中，给药的医药组成物的量相应于约0.01%、0.025%、0.05%、0.1%、0.15%至约0.2%重 量的双氯芬酸或在以0.01%增量的任何百分比之间。于此提供的医药组成物的有效剂量借 由在动物模式中比较其在体外活性和体内活性来决定。用以在小鼠和其它动物，至人内的 有效剂量的外插法的方法在本领域为已知;例如，参阅U. S. Pat. No. 4，938，949，其以引用的 方式并入作为参考。
[0045] 根据于此所提供的方法，医药组成物借由任何包含但不限于：注射（例如，皮下 (subcutaneous)、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮内（intradermal)、（眼睛）玻璃体内 (；[111^&￥；[1^6&1));皮下（(31^&1160118150;经过皮肤（(161'1]1&115〇;透过皮肤（1^&118(161'1]1&1);口 月艮(例如，锭、丸剂、药水、可食用胶卷条）；植入式渗透栗（implanted osmotic pump);塞剂、 气溶胶喷雾、局部、关节内、眼睛、鼻吸入、肺吸入、压印进入皮肤和电穿孔 (electroporation)的多种路径传递。在一实施例中，本发明的医药组成物可作为合适的眼 科载具中的溶液给药。
[0046] 在用以局部的眼部给药的医药组成物的形成中，该组合在水中，PH4.5至8.0,例 如，约6.9，包含0.001 %至约0.005 %重量的阿托平和0.1 %至约0.5 %重量的酮咯酸水溶 液。建议溶液借由一天一次放置一滴于患眼中局部施药。
[0047] 在整个适合于所治疗的病症的时间周期中，医药组成物可以单一剂量治疗或多剂 量治疗给药。医药组成物可便于在合适的区间给药，例如，于整个至少三个月、至少一年、或 直到近视的症状和迹像消除的周期中一天一次、一天两次、一天三次、两天一次、三天一次 或每周一次。
[0048]用以减低巩膜软骨生成的方法
[0049] 眼部软骨生成蛋白和/或眼部发炎标志物的调降降低巩膜软骨生成。
[0050] 在一实施例中，一或多个抗软骨生成剂或于此描述的医药组成物的有效量的使用 可改变或降低在需要其的个体内一或多个眼部软骨生成蛋白的量。
[0051 ]眼部软骨生成蛋白的一实例为TGF-β。在一实施例中，TGF-β是选自由TGF-m、TGF-β2、和TGF-03所组成的群组，其全部皆主要位在脉络膜内。眼部软骨生成蛋白的另一范例是 α-SM。眼部软骨生成蛋白的另一范例为C012W-SMA和C〇12主要位在巩膜内。
[0052]在另一实施例中，本发明提供用以减低需要其的个体内诱发软骨生成的炎症的一 或多个抗软骨生成剂或于此描述的医药组成物的有效量的使用。发炎标志物负责诱发包含 但不限于，IL-6和TNF-a的巩膜软骨生成。
[0053] 在另一实施例中，本发明提供用以减低需要其的个体内巩膜软骨生成的一或多个 抗软骨生成剂或于此描述的医药组成物的有效量的使用在其需要的个体内。
[0054] 抗软骨生成剂可为伴随地或非伴随地给药。
[0055] 治疗或减低近视的严重性的方法
[0056]没有被任何特定理论束缚，相信眼睛发炎标志物和眼部软骨生成蛋白，像是TGF-Ka-SMA和C〇12的表现图谱，和巩膜软骨生成和近视相关联。例如且非限制性，图1显示近视 发展的机制，其中在脉络膜内增加 TGF-β和发炎标志物(像是IL-6和TNF-a)的水平导致在巩 膜内a-SMA和C〇12的形成和巩膜软骨生成。巩膜接着经历重新塑模和延长，接着是近视的发 育。
[0057] 本发明提供用以治疗或减低近视的严重性的方法，其是借由给药有效量的一或多 个的抗软骨生成剂于或于此描述的医药组成物予需要近视治疗的近视个体。抗软骨生成剂 可被伴随地或非伴随地投药。方法也包含研究方法和使用，包含治疗抑制个体内近视进程 的体外和体内方法。
[0058] 在一实施例中，用以治疗近视的方法包含鉴别对抗蕈毒碱剂展现副作用的近视个 体，并以有效量的NSAID治疗所述个体，而无抗蕈毒碱剂或以低剂量的抗蕈毒碱剂(例如，阿 托平的0.05%)。
[0059] 本发明的实施例亦借由下列范例说明，其以任何方式皆不被解释为对其范畴施加 限制。在下列范例所述的研究中，除非另有说明，否则遵循常规程序。某些程序以说明目的 在下文中描述。
[0060] 用在范例的材料和方法的描述
[0061] 小鼠：在范例中使用雄野生型C57BL/6小鼠（杰克森(Jackson)实验室）。所有的程 序根据机构IACUC批准的协议以及动物于眼科和视觉研究的使用的ARVO声明（Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research)执行。
[0062]巩膜干细胞/祖细胞（SSPCs)分离和培养:SSPCs被分离且培养如同先前CL ·蔡等 人(CL Tsai et al)所描述的（〈在鼠类巩膜多能干细胞/祖细胞的鉴定〉，调查眼科及视觉 科学期刊；52:5481_5487,2011 年，（Identification of multipotent stem/progenitor cells in murine sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci 52:5481-5487，2011))〇简言之， 获得来自小鼠的巩膜且在解剖显微镜下将巩膜小心地从缘（limbus)和视神经盘（optic disc)切开。在视网膜和脉络膜组织被移除后，巩膜组织被切成小块且以1.5mg/ml第一型胶 原酶(沃辛顿生化股份有限公司，莱克伍德，美国（Worthington Biochemical ,Lakewood, 113八））和211^/1111的中性蛋白酶（(1丨8口386)(罗氏药厂，巴赛尔，瑞士（1?0(3116，1^861， Switzerland))于PBS内于摄氏37°C下分解1小时以释放个别细胞。个别细胞在α-ΜΕΜ (Invitrogen公司，卡尔斯巴德，美国（Invitrogen,Carlsbad,USA))内，以20%多选的（lot-selected)FBS(艾可提，克尔维尔，美国（Equitech-Bio ,Kerrville ,USA))、谷酰氨酸、青霉 素/链霉素和IOOmM 2-疏乙醇（Invitrogen公司）辅助下于5%的C〇2在摄氏37°C下培养8至 10天。
