一种蓝萼甲素长循环纳米脂质体及其制备方法与应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及医药制剂
技术领域：
，具体地说，是一种蓝萼甲素类药物纳米脂质体及其制备方法以及在乳腺癌治疗中的应用。【
背景技术：
】[0002]蓝萼甲素为15-氧-16贝壳杉烯骨架结构的二萜类化合物，是蓝萼香菜二萜类化合物的主要活性成份。具有心血管保护、抑菌、抗凝血、耐缺氧、抗乙肝病毒、抗肿瘤、内皮保护、免疫抑制及调节钙离子浓度等多种药理作用，并且有很高的体内安全性。民间常用于治疗胃炎、乳腺炎、肝炎，腹痛，关节痛等疾病，临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛、脑供血不足等缺氧性心脑血管疾病。[0003]因其水溶性差，给药困难，且在体内代谢很快，如在肝微粒体中可代谢生成羟基或双羟基产物，在胆汁中可代谢成异构化产物，因而需长时间大剂量给药才能产生疗效。[0004]纳米脂质体是指粒径控制在10nm左右并用亲水材料如聚乙二醇进行表面修饰的纳米脂质体在静脉注射后兼具“长循环(Long-Circulat1n)”和“隐形(Stealthy)”或“立体稳定(Stereo-Stable)”的特点，对减少肝脏巨噬细胞对药物的吞噬、提高药物靶向性、阻碍血液蛋白质成分与磷脂等的结合、延长体内循环时间等具有重要作用。[0005]由于脂质体为脂质双分子层结构，能包载脂溶性药物，改善其水溶性差的不足，增加药物的包载量;在纳米脂质体靶向到病变部位的同时，由于其含有的亲水基团而能阻止血液中许多不同组分特别是调理素与其结合，从而降低与单核吞噬细胞系统的亲和力，可在循环系统中稳定存在并延长半衰，增加肿瘤组织对它的摄取，增强了治疗效果。[0006]目前对蓝萼甲素的剂型研究较少，蓝萼甲素纳米脂质体在药物的增溶、缓释及靶向等方面均表现出非常好的应用前景。【
发明内容】[0007]本发明的目的在于提供一种蓝萼甲素纳米脂质体及其制备方法以及在乳腺癌治疗中的应用。[0008]本发明的技术方案包括:[0009]制备一种蓝萼甲素纳米脂质体；[0010]载药纳米脂质体体外抗乳腺癌及乳腺癌干细胞活性分析；[0011]本发明采用无血清培养方法分选富集乳腺癌干细胞，并通过乳腺癌干细胞的特异性抗原标记物⑶24/⑶44进行鉴定。[0012]首先，本发明的第一方面，提供了一种蓝萼甲素纳米脂质体，包含蓝萼甲素药物，药学上可接受的生物学载体和配体，以及有机相和水相介质;所述的载体为卵磷脂和胆固醇(CHOL)，所述的配体为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2k)。[0013]所述的蓝萼甲素纳米脂质体的平均粒径小于200nm，并且是可无菌过滤的。所述的蓝萼甲素纳米脂质体是蓝萼甲素纳米脂质体的无菌制剂，采用薄膜分散法制备得到。[0014]所述的蓝萼甲素纳米脂质体中蓝萼甲素药物为有机相的0.l%-0.3%(w/v)，优选的蓝萼甲素为有机相的0.3%。[0015]所述的蓝萼甲素纳米脂质体中生物学载体与配体的摩尔比为19:1-19:3，优选的比例为生物学载体与配体的摩尔比为19:2。[0016]所述的蓝萼甲素纳米脂质体中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为85:10-1:1，优选的比例为卵磷脂与胆固醇的摩尔比为85:10。[0017]所述的蓝萼甲素纳米脂质体中卵磷脂选自蛋黄卵磷脂(优选E80)，大豆卵磷脂(优选S100)或氢化大豆卵磷脂HSPC中的一种或几种，优选的卵磷脂为大豆卵磷脂S100;所述的胆固醇为普通胆固醇。[0018]所述的蓝萼甲素纳米脂质体中的水相介质为0.9%(w/v)氯化钠溶液，去离子水或PBS(pH为7.4)，优选的水相介质为0.9%(w/v)氯化钠溶液。[0019]所述的蓝萼甲素纳米脂质体中的有机相为氯仿和甲醇，优选的有机相为氯仿。[0020]其次，本发明的第二方面，提供上述蓝萼甲素纳米脂质体的制备方法，采用薄膜分散法，具体制备方法如下:[0021]A.