酸50yg，精氨酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元各lyg的对照品溶液； (2) 供试品溶液制备:分别称取待测口炎清制剂样品1.3g，置具塞锥形瓶中，加入50% 甲醇10mL，精密称定，超声30min，放置至室温，加50 %甲醇补足重量，摇匀，经0.22μπι微孔滤 膜过滤后即得； (3) 运用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联对上述对照品及供试 品进行检测并分别构建图谱;检测条件为色谱柱:DionexBondedSilicaC18(3ym，150mmX 4.6mm)，柱温40°C;流动相:A为0.1 %甲酸乙腈溶液，B为0.1 %甲酸水溶液d$0-7min(2-10%A)，7-95min(10-41%A)，95-105min(41-100%A)，105-115min(100%A)的梯度洗脱;进 样量5yL;流速0.3mL/min;质谱工作参数:离子喷雾电压为5500V;离子源气体1为55psi;离 子源气体2为55psi;温度为550°C;气帘气为35psi;碰撞气体压力为lOpsi。采用ESI电喷雾 离子源，正离子模式进行检测； (4) 以权利要求7所述的指纹特征图谱为对照特征图谱，供试品图谱中应呈现29个与对 照特征图谱相对应的色谱峰，其中2、12、17、28号峰的保留时间应与精氨酸、绿原酸、木犀草 苷、鲁斯可皂苷元对照品色谱峰的保留时间相对应;其余色谱峰的保留时间应与对照特征 图谱相应色谱峰的保留时间一致为合格品。10.如权利要求2或9所述的方法，其特征在于，所述的口炎清制剂包括以口炎清颗粒处 方为基本组分，相似药效的任何类型制剂的半成品或成品。
【专利摘要】本发明公开了口炎清制剂的抗炎活性成分群及分析方法，构建了该成分群的指纹特征图谱，将该图谱应用于口炎清制剂质量检测中，并进一步公开了所述质量检测方法。具体为：以抗炎药效为检测指标；均匀设计不同组分比例的差异样品；通过UFLC-Q-TOF-MS/MS技术获得差异样品的指纹特征数据；并获得制剂的抗炎活性数据。运用数理统计方法综合分析差异样品的化学成分与药效间的关联性，由此确定了29个抗炎药效活性成分，并构建成分群的指纹特征图谱。相对于现有技术，本发明是基于图谱与药效的关联性来分析活性成分群，因此更能直接、客观科学和全面地监控生产过程中原料药材、半成品、成品的质量，从而确保该产品的有效性和质量均一性。
【IPC分类】A61K31/4015, A61K31/351, A61K31/7048, A61K31/56, A61P29/00, A61K31/192, A61K31/198, A61K31/58, A61K31/401, A61P1/02, A61K31/352, A61K31/7034, A61K31/36, G01N30/02, A61K31/216, A61P1/04
【公开号】CN105477006
【申请号】CN201510666302
【发明人】苏薇薇, 李楚源, 彭维, 覃仁安, 郑玉莹, 黄琳, 吴忠
【申请人】广州白云山和记黄埔中药有限公司, 中山大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年10月14日