一种用于胰岛素精控释放的双响应双交联可注射水凝胶的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于胰岛素精控释放的双响应双交 联可注射水凝胶的制备方法，本发明还涉及将该水凝胶作为药物载体的应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病已经成为社会健康问题之一，严重威胁着人类的健康。预计到2030年，全世 界糖尿病患者数量将从2000年的1.71亿上升至3.66亿，成为本世纪最重要的健康问题之 一。目前，糖尿病的主要治疗方法是胰岛素注射。多次注射胰岛素的确可以维持基础的胰岛 素水平，但这种治疗方式给患者带来了很大的负担，包括注射时的痛楚，注射后短时间内的 低血糖效应，饮食的节制以及无止尽的医院之行等。应糖尿病治疗的需要，胰岛素自我调节 给药体系成为近几年的研究热点，其中生物降解高分子体系，尤其是生物降解"智能"水凝 胶，在药物控制释放领域具有十分重要的意义，引起了研究者们极大的关注。血糖浓度是临 床上检测和治疗糖尿病的唯一标准，因此葡萄糖响应性体系在发展胰岛素自我调节给药系 统方面十分有用，为构筑人造胰腺提供了可能，在糖尿病的治疗方面具有十分重要的应用 前景。
[0003] 胰岛素释放需要根据血液环境中葡萄糖浓度的改变，在正确的时间释放出正确的 剂量，对凝胶载体的响应灵敏度和响应速度提出了更高的要求，即能够响应环境葡萄糖浓 度的微小变化从而快速的引起较大物理化学性质、降解、溶液-凝胶转变或形状变化并释放 出药物。葡萄糖响应体系主要有三大类，包括葡萄糖氧化酶(GOx)、凝集素和苯硼酸基体系 [Macromol·Biosci，2009;9(9):864-868;Biomacromolecules，2009;10(6):1337_1345; Biomacromolecules，2009; 10(5): 1212-1216.]。葡萄糖氧化酶和凝集素为蛋白类化合物， 对环境要求比较苛刻，外界环境的变化可能会导致其失活，而苯硼酸及其衍生物在于对其 分子结构的设计，使之具有较低的葡萄糖响应pKa值。目前关于葡萄糖响应性体系的构筑主 要采用三大响应因素中的一个，而将其中两个或两个以上因素结合到一起，构筑葡萄糖响 应性体系的研究还未见报道，且研究主要集中在载药体系的制备及其响应方式上，即如何 保持蛋白等物质的活性和对苯硼酸衍生物分子结构的设计上，而对于如何提高体系响应灵 敏度和响应速度的研究却很少。
[0004] 在前期研究中，我们利用苯甲酰亚胺键构筑了pH/温度双敏感的可注射壳聚糖基 质水凝胶，该水凝胶可用于抗肿瘤药物和胰岛素的长效可控释放，取得了较好的肿瘤治疗 效果，并能使STZ高血糖大鼠的血糖浓度在一周内维持较低水平;苯硼酸改性壳聚糖具有双 亲性，能与多羟基化合物交联形成水凝胶，在生理pH下能够响应环境中葡萄糖浓度变化并 释放出药物，且通过改变高分子的接枝率能够调节其葡萄糖响应性。初步研究表明，将亚胺 键和苯硼酸酯二者结合起来不影响其各自的葡萄糖响应性，这为设计高灵敏、快响应的凝 胶体系提供了基础和新思路，即利用亚胺键和苯硼酸酯两种动态键制备pH/葡萄糖双敏感 可注射水凝胶，同时将葡萄糖氧化酶等生物活性分子通过二硫键等动态键引入到凝胶基质 中，构筑双重葡萄糖响应体系。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中的不足，结合前期工作的基础，本发明的目的之一是提供一种用 于胰岛素精控释放的双响应双交联可注射水凝胶的制备方法，目的之二是提供该水凝胶在 医药领域中的应用。
[0006] 本发明的目的之一通过以下技术方案实现：
