2] 实施例1
[0023] 将EV71-MZ201405和CVA16-MZ201509分别感染Vero或RD细胞，在不同药物浓度下， 发明人通过流式分析病毒基因组携带的报告基因 GFP的表达情况、观察病毒感染引起的细 胞病变效应(CPE)、以及空斑分析子代病毒的产生情况，评价了夫西地酸钠对病毒EV71和 CAV16的复制是否具有抑制作用、对宿主细胞是否具有保护作用。
[0024] 1.1药物的细胞毒效应:将293A-SCARB、RD以及Vero细胞按1χ104/每孔分别接种于 96孔中，在5%⑶2、37°C条件下培养过夜，经一系列倍比稀释的夫西地酸处理细胞48h后，用 MTT法检测药物对细胞的毒性；以相同条件下培养、未经药物处理的细胞为对照;每组细胞 三个重复孔，计算各组细胞的生长抑制率。生长抑制率=[(对照组平均0D值-实验组平均0D 值)/对照组平均0D值]X 100%。结果显示夫西地酸钠对293A-SCARB2、RD和Vero细胞的CC50 均大于256μΜ。
[0025] 1 · 2通过显微镜观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE)，检测夫西地酸抗 EV71和CVA16、保护细胞的效果:病毒介导的CPE指病毒在细胞内增殖引起的细胞退形性病 变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落等，是判断病毒增殖的最常用指标之一。 将RD细胞接种于96孔中，在5%⑶ 2、37°C条件下培养18-20h后，分别将1000TCID50的EV71-MZ201405和CVA16-MZ201509病毒感染lh，更换含有不同浓度夫西地酸钠的培养基，置于37 °C，5%C0 2培养箱中培养，每天在显微镜下观察细胞病变状态，当未加药物的对照细胞出现 75 %以上病变时，终止实验，观察并记录加药组的CPE程度，CPE的记录方法为:无 CPE为， 25%细胞出现病变为"+" ；25%~50%细胞病变为"++" ；50%~75%细胞病变为"+++" ；75% ~100%的细胞病变为"++++"，结果见表1。夫西地酸具有CPE抑制效应，随着药物浓度升高 CPE效应逐步减轻、细胞状态变好。
[0026] 表1.夫西地酸对EV71(MZ201405)和CVA16(MZ201509)引起的CPE的拮抗作用 rnrmi
[0028] 1.3流式分析GFP检测夫西地酸对EV71-GFP的抗病毒效果:将Vero细胞接种于96孔 板中过夜培养，按MOI = lPFU/cel 1接种EV71-GFP病毒，感染lh后更换为含有高（100μΜ)、中 (20μΜ)、低（ΙμΜ)三种浓度的夫西地酸钠培养基，在5%⑶ 2、37°C培养18-20h后，经胰酶消 化、PBS清洗、多聚甲醛固定，用流式细胞仪分析细胞的GFP荧光表达情况，以未加药物的GFP 阳性细胞率作为100%，计算药物处理后的GFP阳性细胞相对百分比，数值为三次重复实验 的平均值土 SD。夫西地酸抑制EV71-GFP表达的效果明显，结果见图1。
[0029] 1.4产毒量减少分析夫西地酸对EV71和CVA16的抗病毒活性:将EV71-MZ201405和 CVA16-MZ201509(M0I = 0.01PFU/cell)分别与RD细胞孵育lh后去除病毒上清，分别添加含 有不同浓度夫西地酸钠的培养基，药物浓度呈倍比稀释，分别为〇. 25、0.5、1、2、4、8、16、32、 64、128和256μΜ;以未加药物的感染细胞为对照。感染后48h后收集上清，采用空斑法测定病 毒滴度。将对照细胞上清测得的病毒滴度设定为100%，经药物处理的细胞上清中的相对病 毒滴度（％ )=(对照组病毒滴度-药物处理组病毒滴度)/对照组病毒滴度X 100%。每种药 物浓度下的相对病毒滴度百分比为三次重复实验的平均值土SD。以药物浓度的对数值做横 坐标、相对病毒滴度为纵坐标，通过SPSS 20软件使用Probit回归法计算药物抑制空斑形成 的EC50(图2)，夫西地酸对EV71和CVA16表现出明显的抗病毒活性。
