化合物或其盐在制备保护神经的药物中的应用

化合物或其盐在制备保护神经的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及从车前草中分离得到的化合物及其盐在制备保护神经的药物中的应 用
【背景技术】
[0002] 车前草为车前科Plantaginaceae植物车前Plantago asiatica L.或平车前 Plan化go depressa Willd.的干燥全草，是《中国药典》(2010年版)收载的常用中药。目前， 已发现的车前科有3属，约200种，分布遍及全世界。我国仅产车前属Plantago，约13种。除车 前与平车前外，国内外研究较多车前草还有大车前Plantago major L.。车前草性味甘寒， 具有利水、清热、明目、桂疲的功效。主治淋病、尿血、小便不通、黄痘、水肿、热频、泄泻、目赤 肿痛、喉痛等。《草性论》载"治尿血，能补五脏，明目，利小晒干的车前草便，通五淋"。《本草 逢原》载"若虚滑精气不固者禁用"。性味和功用甘，寒，归手太阳，阳明经。利水，清热，明目， 桂疲，用于小便不通，淋浊，带下，尿血，黄痘，水肿，热频泄泻，鼻赃，目赤肿痛，喉痛，咳嗽， 皮肤溃瘍。
[0003] 讫今为止，已从前述3种车前草中分离和鉴定出超过60种化合物，按其主要结构类 型可分为环締酸祗类、黄酬类、苯乙基巧类、酪酸类和脂肪酸类等成分。环締酸祗类有利尿， 抑菌，抗四氧化碳引起的肝中毒，利胆作用;黄酬类可作用于呼吸中枢，缓解呼吸运动而镇 咳，兴奋分泌神经使气管及支气管分泌增加而桂疲;苯乙基巧类有消炎、抑菌、抑制化mp憐 酸二醋酶和醒糖还原酶的活性;酪酸类具有杀菌、升白、利胆、抑制血小板聚集等功能。
[0004] 现代药理学研究表明，车前草具有多种药理活性，用途广泛，可W用于治疗慢性支 气管炎、急性黄痘型肝炎、痛风性关节炎、高血压、细菌性频疾、隐匿性肾炎、青光眼和痛风 等。
[000引PC12细胞株源于大鼠嗜铭细胞瘤，具有神经元的特征，因此作为神经元的模型用 于研究神经元细胞的死亡方式及机制的研究。多项研究已经表明，AP对PC12细胞的细胞毒 性作用是由于氧应激、线粒体功能异常等引致细胞调亡。