[0007] 一种用于胰岛素精控释放的双响应双交联可注射水凝胶的制备，包括以下步骤：
[0008] (1)将壳聚糖（简称CS)与3-羧基苯硼酸（简称PBA)反应，生成苯硼酸改性壳聚糖 (简称CSPBA);
[0009] (2)将步骤（1)中制备的苯硼酸改性壳聚糖（简称CSPBA)与葡萄糖氧化酶（简称 GOx)通过二硫键相连，生成CSPBA-GOx;
[0010] (3)将多聚糖通过氧化反应引入醛基官能团，生成氧化多聚糖；
[0011] (4)将CSPBA-GOx与高分子交联剂反应，通过苯硼酸酯和亚胺键交联形成水凝胶。
[0012] 进一步的，所述步骤(1)中，苯硼酸改性壳聚糖具有以下结构：
[0014] 其中，上述结构式中的R为Η或CH20H;R'为-NHC = 0或 R"为甲 9 基、乙基、丙基、丁基、乙烯基、卤素、羟基、羟甲基、酯基中的一种;n = 9~200;
[0015] 所述步骤⑵中，CSPBA-GOx具有以下结构：
[0017] 其中，上述结构式中的R为Η或CH20H; R '为
基、乙基、丙基、丁基、乙烯基、卤素、羟基、羟甲基、酯基中的一种。
[0018] 进一步的，所述步骤(4)中的高分子交联剂为I/II组合、I/III组合、IIII、V中的一 种或几种，其中，Ι、π、ιπ、ππ、ν具有以下结构式，
[0029] 其中，上述结构式中的R为酯基或酰胺基或醚基，R'为Η或CH20H; n = 9~150，m = 9 ~150，x = 10~500，y = 10~600〇
[0030]进一步的，所述步骤(4)中形成水凝胶的温度为4°C~40°C，形成水凝胶的时间为 1S~lh，形成水凝胶时溶液的pH值为3~10; pH值可用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸二氢 钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、巴比妥纳-盐酸、Tri s-HCl缓冲液、硼 酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化纳缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲 液、盐酸、氢氧化钠中的至少一种进行调节。
[0031] 进一步的，该水凝胶采用了苯硼酸和葡萄糖氧化酶两种葡萄糖响应因素来构筑水 凝胶，同时感应外界环境中的葡萄糖浓度变化，分别引起体系中亚胺键和苯硼酸酯的可逆 反应，使水凝胶的双交联网络结构发生改变并释放出药物，通过双感应元(葡萄糖氧化酶和 苯硼酸基）和双接受元（亚胺和苯硼酸酯）实现其对葡萄糖浓度变化的高灵敏度和快速响 应。
[0032] 本发明利用亚胺键和苯硼酸酯两种动态键制备pH/葡萄糖双敏感可注射水凝胶， 同时将葡萄糖氧化酶等生物活性分子通过二硫键等动态键引入到凝胶基质中，构筑双重葡 萄糖响应体系，利用苯硼酸和葡萄糖氧化酶两种葡萄糖响应因素同时感应外界环境中的葡 萄糖浓度变化，分别引起体系中亚胺键和苯硼酸酯的可逆反应，使水凝胶的双交联网络结 构发生较大改变并释放出药物，通过双感应元(葡萄糖氧化酶和苯硼酸基)和双接受元(亚 胺和苯硼酸酯)实现其对葡萄糖浓度变化的高灵敏度和快速响应。
[0033] 本发明的目的之二通过以下技术方案实现：
[0034] -种用于胰岛素精控释放的双响应双交联可注射水凝胶在生物医学领域中的应 用，将药物溶液和/或细胞分散液加入到CSPBA-GOx溶液中，将制备的水凝胶作为药物或细 胞载体。
[0035]进一步的，将所述的水凝胶可以作为糖尿病药物载体，可用于负载抗糖尿病药物 如胰岛素等，以形成载药水凝胶，并依靠双感应元(葡萄糖氧化酶和苯硼酸基)和双接受元 (亚胺和苯硼酸酯)实现其对葡萄糖浓度变化的高灵敏度和快速响应，可以作为糖尿病治疗 药物(如胰岛素)的自我调节药物释放载体。
