0185]有机相配制:将SlOO:CHOL:DSPE_PEG_2k为75:20:10加入有机相中，将蓝萼甲素药物(0.1%)分散于有机相中；
[0186]有机相超声混勾，加入250ml圆底烧瓶通过旋转蒸发仪减压旋蒸5min，旋蒸温度为400C，使形成均匀分散的薄膜。
[0187]水相配制;将5ml0.9%氯化钠溶液预热到55°(:;
[0188]将预热好的0.9%的氯化钠溶液加入圆底烧瓶，旋蒸50min制成初乳，旋蒸温度为55。。。
[0189]将初乳在冰浴条件下进行探头超声，超声功率为200w，超声时间为30min得纳米脂质体。
[0190]将纳米脂质体通过0.22μπι碳酸脂膜过滤。
[0191]该纳米脂质体混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为81.30±
0.440nm，其稳定性 >48h。
[0192]实施例19
[0193]有机相配制:将SlOO:CHOL:DSPE_PEG_2k为85:10:10加入有机相中，将蓝萼甲素药物(0.3%)分散于有机相中；
[0194]有机相超声混勾，加入250ml圆底烧瓶通过旋转蒸发仪减压旋蒸5min，旋蒸温度为400C，使形成均匀分散的薄膜。
[0195]水相配制;将5ml0.9%氯化钠溶液预热到55°C ;
[0196]将预热好的0.9%的氯化钠溶液加入圆底烧瓶，旋蒸30min制成初乳，旋蒸温度为55。。。
[0197]将初乳在冰浴条件下进行探头超声，超声功率为300w，超声时间为Smin得纳米脂质体。
[0198]将纳米脂质体通过0.22μπι碳酸脂膜过滤。
[0199]该纳米脂质体混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为93.95±0.59nm，其稳定性>48h。
[0200]实施例20载药纳米脂质体的制备与表征
[0201]采用薄膜分散水化法，制备载蓝萼甲素药物的纳米脂质体。简要步骤如下:将S100:CH0L:DSPE-PEG-2k按摩尔比为85:10:10的比例精密称取，并精密称取0.3%的蓝萼甲素药物充分溶解于三氯甲烷溶液中并转移至250ml圆底烧瓶中，40°C条件下真空旋蒸5min，使成均匀薄膜；将预热好的0.9 %氯化钠溶液倒入圆底烧瓶中在5 5 °C温度下继续旋蒸30min，得到蓝萼甲素纳米脂质体溶液;将该溶液在冰浴条件下探头超声8min(300w)，通过
0.22μπι聚碳酸酯膜得到蓝萼甲素纳米脂质体。采用马尔文粒径仪检测蓝萼甲素纳米脂质体的粒径分布和电位分布(图1Α，Β)，用超纯水将纳米脂质体按1:10稀释，取Iml置于样品池中进行检测其粒径分布和电位分布。采用透射电镜观察蓝萼甲素纳米脂质体的形态(图2)，其结果与马尔文粒径仪结果相符。
[0202]考察蓝萼甲素纳米脂质体在PBS溶液(pH为5.0和7.4)中的释放行为(图3)。简要步骤如下，分别取Iml蓝萼甲素纳米脂质体置于截留分子量为3-5kDa的透析管中，加入25ml的释放介质，置于37 °C、10rpm的摇床中。于规定时间点各取2ml释放介质，并补充2ml新鲜释放介质。经真空干燥后，用甲醇:水(1:1)重新溶解，进样分析。
[0203]采用薄膜分散法，我们成功制备载蓝萼甲素纳米脂质体并对其进行表征，所得纳米脂质体组分布均勾、粒径在90nm附近、Ze ta电位在-1 ImV附近;且在48h内表现出一定程度的缓释效果。
[0204]实施例21载药纳米脂质体的细胞毒性
[0205]采用cck-8检测方法考察在不同给药剂型、给药时间和给药浓度处理情况下乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的细胞存活率，来评价蓝萼甲素脂质体对乳腺癌细胞suml49PT(购自南京科佰生物有限公司)及乳腺癌干细胞suml49PT-TS的细胞毒性。
[0206]步骤如下，suml49PT和suml49PT-TS消化为单细胞，计数5000/孔接种于96孔板，孵育12h，将培养基弃掉，加入含有不同浓度药物的新鲜培养基，分别孵育24h、48h和72h。弃掉含药培养基，PBS轻洗一次后，每孔加入含10 %DMS0的新鲜培养基，继续孵育2-6h。用酶标仪检测450nm处OD值计算细胞存活率(细胞存活率(% )=(实验组OD值-阴性对照组OD值)/(空白对照组OD值-阴性对照组OD值)X 100% ))。利用拟合曲线计算不同给药时间及给药方式处理后的I c50值。上述IC50值的比较由t检验进行统计分析。