【发明内容】

[0006] 本发明的发明目的是提供一种化合物或其药学上可接受的盐在制备保护神经的 药物中的应用。
[0007] 本发明的上述发明目的是通过下面的技术方案得W实现的：
[0008] -种如式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备保护神经的药物中的应 用，
[0010] 进一步的，所述化合物式(I)由W下方法获得：
[0011] a、车前草粉碎，用85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；
[001引 b、步骤a中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，依次用20 %乙醇和80 %乙醇洗脱，收 集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物浸膏；
[0013] C、步骤b中80 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、60:1、30:1、 15:1和1:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得至化个组分；
[0014] d、步骤C中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯 甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
[0015] e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65%的 甲醇水溶液等度洗脱，收集8-11个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I);
[0016] 上述步骤中所述的85 %乙醇、20 %乙醇和80 %乙醇均是指体积百分浓度。
[0017] 作为优选，所述化合物（I)或其药学上可接受的盐的每日有效剂量为0.001-0.006g/kg 人体。
[0018] 作为优选，所述化合物（I)或其药学上可接受的盐用于制备预防或治疗受神经元 损伤影响的疾病或病症药物方面的应用。
[0019] -种医药组合物在作为保护神经的药物中的应用，所述医药组合物含有：
[0020] i治疗有效量的上述化合物（I)或其药学上可接受的盐或化合物（I)和其药学上可 接受的盐按任意比例的混合物；W及
[0021] ii药学上可接受的载体或稀释剂。
[0022] 作为优选，药学上可接受的载体或稀释剂选自赋形剂、辅料或溶剂。
[0023] 本发明的化合物、其药学上可接受的盐W及含有它们之一的医药组合物，具有如 下有益效果：
[0024] 本发明提供了一种能用来制备保护神经新药物的药物目录，拓宽了病人的选药范 围，为治疗保护神经疾病的筛选提供了新的有效药品种。目前，在应用20皿Ol/L A025-35能 有效建立体外培养的大鼠嗜铭瘤细胞株PC12调亡模型中，利用本发明的化合物（I)进行对 照试验，证明本发明的化合物（I)能部分对抗A025-35诱导的PC12调亡，证明其在制备保护神 经药物中具有有效的药用价值，可W用来开发成保护神经的药物新用途。并且本发明的化 合物或该化合物制备的医药组合物也具有同样的应用，化合物（I)、其药学上可接受的盐、 含它们的医药组合物最终均可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。
【附图说明】
[0025] 图1为化合物（I)结构式；
[0026] 图2为化合物（I)二维Ih-Ih COSY谱；
[0027] 图3为MTT代谢率检测A&日-3日对PC12细胞的毒性作用；
[002引图4为A&日-3日对PC12细胞LDH释放率的影响；
[0029] 图5为A&5-35和/或化合物(I)对PC12细胞LDH释放率的影响。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0031] 主要材料、试剂来源：
[0032] 乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲烧为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限 公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0033] A025-35购于美国sigma公司。MTT (四挫氮蓝)购于美国Amresco公司。LDH测定试剂盒 购于南京建成生物有限公司。叮晚澄(AO)购于美国Sigma公司。漠化乙晚化B)购于美国 sigma公司。RNase酶购于美国sigma公司。蛋白酶K购于美国sigma Annexin公司。V-FITC细 胞调亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。D-MEM/F12培养基干粉购于美国 Gibc化公司。马血清购于美国hycLon公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司。多 聚赖氨酸(P化)购于美国Sigma公司。化合物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98%。
[0034] 仪器类型：低溫高速离屯、机，美国化raeus;二氧化碳培养箱，美国甜化L/JB;超净 工作台，苏州净化设备厂；雷勃MK3酶标仪，芬兰化ermolabsystems ;巧光显微镜，德国 Leica;流式细胞仪EpicsXL,美国CouLter公司；电泳系统，北京六一仪器厂；雷勃MK3酶标 仪，芬兰T'hermolabsystems;巧光显微镜，德国Le i Ca;流式细胞仪E：pi csXL，美国CouLter公 司。
[0035] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0036] (a)车前的干燥全草(8kg)粉碎，用85%乙醇热回流提取侦LX3次），合并提取液， 浓缩至无醇味(6L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水饱和的正下醇(化X 3次)萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物(333g)和正下醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，依次用20%乙醇(8L)和80% (1化)乙醇洗脱，收集 80%乙醇洗脱液，减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏（152g); (C)步骤(b)中80%乙醇洗脱浸 膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1(7个柱体积）、60:1(7个柱体积）、30:1(8个柱体 积）、15:1 (7个柱体积)和1:1 (5个柱体积)的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤 (C)中组分4(38g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(10个柱体积）、12:1(8个柱 体积）和5:1(6个柱体积）的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2 (1 Ig)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65 %的甲醇水溶液等度洗 脱，收集8-11个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)(26mg)。
[0037] 结构确证：
[003引无色粉末;HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 493.2604,结合核磁特征可得分子式为 C2姐38〇6，不饱和度为 10。核磁共振氨谱数据SH(ppm，DMSO-ds，500MHz):H-2(2.99，dd，J = 18.8.3.3) ，H-2(2.49，dd，J=18.8,2.2)，H-3(4.29，dd，J = 3.3,2.2)，H-4(3.69，d，J = 9.4)，H-6(3.37，dJ = 3.2)，H-7(2.14，dt，J = 14.6,3.5)，H-7(1.29，dd，J = 14.6，11.3)，H-8(1.62，m)，H-9(1.90，m)，H-ll(1.18，m)，H-ll(0.94，dd，J=13.2,4.0)，H-12(1.88，m)，H-12(1.22，m)，H-14(1.05，m)，H-15(1.64，m)，H-15(1.17，m)，H-16(1.68，m)，H-16(1.36，m)， H-17(1.12，m)，H-18(0.66，s)，H-19(4.19，d，J = 9.0)，H-19(3.86，d J = 9.0)，H-20(1.98， m)，H-21(0.97，d，J = 6.7)，H-22(4.35，dt，J=13.3,3.5)，H-23(2.42，brdd，J = 17.0， 13.3) ，H-23(1.92，m)，H-27(1.88，s)，H-28(1.94，s)，6-OH(3.16，d，J = 9.4);核磁共振碳谱 数据 Sc(ppm，DMS0-d6，125Hz):208.0(C，l-C)，42.8(Ol2,2-C)，74.3(CH，3-C)，69.7(CH，4-C)，60.8(C，5-C)，56.9(CH，6-C)，29.8(Ol2,7-C)，28.8(CH，8-C)，36.9(CH，9-C)，50.1(C， 10-C)，22.1(Ol2，ll-C)，39.3(ai2，12-C)，43.2(C，13-C)，54.8(CH，14-C)，24.2(CH2，15-C)， 27.3(Ol2，16-C)，52.3(CH，17-C)，11.8(CH3，18-C)，63.5(CH2，19-C)，38.9(CH，20-C)，13.5 (C 曲，21-C)，78.4(CH，22-C)，29.7(Ol2,23-C)，149.1(C，24-C)，122.1(C，25-C)，167.2(C， 26-C)，12.6 (C曲，27-C)，20.7 (C曲，28-C);碳原子标记见图 I。Ih-Ih COSY谱（图 2)表明化合 物（I)含有-C 出 CH(OR)-部分结构[姐 2.99(dd，J=18.8,3.3Hz，H-20)，2.49(dd，J=18.8， 2.2化，护2曰），4.29((1(1，1 = 3.3,2.2化，护3)];歷8幻普中，护3与(：-1(扣2〇8.〇)，护20与(：-4(5 c69.7)，W及H-3与C-5(Sc60.8)的相关性进一步证实了上述结构推测。运些数据表明，化合 物（I)含有另外的环状结构来满足不饱和度为10的要求。化合物(I)中H-3与H-4之间的禪合 表明两者