[0063] TGF-β处理：不同的TGF-β的浓度被加入SSPCs的12孔盘内。24小时之后，记录SSPC 的型态的图像。萃取总RNA以更进一步分析。用于免疫荧光法测试的空室玻片（chamber s I ide)培养在相同的条件下被执行。
[0064]软骨细胞分化的诱导：在半汇集，SSPCs被胰酶消化且计数以制造在2ml生长培养 基内2 X IO5个细胞的等分试样，其在500g离心沉降10分钟以获得片状沉淀物。片状沉淀物 在37°C，低于5%的⑶ 2下培养。在12至24小时培养期间，细胞形成不依附试管壁的基本上为 球形的集合体。培养基被加入l〇ng/ml TGF-02和间隔2至3天置换培养基。在第4周收集片状 沉淀物。接着，该片状沉淀物在PBS中洗涤两次，并在4%的三聚甲醛内于室温下固定3小时 并准备以石蜡封埋。取得用于免疫组织化学法的8μπι厚度的切片。
[0065] 免疫组织化学和免疫荧光研究:执行免疫组织化学和免疫荧光法以证实α-SMA蛋 白和C〇12在软骨生成期间的存在。在免疫组织化学，石蜡切片被以20%封闭山羊血清 (blocking goat serum)处理30分钟，接着以一级抗体在4°C培养整夜，一级抗体为以1:200 稀释的兔]^6 3111：；[-31^11^13(阿伯肯公司，梅帝丘拉，加州（41303111，161116(31113,04))和以1: 100稀释的小鼠 IgG2a抗第二型胶原蛋白（anti-type II collagen)mAbb(阿伯肯公司，梅帝 丘拉，加州）。该切片接着以1:200的山葵过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)_接合的 二级抗体（圣塔克鲁兹生物科技公司，圣塔克鲁兹，加州（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz ,CA))处理1小时。接着使用DAB试剂（二胺基联苯胺四盐酸盐 (diaminobenzidine tetrahydrochloride))检测免疫活性。对免疫焚光，以封闭血清处理 低温恒定切片(cryostat section)和再吸水石錯切片，以一级抗体培养，和相应的焚光素 异构硫氢酸盐结合(fluoresce in-isothiocyanate-conjugated)的二级抗体反应，并最后 借着荧光显微镜估量。
[0066] 实时PCR:根据制造商的方案使用Trizol( Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加州）分 离来自每个眼睛里的SSPCs或脉络膜组织的全部RNA。使用iScript One-Step RT-PCR kit with SYBR Green(伯乐，海力克士，美国（Bio-Rad, Hercules ,USA))在 ABI PRISM 7900HT序 列检测系统(ABI PRISM 7900HT sequence detection system)(应用生物系统公司，福斯 特城，美国（Applied Biosystems ,Foster City ,USA))上，根据制造商的说明进行qRT-PCR 分析。用以实验的引子为:a_SMA(正向引子W -ATGCCTCTGGACGTACAACTG-3'，反向引子:5'-CGGCAGTAGTCACGAAGGAAT-3' )，Col2(正向引子 -GTCCTTCTGGCCCTAGAGGT-3'，反向引子： 5' -TGTTTCTCCTGAGCGTCCA-3' ) ,β-actin(正向引子：5' -CATTGCTGACAGGATGCAGA-3'，反向引 子 -CTGATCCACATCTGCTGGAA-3')，和甘油醛3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ,GAPDH)(正向引子 -AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'，反向引子： 5' -ACACATTGGGGGTAGGAACA-3' ) XADPH和β-actin作为控制组。控制组基因的Ct值从a-SMA 和C〇12的Ct值减去以提供半定量的分析，并且评估相对于无处理的倍数变化。
[0067] 小鼠的剥夺性近视：在实验当天（产后天数[P] 21~24)，C57BL/6J小鼠以克他明 (ketamine ) (90mg/kg)和甲苯噻嗪（（10mg/kg)腹膜内注射而被麻醉，且扩散器眼罩 (diffuser eye patch)被缝合在右眼周遭皮肤，而左眼作为控制组。半球型塑料料的扩散 器眼罩为由〇.5mL PCR塑料离心管的盖子制成。小鼠在暖毯上恢复且被监测直到其为完全 可移动的。剥夺性近视的小鼠被收容在透明的塑料笼内，12小时亮光（200 ± 151ux水平照 度）和12小时黑暗21天。在形觉剥夺性近视诱发之前和之后，使用谱域光学相干断层扫描 (spectral-domain optical coherence tomography)以眼部生物计量测量。
[0068] 西方墨点分析:借着使用RIPA蛋白质萃取缓冲剂，从巩膜萃取全部蛋白质。在巩膜 组织的均质化之后，离心样品并收集上清液。使用BCA?蛋白质试验套组(BCATM protein Assay Ki t)(伯乐)测量各样品的蛋白质浓度。