皮肤外用剂组合物及降低来自茶树的皂苷分馏物的毒性的方法_4

文档序号:9797876阅读:来源:国知局
下的实验。将成人男女10人的上臂采用胶带剥离 (Tape Stripping)方法对皮肤障壁给予损伤,并分别涂抹以表14的组成制造的剂型例2和 比较剂型例2两个组,并在7天中用Vapometer (Delf in,芬兰)每天测定比较一次皮肤水分 流失(TWEL)的恢复程度。其中,比较剂型例2中,将赋形剂(vehicle)做为阴性对照组。实 验结果见下表15。表15的结果中,以障壁损伤前和障壁损伤后的处理前的差异作为100% 标准而做了比较。
[0177] 表 14

[0181] 从上表15可知,能够确定当处理含有经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏物的组 合物时,皮肤水分损失量会快速恢复正常,并且障壁损伤会恢复。
[0182] 剂型例3和比较剂型例3~4
[0183] 根据下表16中示出的成分和含量(重量% )配制了剂型例3和比较剂型例3。具 体说明的话,剂型例3是配合了经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏物,比较剂型例3完全没 有包含改善痤疮皮肤的有效成分,比较剂型例4作为抗菌性能的标准物质的含有常用作痤 疮治疗剂的红霉素(erythromycin)。
[0184] 剂型例3、比较剂型例3和比较剂型例4的制造方法如下。完全溶解下表16的A 中的成分,在额外的溶解槽中完全溶解B中的成分之后,将B添加至A中而进行混合加溶 解。此时,将C中的成分按照表16中所记载的配制比例进行添加,混合均匀之后进行过滤, 从而配制出本组合物。
[0185] 表 16
[0187] 试验例13
[0188] 针对痤疮菌的抗菌能力试验
[0189] 采用由剂型例3、比较剂型例3和比较剂型例4的组分配制的各个化妆品组合物, 对作为痤疮致病菌的痤疮丙酸杆菌(ATCC 6919 :培养基-BHI液体培养基(broth))进行了 抗菌能力试验。
[0190] 针对痤疮菌的抗菌能力的试验方法如下。
[0191] (1)准备试验菌液
[0192] 痤疮丙酸杆菌采用在BHl液体培养基中接种并厌氧培养的培养液。
[0193] (2)准备稀释溶液
[0194] 在15mL的BHl液体培养基(pH为6. 8)或者LB液体培养基(pH为4. 5)中添加 0. 15mL的上述试验菌液,将混合均匀的溶液用作稀释溶液。
[0195] ⑶准备样品
[0196] 将从剂型例3、比较剂型例3和比较剂型例4中配制的化妆品组合物的原溶液用作 样品。
[0197] (4)抗菌能力试验
[0198] 1)在96孔板的第一行中分别添加样品而符合初始浓度,并且添加稀释溶液直至 总量为200 μ 1。
[0199] 2)均匀混合第一行的混合液后,取100 μ 1添加至第二行中并均匀混合,之后再取 100 μ 1添加至第三行中,通过上述方法进行二倍稀释(double dilution)。
[0200] 3)在32°C中静置培养24小时和48小时之后,判断菌体是否增殖成悬浊的程度, 并采用MIC(最小抑制浓度,Minimum Inhibitory Concentration)值决定没有增殖的最小 浓度。如果混合液不透明而很难判断菌体是否增殖时,采用显微镜观察而确定。
[0201] 下表17示出了针对痤疮菌的抗菌能力试验结果。MIC换算成包含在剂型中的有效 成分的浓度以进行标记。
[0202] 表 17
[0204] MIC中浓度越小表明是针对痤疮菌的抗菌能力越有效的物质,在剂型例3与采用 作为公知的痤疮治疗剂的红霉素的比较剂型例4相比,ppm浓度明显更小,因此,能够确定 的是含有经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏物的组合物对试验菌具有更优异的抗菌能力。
[0205] 试验例14
[0206] 抑制脂质(Lipogenesis)合成的试验
[0207] 将作为活鼠的成纤维细胞系(fibroblast cell line)的3T3-L1细胞以IXlO5 的量附着在6孔培养板(culture plate)上,该6孔培养板上添加有含有胎牛血清(FBS, fetal bovine serum)的DMEM(生命科技公司)培养基。经过2天后,换成新的DMEM(含 10%的FBS)培养基,再培养2天。之后,通过含有lyg/mL的胰岛素(insulin)、0. 5mM的 IBMX以及0· 25 μ M的地塞米松(dexamethasone)的DMEM (含10 %的FBS),再次诱导上述培 养的细胞进行分化,处理50 μ M的上述实施例1中的经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏物 和咖啡因,经过2天后,再次换成含有胰岛素的DMEM,培养5天。5天后,再次换成正常培养 基(DMEM,含10%的FBS),培养至上述细胞在形状上变化成脂肪细胞,并在培养过程中进行 观察。
