Wip1抑制剂的医学用图
【专利说明】Wip1抑制剂的医学用途 发明领域
[0001] 本申请大体涉及生物医学领域。具体而言，本申请涉及以蛋白磷酸酶为靶点的生 物医学研究和应用。
[0002] 发明背景
[0003] 野生型P53诱导的磷酸酶l(Wipl，也称为PP2CS或PPM1D)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋 白磷酸酶，属于2CS型蛋白磷酸酶。目前有研究表明，Wipl是一种致癌基因，并可能成为癌症 的治疗靶点。此外，Wipl在造血系统中的作用也逐渐得到关注。除了上述之外，Wipl是否参 与其他疾病的发生和发展还少有报道。
[0004] 发明概述
[0005] 第一方面，本申请提供了野生型p53诱导的磷酸酶1(本文中简称为"Wipl"）抑制剂 在制备用于治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病的药物中的用途。
[0006] 在一些实施方案中，Wipl抑制剂为Wipl的特异性抑制剂。
[0007] 在一些实施方案中，Wipl抑制剂为Wipl表达抑制剂、Wipl活性抑制剂、或同时能抑 制Wip 1的表达和活性的抑制剂。
[0008] 在一些实施方案中，Wipl抑制剂为能作用于Wipl的转录和/或翻译水平从而降低 生成的功能性Wipl的量的抑制剂。
[0009] 在一些实施方案中，Wipl抑制剂包括，但不限于，dsRNA、microRNA、siRNA、shRNA、 反义RNA或核酶。
[0010] 在一些实施方案中，Wipl抑制剂为能抑制Wipl的酶活性的抑制剂。
[0011] 在一些实施方案中，Wipl抑制剂包括，但不限于，Wipl抗体或其抗原结合片段、与 Wipl天然底物竞争性结合Wipl的类似物、小分子化合物。
[0012] 在一些实施方案中，Wipl 抑制剂为 CCT007093(Sigma-Aldrich)。
[0013] 在一些实施方案中，所要治疗的疾病的特征为在疾病进程中Th9细胞发生分化和 发育。
[0014] 在一些实施方案中，所要治疗的疾病为过敏性疾病。
[0015] 在一些实施方案中，所要治疗的疾病包括，但不限于，过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过 敏性皮炎和食物过敏。
[0016] 第二方面，本申请提供了治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病的方法，包 括向有需要的个体给予野生型P53诱导的磷酸酶1 (Wipl)抑制剂。
[0017] 第三方面，本申请提供了包含野生型P53诱导的磷酸酶l(Wipl)抑制剂的药物组合 物，其用于治疗个体中与Th9细胞分化和发育相关的疾病。
[0018] 第二或第三方面的具体技术特征和实施方案可参考上述关于第一方面的描述。
[0019] 序列简要说明
[0020] SEQ ID N0:1-4为鉴定Wipl敲除小鼠的引物序列。
[0021] SEQ ID从):5-6为荧光定量?0?中扩增11^-9所用的正向和反向引物。
[0022] SEQ ID N0:7-8为荧光定量PCR中扩增IFN-γ所用的正向和反向引物。
[0023] SEQ ID N0:9-10为荧光定量PCR中扩增IL-4所用的正向和反向引物。
[0024] SEQ ID NO: 11-12为荧光定量PCR中扩增IL-17A所用的正向和反向引物。
[0025] SEQ ID从):13-14为荧光定量?0?中扩增?(^3所用的正向和反向引物。
[0026] SEQ ID从)：15-16为荧光定量?0?中扩增1'-13(?21所用的正向和反向引物。
[0027] SEQ ID从)：17-18为荧光定量?0?中扩增64了六3所用的正向和反向引物。
[0028] SEQ ID从)：19-20为荧光定量?0?中扩增1?01^所用的正向和反向引物。
[0029] SEQ ID从):21-22为荧光定量?0?中扩增11^-5所用的正向和反向引物。
[0030] SEQ ID从):23-24为荧光定量?0?中扩增几-13所用的正向和反向引物。
[0031] SEQ ID从):25-26为荧光定量?0?中扩增11^-2所用的正向和反向引物。
[0032] SEQ ID从):27-28为荧光定量?0?中扩增几-21所用的正向和反向引物。
[0033] SEQ ID从):29-30为荧光定量?〇?中扩增11^4所用的正向和反向引物。
[0034] SEQ ID从):31-32为荧光定量?0?中扩增8(^6所用的正向和反向引物。
[0035] SEQ ID从):33-34为荧光定量?0?中扩增8六了?所用的正向和反向引物。
[0036] SEQ ID从):35-36为荧光定量?0?中扩增11^5&(：所用的正向和反向引物。
[0037] SEQ ID从):37-38为荧光定量?0?中扩增1(^^1所用的正向和反向引物。
[0038] SEQ ID从):39-40为荧光定量?〇?中扩增即1^所用的正向和反向引物。
[0039]附图简要说明
[0040] 图1显示了野生型(WT)和Wipl敲除(WiplKO)的初始CD4+T细胞的Th细胞亚群的活 化和分化。
