用于减缓细胞衰老的包含rho激酶抑制剂的组合物及其用图
【专利说明】用于减缓细胞衰老的包含RHO激酶抑制剂的组合物及其用 途
[oow] 相关申请 W02] 本申请要求2014年10月6日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请 No. 10-2014-0134481的权益，其完整公开内容通过提述并入本文。 发明领域
[0003] 本公开设及用于减缓细胞衰老的组合物、减少哺乳动物中细胞衰老的方法、和治 疗哺乳动物中细胞衰老相关症状的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 衰老可定义为细胞分裂的永久停止。已在细胞水平观察到复制性衰老或细胞衰老 作为老化模型。当持续培养细胞时，细胞分裂多次，但老化的细胞不再能分裂。衰老细胞对 程序性细胞死亡有抗性，且一些衰老细胞保持不分裂状态达几年。
[0006] 化O激酶是属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC (PKA/PKG/PKC)家族的激酶。包括 ROCKl和R0CK2在内的化〇有关的蛋白激酶（即ROCK)在哺乳动物、斑马鱼、爪赡狂enopus) 等中发现。人ROCKl具有ISOkDa的分子量，而且是小GT化Se化oA的主要下游效应物。 哺乳动物ROCK包括激酶域、卷曲螺旋区、和血小板-白细胞激酶C底物同源（Pleckstrin homology, PH)结构域，当化oA-GTP不存在时血小板-白细胞激酶C底物同源结构域通过自 身抑制性分子内折叠降低ROCK的激酶活性。 阳007] 由于ROCK在与细胞衰老有关的细胞过程中所起的作用，仍然需要开发用化O激酶 抑制剂减缓Cre化cing)细胞衰老的组合物和方法。 阳00引 发明概述
[0009] 提供一种用于在哺乳动物中治疗与细胞中的脂褐素积累有关的症状的组合物，所 述组合物包含化O激酶抑制剂作为活性成分。所述细胞可W是具有脂褐素积累的皮肤组织 细胞、肌肉组织细胞或神经组织细胞。优选地，所述哺乳动物是人。
[0010] 在一个方面，所述与脂褐素积累有关的症状是神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL)、年 龄相关的黄斑变性、屯、脏的褐色萎缩、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病、慢性阻塞性肺病 (COPD)、或其组合。
[0011] 提供一种用于在体外或在哺乳动物中减少细胞中脂褐素积累的组合物，所述组合 物包含化O激酶抑制剂作为活性成分。
[0012] 提供一种用于刺激人细胞的增殖的组合物，所述组合物包含化O激酶抑制剂作为 活性成分。在一个实施方案中，所述人细胞是成纤维细胞、肌细胞或神经细胞。在一个方面， 所述组合物用于治疗皮肤皱纹、降低的修复伤口的能力、肌肉衰减症（sarcopenia)、哈-格 二氏早老性综合征化Utchinson-Gil化rd progeria syn化ome)、或其组合。提供一种减少 哺乳动物中细胞衰老的方法，包括通过对所述哺乳动物施用有效量的化〇激酶抑制剂来减 缓细胞衰老。
[0013] 提供一种治疗哺乳动物中的与细胞衰老有关的症状的方法，其中所述方法包括通 过对所述哺乳动物施用有效量的化O激酶抑制剂来治疗与细胞衰老有关的症状。
[0014] 提供一种治疗哺乳动物中的胞内脂褐素积累相关症状的方法，其中所述方法包括 通过对所述哺乳动物施用有效量的化O激酶抑制剂来治疗脂褐素积累相关病症。
[0015] 提供一种刺激人细胞增殖的方法，包括：将所述人细胞暴露于有效量的化O激酶 抑制剂W刺激所述人细胞，其中所述人细胞是成纤维细胞、肌细胞或神经细胞。特别地，所 述暴露包括将有效量的化O激酶抑制剂施用给人体部位，其中所述部位是皮肤组织、肌肉 组织或神经组织。
[0016] 所述化O激酶抑制剂可W局部施用至包含具有脂褐素积累的细胞的皮肤组织、肌 肉组织或神经组织。在一个实施方案中，所述化O激酶抑制剂的施用通过将化O激酶抑制 剂局部施用至包含具有脂褐素积累的细胞的组织来进行。
[0017] 本申请的方法可用于治疗皮肤皱纹、降低的修复伤口的能力、肌肉衰减症、哈-格 二氏早老性综合征、或其组合。
[0018] 附图简述
[0019] 运些和/或其他方面从对例示性实施方案连同所附附图的下列描述来看将变得 明显且更容易领会的。
[0020] 图1，该示例图显示了暴露于多种浓度的化O激酶抑制剂Y-27632、Fasudil和 SR3677的细胞的细胞集落形成； 阳02U 图2,该系列图绘出了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)情况下培养的衰老成纤维细胞（37次细胞传代后）的相对细胞数对时间；
[0022] 图3是显微镜图像，其例示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧y M)情况下培养 的衰老成纤维细胞（37次细胞传代后）的细胞形状；
[0023] 图4是细胞在各种细胞生长阶段的百分比的图，其例示了化O激酶抑制剂Y-27632 和化SUdil对衰老成纤维细胞（37次细胞传代后）的细胞周期的影响； W24] 图5是显微镜图像的图，其例示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧y M)、 FasudiUS y M)和SR3677 (0. 5 y M)的情况下在含琼脂培养基中培养衰老成纤维细胞（37次 细胞传代后）的结果； 阳0巧]图6至8是例示了在存在化〇激酶抑制剂Y-27632 (5 y M)、Fasudi 1巧y M)和 SR3677(0. SiiM)的情况下培养的衰老成纤维细胞（37次细胞传代后）的衰老有关的 (SA) - 0 -半乳糖巧酶活性（图6A、7A和8A的a和b)的显微镜图像的图，和例示具有衰老 有关的（SA)-P-半乳糖巧酶活性的细胞的百分比的图（图6B、7B和8B);