[0208] 为了评价经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏物对脂肪细胞内脂肪蓄积的抑制效 果,采用上述已分化的3T3-L1脂肪细胞对其进行了苏丹III染色(S4136, Sigma-Aldrich 公司)。在常温下,将脂肪细胞用多聚甲醛(pH为7. 2)固定于磷酸盐缓冲液中,之后用PBS 水洗,之后用苏丹III染色,之后照相,并通过肉眼进行比较。对照组仅使用了未添加试验 物质或比较物质的培养基,作为其他比较组处理了 50 μ M的咖啡因。对脂肪蓄积抑制程度 通过将染色程度分为+++、++、+、_赋予了等级。结果见表18。
[0209]表 18
[0211] 从上表18所示的可知,本发明中采用的经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏物具 有抑制脂质合成的效果。因此,通过抑制脂质合成而减少皮脂,因此能够抑制痤疮的产生。
[0212] 试验例15
[0213] 改善痤疮、减少皮脂分泌以及有无刺激的试验
[0214] 将有痤疮的30人分成3组,每组10人,使每个组中相应的被试者使用上述剂型例 3、比较剂型例3和比较剂型例4中制造的化妆品组合物,使用一个月。痤疮改善尺度设置 为1分至5分,1分表不"没有",3分表不"一般",5分表不"非常好"。下表19中,米用10 人的平均分记载为实验结果。
[0215] 痤疮消失时期以判断消失的日期做为基准,痤疮复发采用"有无"记载,将1个月 后的结果做为基准。皮脂分泌减少设置为1分至5分,1分表示"没有",3分表示"一般",5 分表示"非常好"。下表19中,采用10人的平均分记载为实验结果。皮肤刺激的有无通过 (有刺激反应的人数)八总试验者数)为基准。
[0216] 表 19
[0218] 如上表19所示,可知剂型例3与比较剂型例3相比,痤疮没有复发,整体上对改善 痤疮具有优异的效果。另外,在含有抗菌能力标准物质的比较剂型例4中显示出痤疮改善 效果,但是使用时刺激大,因此长期使用时具有刺激皮肤的危险,而根据本发明的组合物与 比较剂型例4相比显示出刺激小或者没有刺激。
[0219] 试验例16
[0220] 炎症改善效果
[0221] 通过抑制产生前列腺素的效果来评价抗炎症效果。采用经酶处理的来自茶树根 的皂苷分馏物,将巨噬细胞作为对象测定了效果。首先,在提取自老鼠腹腔的巨噬细胞 中添加阿司匹林,并使其最终浓度为500 μ M,从而不可逆地抑制残留于细胞中的环氧合 酶(cyclooxygenase,COX)的活性。之后,将100 μ 1的上述悬池液添加至96孔的细胞 培养管的各个孔中,在5% 0)2和37°C条件的培养箱中培养2个小时,从而将巨噬细胞附 着在容器表面上。接着,用PBS洗涤附着的巨噬细胞3次,之后将其用于炎症改善效果试 验。在上述经培养的5X10 4细胞/mL的巨噬细胞中添加含有1% (w/v)的脂多糖(LPS, lypopolysaccaride)的RPMI培养液中,培养12个小时后,诱发产生前列腺素,并采用酶免 疫分析法(ELISA)定量通过处理100 μ 1的上述实施例1的经酶处理的来自茶树根的皂苷 分馏物而分离出的前列腺素。
[0222] 此时,针对经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏物的前列腺素的生成抑制活性,将 在处理LPS的组和未处理的组中分别产生的前列腺素的差值设定为100%,通过采用与LPS 和样品一同进行处理而减少的前列腺素的百分率,与对照组做了比较和判断,下表20示出 了其结果(抑制生成前列腺素的效果)。
[0223] 表 20
[0225] 如见上表20,从实验结果可知,与用阿司匹林处理的对照组相同地,当处理经酶处 理的来自茶树根的皂苷分馏物时,抑制前列腺素生成效果也非常明显。
[0226] 由此可知,本发明的经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏物能够提供优异的炎症改 善效果。
[0227] 另外,可知来自茶树根的皂苷分馏物能够抑制作为皮肤致炎因子的前列腺素的表 达,从而能够防止产生皮肤问题,并且能够改善皮肤。
[0228] 试验例17
[0229] 美白效果
[0230] 〈抑制酪氨酸酶的效果〉
[0231] 酪氨酸酶是从蘑燕类(Mushroom)提取的,采用了西格玛(Sigma)公司的产品。首 先,作为基质的酪氨酸溶解于蒸馏水中,并配制成〇. 3mg/ml的溶液,向每个试验管中均加 入1.0 ml的上述溶液,之后向其中添加 1.0 ml的磷酸钾缓冲液(0. 1摩尔浓度、pH为6. 8)和 〇. 7ml的蒸馏水。
[0232] 将本发明的上述实施例1中的经酶处理的来自茶树根的皂苷分馏混合于乙醇溶 液至适当浓度,并向反应液中加入0. 2ml准备好的各个样品液,之后在37°C恒温槽中反应 10分钟。其中,对照组中仅添加〇. 2ml的溶剂以代替各个样品液,阳性对照组采用抗坏血 酸。在该反应液中加入〇. Iml的2500单位/ml的酪氨酸酶溶液,在37°C的恒温槽中再次反 应10分钟。将装有该反应液的试验管置于冰水中而进行快速冷却
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