例1:阿霉素热敏纳米脂质体(DPPC-D0X-Fe304liposome)的制备及表征测定
[0042]准确称量胆固醇2mg、DPPC16mg、PEG-DSPE 2mg置于茄形瓶中，缓缓加入3ml甲醇和6ml氯仿，短时超声迅速混勾后，旋转蒸发成圆形、白色、均勾的脂质薄膜。在1mL 0.3mo 1/L柠檬酸溶液(pH 4.0)中加入30mg Fe3O4,短时超声混匀后对脂膜进行水化，制备脂质体。将所制得脂质体中加入盐酸阿霉素，并用Imo I/I Na2HPO4将pH值调节至7.0，55°C水浴30min即制得磁性热敏阿霉素脂质体。
[0043]取脂质体稀释10倍后于铜网点样，待干燥后使用透射电镜(TEM)观察脂质体表征及粒径大小，并用粒径分析仪测定其粒径大小。
[0044]取Iml脂质体，于37°C摇床中用PBS透析，分别在2、4、6、8、12、16、24、48小时后打开透析袋取出10yL，并加入10yLPBS补足。取出的10yL于480nm处测定DOX含量，绘制脂质体稳定性曲线，表面制备的脂质体有一定的缓释性。
[0045]实施例2:131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体(m1-RGD-DPPC-D0X-Fe30d iposome)的制备及标记条件优化
[0046]称取1.5mg c(RGDyk)溶于5yL甲醇中，加入45yLPBS，短时超声混匀；称取Img氯胺-T和偏重亚硫酸钠，配制成10mg/mL相应溶液。取ImCi 131I，加入至R⑶环肽溶液与氯胺-T混合液中，室温反应5min，加入偏重亚硫酸钠终止反应。将产物与15ml水混合过C18柱，并再用15ml水淋洗C18柱3次，以300yL盐酸乙醇作为淋洗液，回收标记上131I的c(RGDyk)。
[0047]准确称取1.5mg DSPE-PEG-NHS溶于新鲜蒸馏的无水无氨的DMF中。将DSPE-PEG-NHS溶液逐滴加入1311-CRGD溶液中，室温避光搅拌，I天后终止反应。反应液置透析袋(Mw2000)中，于去离子水中透析12h后冷冻干燥。准确称量DPPC 2mg、胆固醇16mg、DSPE_PEG-NHS-cRGD 3mg混合置于前形瓶中，加入3ml甲醇和6ml氯仿，超声混勾后，旋转蒸发形成白色、均勾的脂质薄膜。在1mL 0.3mol/L梓檬酸溶液(pH 4.0)中加入3011^ Fe3(k，短时超声混匀后对脂膜进行水化，制备脂质体。将所制得脂质体中加入盐酸阿霉素，并用Imo 1/LNa2HPO4将pH值调节至7.0，55°C水浴30min即制得修饰1311-CR⑶磁性热敏阿霉素脂质体。
[0048]实施例3:不同浓度131I标记的C(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体(1311-RGD-DPPC-DOX-Fe3Od iposome)对细胞的影响
[0049 ]在96孔板中加入MCF-7细胞，分为四组，分别加入实例1、2中制备的脂质体、游离DOX和对照组，按DOX浓度加入为5yg/mL、10yg/mL、20yg/mL、30yg/mL、40yg/mL的相应脂质体和游离药物，48小时后每孔加MTT液20yL，继续培养4小时之后吸尽上清，每孔加入DMSO 150μ?，振荡溶解10分钟。用酶标仪在492nm下测定OD值。根据公式“细胞抑制率(％ )=(对照组OD值一各实验组OD值)/对照组OD值X 100 %”计算细胞抑制率，结果见图4。其中游离DOX的IC50约为25yg/mL。结果显示实例2制备的脂质体杀伤作用最高，能抑制乳腺癌细胞生长。
[0050]实施例4:1311-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4脂质体在荷瘤裸鼠体内的生物分布[0051 ]将9只荷瘤裸鼠随机分为3组，每组3只。各组自尾静脉分别注射1311-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4脂质体(100yCi/0.2ml)并于注射后Ih和24h各时间点将各组小鼠断颈处死，取血、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、膀胱和肿瘤等主要脏器，称湿重、测量放射性计数率值，经放射性衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(% ID/g)。
[0052]结果如图5所示:经尾静脉注射1311-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4脂质体后，1311-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4脂质体在荷瘤裸鼠体内主要分布于肝脏、肾脏及肿瘤组织，注药后血中放射性留存时间久。肿瘤组织放射性于肿瘤与对侧肌肉(T/Μ)的放射性比值大于5，说明脂质体靶向性良好。
[0053]以上已对本发明的技术内容作了详细说明。对本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都不会超出本申请所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.131I标记的C(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体，其特征在于:所述的131I标记的C(RGDyk)革E向阿霉素复合热敏纳米脂质体的结构为:131I与c (RGDyk)相偶联，c (RGDyk)则通过磷脂-聚乙二醇-活性酯(DSPE-PEG-NHS)活化插入包裹阿霉素及磁性颗粒的脂质体的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)分子层中。2.