[0026] 图9,该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情况下培养的成纤维细胞（37次细胞传代后）中脂褐素的量；
[0027] 图10,该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情况下培养的成纤维细胞（37次细胞传代后）中的反应性氧种类； 阳02引 图11，该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情况下培养的成纤维细胞（37次细胞传代后）的线粒体膜电位；
[0029] 图12,该图显示了在存在化〇激酶抑制剂Y-27632(5 yM)、FasudiUSyM)和 SR3677 (0. 5 y M)的情况下培养的成纤维细胞（38次细胞传代后）中的DNA损伤程度，通过 指示DNA损伤程度的DNA曽星测定法值NA comet assay)测量； W30] 图13是显微镜图像的图，其例示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧y M)、 FasudiUSiiM)和SR3677 (0.5 iiM)的情况下培养的成肌细胞（11次细胞传代后）中的细胞 形状变化； 阳03U 图14,该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情况下培养的成肌细胞（11次细胞传代后）中的脂褐素量； 阳03引 图15,该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情况下培养的成肌细胞（11次细胞传代后）中的反应性氧种类； 阳03引 图16,该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情况下培养的成肌细胞（11次细胞传代后）中的线粒体膜电位； W34] 图17是显微镜图像的图，其例示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧y M)、 FasudiUS y M)和SR3677 (0. 5 y M)的情况下培养的早老性成纤维细胞（progeric fibroblasts) (17次传代后）中的细胞形状变化；
[0035] 图18,该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情况下培养的早老性成纤维细胞（17次传代后）中的脂褐素量；
[0036] 图19,该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情况下培养的早老性成纤维细胞（17次传代后）中的反应性氧种类；
[0037] 图20,该组图显示了在存在化O激酶抑制剂Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情况下培养的早老性成纤维细胞（17次传代后）的线粒体膜电位；
[0038] 图21，该图显示了在存在化〇激酶抑制剂Y-27632(5 yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情况下培养的早老性成纤维细胞（17次传代后）中的DNA损伤程度，通 过指示DNA损伤程度的DNA曽星测定法测量；和
[0039] 图22是例示了在存在化〇激酶抑制剂Y-27632 (5 y M)、FasudiUS y M)和 SR3677(0. SiiM)的情况下培养的早老性成纤维细胞（17次传代后）的SA-P-半乳糖巧酶 活性的显微镜图像的图（图22A的a-e)，和例示具有SA- 0 -半乳糖巧酶活性的细胞的百分 比的图（图22B)。 W40] 图23显示了在应用Y-27632或作为对照的DMSO后年老小鼠的时间匹配的伤口大 小和伤口外观。
[0041] 图24代表免疫组织化学实验结果，其显示Y-27632处理在年老小鼠（19个月龄） 的伤口愈合中起着重要作用。
[0042] 图25代表W下实验结果，其显示伤口重塑组织的横截面面积中胶原沉积的厚度 掲示了在老年小鼠中用Y-27632处理的伤口相比于用DMSO处理的伤口中更密集和更厚的 胶原。 阳0创图26代表了显示年老小鼠中用Y-27632处理的伤口相比于用DMSO处理的伤口中 表皮中的PCNA+细胞的实验结果。 W44] 发明详述
[0045] 现将对例示性的实施方案进行详细提述，其例子例示在附图中，其中相似的参照 编号从头到尾指相似的要素。在此方面，目前的例示性实施方案可能具有不同形式且不应 理解为受限于本文中陈述的说明。因此，下文仅通过参照附图描述了例示性实施方案W解 释各方面。如本文中使用的，术语"和/或"包括一个/种或多个/种所列关联项的任意和 所有组合。表述如"至少一个/种"在置于一组要素之前修饰整组要素而不修饰该组的单 个要素。另外的方面部分将在下面的说明书中陈述，而部分从说明书将是明显的，或者可通 过实践呈现的例示性实施方案得知。
[0046] 提供可用于减缓细胞衰老的组合物，其中所述组合物包含化O激酶抑制剂作为活 性成分。
[0047] 化O激酶，也称为"化O-有关的蛋白质激酶（ROCK)"，是属于丝氨酸-苏氨酸激酶 的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。在哺乳动物、斑马鱼、爪赡等中发现ROCK(例如ROCKl 和R0CK2)。人ROCKl具有ISOkDa的分子量且是小GT化Se化oA的主要下游效应物。哺 乳动物ROCK包含激酶域、卷曲螺旋区、和血小板-白细胞激酶C底物同源（Plec