[0036] 本发明所述的水凝胶也可以作为细胞载体，可同时负载药物和细胞，形成水凝胶/ 细胞/药物复合体，从组织修复和药物治疗两个层面对糖尿病足病患者进行医治。
[0037] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0038] 1、本发明以具有良好生物相容性、生物降解性和抑菌性的壳聚糖衍生物为基础高 分子，利用亚胺键和苯硼酸酯两种动态键制备pH/葡萄糖双敏感可注射水凝胶，同时将葡萄 糖氧化酶等生物活性分子通过二硫键等动态键引入到凝胶基质中，减少活性物质流失的同 时保持了分子的生物活性。
[0039] 2、本发明采用双重葡萄糖响应因素构筑高灵敏、快响应的凝胶体系，苯硼酸酯是 对葡萄糖浓度的第一重响应，pH敏感的亚胺键和葡萄糖氧化酶是第二重响应，通过双感应 元(葡萄糖氧化酶和苯硼酸基)和双接受元(亚胺和苯硼酸酯)精确控制胰岛素释放动力学， 实现其对葡萄糖浓度变化的高灵敏度和快速响应。
[0040] 3、本发明通过亚胺和苯硼酸酯两种动态键构筑水凝胶，该水凝胶双响应性的同时 动态凝胶还具有自修复性和可注射性，可通过注射的方式植入到病灶部位，避免了手术植 入的痛苦和繁琐，并且有利于填充不规则的损伤部位。
[0041 ] 4、本发明中的水凝胶可以作为药物和细胞载体，用于糖尿病药物，如胰岛素等，并 可同时负载各种治疗所需细胞，形成药物/细胞/水凝胶复合物，以实现药物的协同治疗和 细胞层面的修复治疗。
[0042] 5、本发明的水凝胶其制备方法简单、操作方便。
【具体实施方式】
[0043] 以下结合实施例对本发明进行详细的描述，但不限于实施例所公开的内容。
[0044] 实施例1
[0045]基于苯硼酸/葡萄糖氧化酶改性壳聚糖(CSPBA-GOx)和聚乙烯醇/苯甲酰基聚乙二 醇(PVA/PEGCH0)双响应双交联水凝胶的制备。
[0046] (l)CSPBA 的合成。
[0047] 将177mg 3-羧基苯硼酸、123.3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入250ml圆底烧瓶， 加入60ml甲醇溶解，室温下搅拌20min后，加入166.3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二 亚胺盐酸盐(EDC · HC1)和壳聚糖溶液(0.5g溶于60ml 0.3%HAc)，室温下搅拌24h后，将反 应物转移到截留分子量为12kDa的透析袋中，在去离子水中透析48h，每四小时更换一次水。 将透析后的样品冷冻干燥，得到白色粉末状的产物。改变3-羧基苯硼酸和壳聚糖的摩尔比， 可制备不同苯硼酸接枝率的CSPBA。
[0048] (2)CSPBA_G0x 的合成。
[0049] 称取0.05g CSPBA溶于50ml去离子水中，加入3ml 3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基 琥珀酰亚胺酯（SPDP)的DMF溶液（lmg/ml)，室温下反应4h，然后加入47.5mg葡萄糖氧化酶 (配成3mg/ml水溶液），继续反应24h后，将反应物转移到截留分子量为12kDa的透析袋中，在 去离子水中透析48h，每四小时更换一次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到白色粉末状的 产物。改变SPDP和葡萄糖氧化酶的量，可制备不同酶含量的CSPBA-GOx。
[0050] (3)PEGCH0 的合成。
[0051] 称取6.0g对醛基苯