如权利要求1所述的131I标记的C(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体，其特征在于:所述的C(RGDyk)是含有精-甘-天冬氨酸序列的环肽，其中含有精-甘-天冬氨酸序列，并包含酪-赖氨酸，由酰胺键-成环。3.如权利要求2所述的131I标记的C(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体，其特征在于:所述的赖氨酸可由其他氨基酸取代。4.如权利要求1所述的131I标记的C(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体，其特征在于:其阿霉素由其他抗乳腺癌的水溶性药物替代，水溶性药物包括吉西他滨或米托蒽醌。5.131I标记的C(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体制备，其特征在于:所述制备包括以下步骤: (1)采用改良化学共沉淀法制备铁氧磁性纳米粒子: 在N2气条件下将FeCl2.4H20和FeCl3.6H20按n(Fe2+):n(Fe3+)摩尔比2-3:1溶于去离子水中，将浓度为0.4-1.0mol/L的氨水缓慢滴入该溶液中，同时通过磁力搅拌混匀，通过水解产生黑色的晶体粒子，再继续滴入氨水，调PH至8.0-10.0，使溶液呈碱性，加热使磁铁分散开，离心并洗涤，将沉淀加入到酸性溶液中，在温度60-800C下经胶溶化处理得到棕色胶体溶胶； (2)碘化反应: 称取c(RGDyk)溶于甲醇/乙醇、pH = 7.4的PBS中，配制成10mg/mL的RGD环肽溶液，甲醇/乙醇与TOS的体积比为1:10-50;称取氯胺-T和偏重亚硫酸钠，配制成相应溶液，将131I加入至R⑶环肽溶液与氯胺-T混合液中，每500-50000yCimI对应0.5-lmgR⑶环肽溶液和10-50μg氯胺-T，室温反应0.5-30min，加入偏重亚硫酸钠终止反应，偏重亚硫酸钠与氯胺-T重量比为1:1;将产物对应与15ml水混合过C18柱，并再用15ml水淋洗C18柱2-4次，每次均测定C18柱的放射活性，淋洗至其放射性不发生改变为止，再用盐酸乙醇作为淋洗液，回收标记上131I 的 c(RGDyk); (3)脂质体制备: 称取DSPE-PEG-NHS溶于新鲜蒸馏的无水无氨的DMF中，终浓度为lmg-5mg/ml，将DSPE-PEG-NHS溶液逐滴加入1311-CR⑶溶液中，DSPE-PEG-NHS与1311-CR⑶的摩尔比为3:1-2，室温避光搅拌，I天后终止反应，反应液置Mw2000透析袋中，于去离子水中透析12h后冷冻干燥； 准确称量DPPC、胆固醇、DSPE-PEG-NHS-m1-cRGD混合置于茄形瓶中，DPPC、胆固醇与DSPE-PEG-NHS-m1-cRGD的质量比为8:1: I，加入体积比为2:1的氯仿和甲醇的混合液，混合液与胆固醇的体积重量比为9:2ml/mg，超声混匀后，旋转蒸发形成白色、均匀的脂质薄膜； 配制pH 4.0的柠檬酸溶液，加入与柠檬酸溶液质量比为1:60-300的Fe3O4纳米粒子，超声混匀，用此溶液对磷脂膜进行水化，制备脂质体;将所得脂质体加入与柠檬酸溶液体积比为1:100-500的111^/1111盐酸阿霉素，并用111101/1 Na2HPO4将pH值调至7.0，水浴即得修饰1311-cRGD的载阿霉素磁性脂质体。6.如权利要求5所述的制备，其特征在于:步骤(2)中，称取C(RGDyk)溶于甲醇与pH =7.4的PBS中；每 1000-5000yCimI对应0.5-lmgRGD环肽溶液和 10_50yg氯胺-T，20_25°C反应0.5-10mino 7.包含如权利要求1所述的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体的药物组合物，其特征在于:所述的药物组合物以131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体为活性组分，与药学上可接受的赋型剂一起制备成药物组合物。8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于:所述药物组合物的剂型为注射液、粉剂、胶囊、膏剂、霜剂、乳剂或敷贴剂。9.如权利要求1所述的131I标记的C(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体用于单光子发射计算机断层显像或正电子发射计算机断层显像的用途。10.如权利要求1所述的131I标记的C(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体用于预防、诊断及治疗乳腺癌肿瘤相关药物中的用途。
【专利摘要】本发明公开了131I标记的环RGD肽靶向的阿霉素热敏纳米脂质体及其制备与应用，属于医药技术领域，131I标记的环RGD肽靶向阿霉素热敏纳米脂质体的结构为：131I与c(RGDyk)相偶联，c(RGDyk)则通过DSPE-PEG-NHS活化插入包裹阿霉素及磁性颗粒的脂质体的DPPC分子层中。本发明主要应用于乳腺癌肿瘤的治疗诊断及预防，其优点是以脂质体为载体，以整合素αvβ3为作用靶点，将化疗、放疗、热疗三者有机结合起来，并通过c(RGDyk)靶向性作用于肿瘤，不仅能提高肿瘤的杀伤率，而且对正常机体的影响较小，尽量满足了特异性、安全性、有效性等方面的要求。
【IPC分类】A61K47/18, A61P35/00, A61K9/127, A61K51/12, A61K41/00, A61K31/704
【公开号】CN105663043
【申请号】CN201610022366
【发明人】陈道桢, 唐秋莎, 陈钰, 李向东, 杨蕊, 陈万瑛, 田新梅
【申请人】无锡市妇幼保健院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月13日