[0030] 1.5空斑法测定病毒滴度:将RD细胞接种于96孔板，lxl04cell/ml，过夜培养后，接 种按10倍比稀释的病毒上清，每种稀释度接种10个孔，测定TCID50。将Vero细胞接种于6孔 板中，在5%C02、37°C条件下培养18-20h后，将100TCID50的EV71-MZ201405或CVA16-MZ201509病毒感染lh，弃去上清，加入含1.2%甲基纤维素以及不同浓度夫西地酸钠的培养 基培养4天左右，经多聚甲醛固定、结晶紫染色、清水漂洗、晾干后作空斑计数，计算病毒滴 度。
[0031] 实施例2
[0032] 2.1检测夫西地酸加入时间对抗病毒活性的影响:将5xl04个RD细胞接种至24孔板 培养18~24h后用M0I = 5的EV71-MZ201405感染，于感染前lh(-l)及感染后0h、lh、2h、4h、 6h、8h加入100μΜ的夫西地酸钠，感染后10h收集上清，通过空斑分析测定病毒滴度。作为对 照，将病毒感染细胞后，在不同时间点单加 DMS0,于感染后10h收集上清并测定病毒滴度，排 除溶剂DMS0对病毒产生的影响。如图3所示，感染前至感染后2h加入药物具有相似的抑制病 毒产生活性，感染4h后再加入夫西地酸钠则对病毒滴度的抑制效应明显减弱，说明夫西地 酸在病毒复制的早期阶段(包括吸附、进入及脱衣壳)或晚期阶段(组装及释放)并不发挥作 用，此结果提示夫西地酸阻断EV71的复制很可能发生在RNA复制或蛋白合成阶段。
[0033] 2.2RT-QPCR检测夫西地酸对病毒RNA合成的影响：将5xl04Vero细胞接种于24孔 板，培养24小时后用M0I = 10的EV71-MZ201405感染lh，去除病毒上清并加入含有DMS0或100 μΜ夫西地酸钠的培养基。于感染后211，411，611，811分别用1^2〇1提取细胞总8~4。经0他86消化 后，根据PrimeScript RT reagent Kit说明书进行反转录;然后以cDNA为模板进行QPCR;针 对 EV7 1 的弓| 物为 5 '-TGTATGTCTCATTATCAGGGG-3 '（ SEQ ID No.l)和5'-CCACCTGTTGCTTGTAACCGT-3'（SEQ ID No. 2)，扩增子为EV712C片段；以细胞的GAPDH为内参 进行校正，引物为5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'（SEQIDNo·3)，5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（SEQ ID No.dCR采用两步法：94￡€3086(：，941€586(3,601€3086(3,42〇7(3168。211时对照 细胞的病毒RNA相对丰度设定为1，实验重复三次。如图4所示，夫西地酸对病毒RNA能明显抑 制病毒RNA的合成，阻断机制可能发生在RNA复制或病毒蛋白合成环节。该结果与药物加入 时间对抗病毒活性的影响一致。
[0034]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用，其特 征在于，所述药物是以夫西地酸或其药用盐为有效成分与药学可接受的辅料组合制成。3. 根据权利要求2所述的夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用，其特 征在于，所述药物为口服制剂、注射制剂或局部施用制剂。4. 根据权利要求1所述的夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用，其特 征在于，所述药用盐为钠盐。
【专利摘要】本发明公开了夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用。夫西地酸或其药用盐临床副反应较少、毒性低、安全性高，且具有抗肠病毒EV71和柯萨奇病毒CAV16活性，具有开发为治疗手足口病的药物或先导化合物的潜在应用价值。
【IPC分类】A61K31/56, A61P31/14
【公开号】CN105582015
【申请号】CN201610008433
【发明人】曾施暖, 郭学敏
【申请人】中山大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年1月4日