[0207]体外细胞毒性实验显示，空白纳米脂质体对suml49PT和suml49PT-TS细胞均无明显细胞毒性(图4A，B);游离蓝萼甲素及载蓝萼甲素纳米脂质体对对suml49PT和suml49PT-TS细胞均表现出较强的细胞毒性，并随着时间的延长，作用效果增强(图5: A 24h，B 48h，C72h；D 24h，E 48h，F 72h);在不同给药时间情况下，载蓝萼甲素纳米脂质体对suml49PT和suml49PT-TS细胞的杀伤效果均优于游离蓝萼甲素，并具有统计学差异(图6A，B)。
[0208]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1.一种蓝萼甲素纳米脂质体，其特征在于，包含蓝萼甲素药物，药学上可接受的生物学载体和配体，以及有机相和水相介质;所述的载体为卵磷脂和胆固醇，所述的配体为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000;所述的蓝萼甲素纳米脂质体中蓝萼甲素药物为有机相的0.1 %-0.3% w/v，所述的载体与配体的摩尔比为19:1-19:3，所述的载体中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为85:10-1:1。2.根据权利要求1所述的蓝萼甲素纳米脂质体，其特征在于，所述的蓝萼甲素纳米脂质体的平均粒径小于200nm。3.根据权利要求1所述的蓝萼甲素纳米脂质体，其特征在于，所述的有机相为氯仿或甲醇。4.根据权利要求1所述的蓝萼甲素纳米脂质体，其特征在于，所述的水相介质为0.9%w/v的氯化钠溶液，去离子水或pH为7.4的PBS。5.根据权利要求1所述的蓝萼甲素纳米脂质体，其特征在于，所述的蓝萼甲素纳米脂质体载体中的卵磷脂为氢化大豆卵磷脂，大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂其中的一种或两种以上。6.—种如权利要求1所述的蓝萼甲素纳米脂质体的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法，包括以下步骤: A.有机相配制:将载体和配体以及蓝萼甲素药物分散于有机相中； B.水相配制:将水相介质预热； C.然后将有机相超声混匀后放入圆底烧瓶中，通过旋转蒸发使形成均匀薄膜;将水相介质倒入圆底烧瓶中加热进行水化;将水化好的液体进行冰浴超声得到蓝萼甲素纳米脂质体。7.根据权利要求6所述的蓝萼甲素纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中水化温度为50-60 °C，水化时间为30-50min。8.根据权利要求6所述的蓝萼甲素纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中超声的功率为200-400w，超声时间为8-30min。9.一种如权利要求1-5任一所述的蓝萼甲素纳米脂质体在制备治疗乳腺癌药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的蓝萼甲素纳米脂质体靶向乳腺癌细胞或乳腺癌干细胞。
【专利摘要】本发明涉及医药制剂领域，具体是一种载蓝萼甲素纳米脂质体，其制备方法以及在制备治疗乳腺癌药物中的应用。本发明制备的载蓝萼甲素纳米脂质体利用纳米脂质体缓释，靶向等性质可改善蓝萼甲素水溶性差，体内代谢快，给药困难等不足，本发明的蓝萼甲素纳米脂质体在药物的增溶、缓释及靶向等方面均表现出非常好的应用前景。
【IPC分类】A61K31/122, A61P9/10, A61K9/127
【公开号】CN105663044
【申请号】CN201610120541
【发明人】钟延强, 孙笃新, 王强, 迟晴晴, 张翮, 张国庆
【申请人】上海泰申医药科技有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月3日