9个精氨酸残基组成的聚精氨酸;优选聚精氨酸 为8个精氨酸残基组成的聚精氨酸R8。
[0058]表1:
[0063] 上述各种穿膜肽分别具有良好的入胞能力，因而都适用于核酸药物的细胞内递 送。其中，LMWP具有易于制备、成本低廉以及卓越的穿膜能力等更优异的性能，因而，更优选 穿膜肽为LMWP。
[0064] 对于本发明的上述药物，由于具有较高的细胞膜穿透性，且在细胞内核酸药物也 具有很高的生物利用度。而该药物作为药物的一种形式，可适应药物的各种给药途径，包括 但不仅限于静脉注射、皮下注射、黏膜给药或者经皮给药;黏膜给药包括鼻腔黏膜、口腔黏 膜、直肠黏膜和阴道黏膜中的任意一种。
[0065] 根据上述实际给药途径的不同，上述药物还可以制备成各种合适的给药剂型，包 括但不仅限于针剂、喷雾剂、涂抹剂、生物可降解的包埋剂、凝胶剂、膜剂、粉剂、溶液剂、混 悬剂、乳剂、脂质体、透皮贴剂、栓剂、冻干粉针剂、或贴片等。
[0066] 在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种核酸偶联物的制备方法，该制备 方法包括:穿膜肽的活化步骤:将穿膜肽的N端或C端特异性地与柔性聚合物进行共价结合， 得到活化的穿膜肽;核酸药物的活化步骤:在核酸药物反义链的3'端或者正义链的任意一 端引入不同于磷酸基团或羟基基团的反应活性基团，得到活化的核酸药物;共价连接步骤： 活化的穿膜肽与活化的核酸药物通过亲核反应或亲电加成反应得到核酸偶联物。
[0067] 本发明的上述制备方法，通过将现有的穿膜肽与柔性聚合物共价结合形成活化的 穿膜肽，同时也将核酸药物的末端修饰为可以与柔性链段末端共价连接的反应活性基团， 然后通过亲核反应或亲电加成反应使得核酸药物与连接有柔性链段的穿膜肽共价结合为 核酸药物。该制备方法简单且所制备的药物细胞膜穿透性高，且进入细胞内之后核酸药物 的生物利用度高。
[0068] 上述制备方法中，柔性链段作为穿膜肽与核酸药物的间隔，其由柔性聚合物同时 提供两个不同的反应活性基团反应而成。穿膜肽活化时提供一个反应活性基团与穿膜肽的 一端反应，另外一个反应活性基团与活化的核酸药物所提供的活性基团反应，从而形成以 柔性链段为间隔的穿膜肽-柔性聚合物链-核酸药物共价核酸偶联物。柔性聚合物优选聚乙 二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯或者聚丙烯酰胺；优选柔性聚合物的分子量为1000-10000，更优选为 2000-5000。
[0069]上述制备方法中，柔性聚合物是用来在核酸药物与穿膜肽之间形成物理间隔的， 因而，柔性聚合物两端需要分别与核酸药物和穿膜肽的末端进行共价连接反应，且处于核 酸药物穿透细胞膜之后，是需要在细胞质内被释放而发挥生物学功能的，因而，在此目的前 提下，任何能够满足上述目的的反应活性基团都能用于核酸药物与柔性链段之间的共价连 接反应。而对于参与柔性聚合物与穿膜肽的共价连接的反应活性基团，则无特殊要求，只要 能形成共价键且不影响穿膜肽的细胞膜穿透性即可。在本发明一种优选的实施例中，上述 核酸药物活化过程中在核酸药物的一端连接的反应活性基团为氨基、巯基、羧基、马来酰亚 胺基和N-羟基琥珀酰亚胺基中的任意一种。这些反应活性基团容易形成酰胺键、二硫键或 者酯键，能够在被还原或被水解的状态下顺利释放核酸药物。
[0070] 上述制备方法中，核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选寡聚核苷酸为非 取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，非取代 的寡核苷酸选自锁核酸、短干扰RNA、微小RNA、核酸适体、肽核酸、诱骗0DN、催化性RNA以及 CpG二核苷酸中的任意一种;优选寡聚核苷酸为长度为19-23bp的siRNA。更优选地，这些19 ~23bp的siRNA选自SEQIDN0:17至SEQIDN0:172中的任意一种(序列表中列的序列为各 siRNA的反义链)在临床上具有重要意义的siRNA(具体见表1和表2所示）。需要说明的是，表 1和标2所示的SEQIDN0:33至SEQIDN0:172的序列中，SEQIDN0:62、SEQIDN0:64、SEQ ID N0:69至SEQ ID N0:72以及SEQ ID勵：102的序列3'端末尾带有一个悬垂碱基1'(悬垂碱 基是为了促进siRNA与目标RNA链的结合能力而进行的常规设计），而其余的3'端末尾带有 两个悬垂碱基T。
[0071] 同样，上述制备方法中，穿膜肽选自如下任意一种:序列号为SEQ ID N0:1的LMWP、 序列号为SEQ ID N0:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID N0:3的Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID N0:4的CAI、序列号为SEQ ID N0:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID N0:6的MAP、序列号为 SEQ ID N0:7的MPGa、序列号为SEQ ID N0:8的M918、序列号为SEQ ID N0:9的R6Pen、序列号 为SEQIDN0:10的penetratin、序列号为SEQIDN0:ll的P印-1-K、序列号为SEQIDN0:12 的ARF1-22、序列号为SEQ ID NO: 13的TplO、序列号为SEQ ID NO: 14的P0D、3~100个赖氨酸 残基组成的聚赖氨酸以及4~9个精氨酸残基组成的聚精氨酸;优选聚精氨酸为8个精氨酸 残基组成的聚精氨酸R8。