[0041 ] (A)用细胞培养板提前包被结合的抗CD3(2μg/ml)和可溶性的抗CD28(2μg/ml)抗 体刺激72h的经过CFSE标记的WT和WiplKO CD4+T细胞中的CFSE稀释，总结了两种细胞的增 殖能力（无显著差异）（右）。用细胞培养板提前包被结合的抗CD3(2μg/ml)和可溶性的抗 CD28(2μg/ml)刺激72h的WT和WiplKO的初始CD4+T细胞的激活相关标志物CD25(B)和CD69 (C)的表面表达，并总结了CD4+CD25+和CD4+CD69+细胞的百分比（右）。〇)在Thl细胞诱导 (Thl-skewing)条件下被刺激72h的WT和WiplKO小鼠的受诱导的Thl细胞中的IFN-ymRNA的 表达。（E)Thl诱导条件下刺激5d的初始CD4+T细胞中的OM+IFN-γ+Τ细胞的百分比。（F)Th2 诱导条件下刺激72h的WT和WiplKO小鼠的受诱导的Th2细胞中的IL-4mRNA的表达。(G)在Th2 诱导条件下培养5d的初始CD4+T细胞中的CD4+IL-4+T细胞的百分比。（Η)在Thl7诱导条件下 72h的WT和WiplKO小鼠的Thl7细胞中的IL-17mRNA的表达。（I)在Thl7诱导条件下培养5d的 初始CD4+T细胞中的CD4+IL-17+T细胞的百分比。⑴在iTreg偏移条件下48h的WT和WiplKO小 鼠的iTreg细胞中的Foxp3mRNA的表达。（K)在iTreg诱导条件下刺激3d后的初始CD4+T细胞 的iTreg特异性转录因子Foxp3的表达。数据显示为平均值土标准差(n = 3)，代表了三个独 立实验中的一个实验。与WT细胞相比，*P〈0.05。
[0042]图2显示了证明Wipl对于体外Th9细胞分化是必要的实验结果。
[0043] (A)在Th9诱导条件下，使用不同剂量的IL-4的培养48h后的WT和WiplKO小鼠的初 始CD4+T细胞中的11^-9、几-4、几-5、11^-131111?祖的表达。（8)如八图，在相同的1119诱导条件下 培养的WT和WiplKO小鼠的初始CD4+T细胞的培养基中的IL-9的水平。（C)用抗-CD3和抗-⑶28仅加培养基或TGF-β加不同浓度的IL-4分化的⑶4+T细胞72h的IL-9的细胞内染色，总 结了CD4+IL-9+细胞的百分比（右）。〇)在Th9诱导条件下培养不同时间（0-3d)的初始WT和 WiplKO CD4+T细胞的IL-9mRNA的表达。（E)在Th9诱导条件下培养72h的CD4+T细胞中的IL-9 和Foxp3的细胞内染色。（F)使用不同浓度的Wipl抑制剂，在Th9诱导条件下培养48h的初始 WT CD4+T细胞的IL-9mRNA的表达。（G)使用Wipl抑制剂(5μΜ)，在Th9诱导条件下分化72h的 ⑶4+T细胞中的IL-9的细胞内染色，示出了总结的IL-9+T细胞的百分比（右）。数据表示为平 均值土标准差(η = 3 )，代表了三次独立实验中的一次实验。与WT细胞或对照相比，#Ρ〈0.01 和***Ρ〈〇·〇〇1。
[0044] 图3显示了证明Wipl通过抑制JNK-c-Jun/c-Fos通路，在Th9细胞分化中调节IL- 9mRNA和蛋白表达的实验结果。
[0045] (A)在Th9诱导条件下不同时间点（0-120分钟）的来自WT和Wi p 1K0小鼠的初始CD4+ CD44-CD62L+细胞中的口-5丁八丁6、5丁八丁6、口-511^(13、511^(13、口138、口38、口-5丁八丁5、5丁八丁5、口-STAT1、STAT1、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun和β-肌动蛋白的免疫印迹分析。（B)在ThO或 Th9 条 件下不刺激或刺激24h的初始WT和WiplKO CD4+T细胞的核蛋白中的Rel-B、p65和H3的免疫 印迹分析。（C)在Th9诱导条件下用（+ )或不用（-)JNK特异性抑制剂（SP600125，Sigma-Aldrich)处理指定时间（0-15分钟）的初始WT和WiplKO CD4+细胞中的p-c-Jun、p-JNK、JNK 和β-肌动蛋白的免疫印迹分析。（D)在Th9诱导条件下用（+ )或不用（-)JNK特异性抑制剂 (SP600125，Sigma-Aldrich)处理48h的初始WT和WiplKO CD4+细胞的IL-9mRNA表达。（E)流 式细胞术检测细胞内的IL-9蛋白表达(左)并总结了 E-9+CD4+细胞的百分比（右）。（F)通过 ELISA检测细胞培养上清液中的IL-9表达水平。（G)在Th9诱导条件下刺激初始CD4+T细胞 24h，然后使用如本方法所述的抗-c-Jun单克隆抗体进行ChIP分析。(H)用有活性的c-Jun和 c-Fos过表达质粒与含有IL-9启动子区的荧光素酶报告基因质粒和海肾荧光素酶载体一起 转染HEK 293T细胞。24h后裂解细胞并进行双荧光素酶的活性检测。数据显示为平均值土标 准差（n = 3)，代表至少两个独立实验中的一个实验。与对照或在指定组之间相比，***P〈 0.001。
[0046]图4显示了证明Wipl缺陷型小鼠能抵抗过敏性哮喘的实验结果。
[0047] (A)在对照和0VA诱导的过敏性哮喘模型(每组η = 4-6)中，WT和Wip 1K0小鼠的血清 中的IgE水平。（B)在最后一次雾化吸入0VA后48h，取WT和WiplKO小鼠的肺组织上进行过碘 酸希夫试剂(PAS)染色。