有机相配制:将载体和配体以及蓝萼甲素药物分散于有机相中；[0022]B.水相配制:将水相介质预热；[0023]C.然后将有机相超声混匀后放入圆底烧瓶中，通过旋转蒸发使形成均匀薄膜;将水相介质倒入圆底烧瓶中加热进行水化;将水化好的液体进行冰浴超声得到蓝萼甲素纳米脂质体。[0024]所述的得到的蓝萼甲素纳米脂质体采用透析法或超速离心法除去游离药物并通过0.22μπι的聚碳酸酯膜除菌。[0025]所述的步骤C中水化温度为50-60°C，优选温度为55°C。[0026]所述的步骤C中水化时间为30-50min，优选时间为30min。[0027]所述的步骤C中超声的功率为200-400w，优选的超声功率为300w。[0028]所述的步骤C中超声时间为8-30min，优选的超声时间为8min。[0029]优选的，上述蓝萼甲素纳米脂质体的制备方法，采用薄膜分散法，具体制备方法如下:[0030]I)有机相配制:称取卵磷脂、胆固醇及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000分散于有机相中混合均匀后称取蓝萼甲素药物混合于有机相中；[0031]2)水相配制;将5ml0.9%氯化钠溶液预热到55°C;[0032]3)有机相超声混匀，加入250ml圆底烧瓶通过旋转蒸发仪减压旋蒸5min，旋蒸温度为40°C，使形成均匀分散的薄膜；[0033]4)将预热好的0.9%的氯化钠溶液加入圆底烧瓶，旋蒸30min制成初乳，旋蒸温度为55°C。[0034]5)将初乳在冰浴条件下进行探头超声，超声功率为300w，超声时间为Smin得纳米脂质体。[0035]6)采用透析法或超速离心法去除游离药物并通过0.22μπι碳酸脂膜过滤得到纳米脂质体。[0036]最后，本发明的第三方面，提供上述任一蓝萼甲素纳米脂质体在制备治疗乳腺癌药物中的应用。[0037]所述的蓝萼甲素纳米脂质体用于制备非胃肠道给药的医药产品。所述的蓝萼甲素纳米脂质体可以直接静脉注射。[0038]所述蓝萼甲素纳米脂质体靶向乳腺癌细胞或乳腺癌干细胞。[0039]本发明采用cck-8检测方法测定在不同给药剂型、给药时间和给药浓度处理情况下乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的细胞存活率，来评价蓝萼甲素脂质体对乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的细胞毒性。经拟合曲线分析，比较不同处理情况下的Ic50值来比较其毒性大小。[0040]本发明制备的载蓝萼甲素纳米脂质体利用纳米脂质体缓释，靶向等性质可改善蓝萼甲素水溶性差，体内代谢快，给药困难等不足，本发明的蓝萼甲素纳米脂质体在药物的增溶、缓释及靶向等方面均表现出非常好的应用前景。【附图说明】[0041]图1A为本发明的蓝萼甲素纳米脂质体的粒径分布图，图1B为表面电位图；[0042]图2为本发明蓝萼甲素纳米脂质体的透射电镜图；[0043]图3为本发明蓝萼甲素纳米脂质体的释放行为图；[0044]图4A本发明空白纳米脂质体对suml49PT细胞毒性图，图4B为本发明空白纳米脂质体对suml49PT-TS细胞毒性图；[0045]图5A，B，C为本发明蓝萼甲素纳米脂质体对suml49PT细胞的24h，48h，72h的杀伤效果图，图，E，F为本发明蓝萼甲素纳米脂质体对suml49PT-TS细胞的24h，48h，72h的杀伤效果图；[0046]图6A为本发明蓝萼甲素纳米脂质体对suml49PT细胞杀伤效果的统计图，图6B为本发明蓝萼甲素纳米脂质体对suml49PT-TS细胞杀伤效果的统计图。【具体实施方式】[0047]下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不限制本发明。除特有说明外，所有比例均为摩尔比，所有的％均为重量体积浓度。[0048]实施例1[0049]有机相配制:将HSPC:CHOL:DSPE_PEG_2k为85:10:10加入有机相中，将蓝萼甲素当前第1页1 2 3 4