[0072]在本发明又一种典型的实施方式中，提供了一种上述任意一种核酸偶联物在体外 筛选药物中的应用。根据不同药物研究中体外筛选目的的不同，上述核酸偶联物可以作为 阳性对照或阴性对照。
[0073] 下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0074] 由于核苷酸单体与寡居核苷酸都具有电负性，区别就在于核苷酸数目的不同，而 核苷酸数目的多少对于合成具有柔性链段共价连接核酸药物与穿膜肽的药物来说并无影 响，步骤都是相同的。因此，下面以siRNA为例来进一步说明与载体连接的药物的制备方法 及其在药物活性方面的效果。以下实施例中，所用到的试剂或药品，除特殊说明外，均来自 于天津光复精细化工研究所。下列实施例中的LMWP发明人自制的序列如SEQ ID NO: 1所示 的低分子量蛋白。
[0075] 实施例1双链siRNA偶联物LMWP-PEG-siRNA以及单链寡聚核苷酸偶联物LMWP-PEG-Μ0Ε的合成和表征
[0076] 1. LMWP-PEG-siRNA的合成(结构图如图1所示，按照图2所示的流程进行合成）
[0077] 1.1.LMWP-SH 的合成
[0078] 分别将10mg自制的序列为SEQ ID N0:1的穿膜肽LMWP溶于5mL PBS中，95mg的NHS-PEG-Mal(MW = 3500Da，北京键凯科技有限公司）溶于0.5mL无水二甲基亚砜(DMS0)(天津西 恩斯生化科技有限公司）中。再将溶有NHS-PEG-Mal的溶液逐滴加入到溶有LMWP的roS溶液 中。室温下反应2h，过滤反应液，之后用肝素管纯化得到LMWP-PEG-Mal。
[0079] 接着将2mg半胱氨酸（天津西恩斯生化科技有限公司）溶解于0.1M的稀盐酸溶液 中，再向得到的LMWP-PEG-Mal溶液中逐滴加入溶解的半胱氨酸溶液。室温下反应2h，0.45μπι 滤膜过滤，用肝素柱纯化活化的LMWP。然后将5mg SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸Ν-羟基琥珀 酰亚胺酯(Thermo Fisher Scientific)，一种异-双官能试剂，用于交联氨基和疏基)溶于 lml DMS0中，再缓慢地滴加到LMWP溶液中。室温下反应2h，0.45μπι滤膜过滤。用肝素柱纯化 得到LMWP-PEG-Mal-Cys-SPDP溶液。再向上述得到的LMWP-PEG-Mal-Cys-SPDP溶液中加入20 yL 1M的二硫苏糖醇（DTT) (Thermo Fisher Scientific)于室温下反应 15min得到LMWP-PEG-Mal-SH。
[0080] 1.2.核酸药物的活化
[0081] 称量 1 · 25mg 的碳化二亚胺盐酸盐(EDC · HC，Thermo Fisher Scientific)并加入 到一个离心管中，再向离心管中迅速加入l〇〇yL含有5'磷酸基团的溶于0.1M MES(2-(N-吗 啡啉）乙磺酸）（Sigma)缓冲液得到最终溶度为lmg/mL的siRNA(anti eGFP siRNA，反义链 SEQ ID NOilSA'-UGCGCUCCUGGACGUAGCCUlKy，广州锐博生物科技有限公司）以及单链的 M0E(SEQ ID NOiieW-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-S'，上海吉玛制药技术有限公司）溶 液。之后立刻加入5yL的溶于0.1M咪唑配置成的0.25M的胱胺（pH = 6.0，Thermo Fisher Scientific)中。用涡旋振荡器最大转速涡旋5min。再加入20yL 0.1M的咪唑（pH = 6.0)，混 合，室温下最大转速涡旋反应30min。加入20yL 1M的DTT于室温下反应15min。使用脱盐柱过 滤纯化SH-标记的siRNA-SH或者M0E-SH(洗脱液:20mM磷酸二氢钠，10mM EDTA，pH=6.9)。洗 脱液于-80 °C冰箱中贮存备用。
[0082] 1 · 3 · LMWP-PEG-S-S-M0E 以及 LMWP-PEG-S-S-siRNA 的合成
[0083] 将75nM siRNA-SH或者MOE-SH溶于950yL的溶液（配方：lOmM磷酸二氢钠，0.15M氯 化钠 ，pH = 7.2)中。再分别将M0E-SH或者siRNA-SH溶液缓慢滴加到适量肝素柱纯化过的 LMWP-PEG-Mal-SH溶液中，边滴加边振荡，将上述混合物置于40°C空气浴摇床连续摇动反应 2h(转速100rmp/min)。未反应的M0E-SH或者siRNA-SH用阳离子柱除去。核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-s iRNA 和 MOE-S-S-PEG-LMWP 储存在-20 °C 用于进一步分析。
[0084] 2 · LMWP-PEG-S-S-siRNA 以及 LMWP-PEG-S-S-M0E 的表征
[0085] 使用琼脂糖凝胶电泳和MALDI-T0F来评价所得LMWP-PEG-S-S-siRNA的分子量，结 果分别见图3和图4A至图4E。
[0086] 在图3中，泳道1为核酸标准物(Marker)，泳道2为siRNA，泳道3为LMWP-PEG，泳道4 为 LMWP-PEG-S-S-siRNA，泳道 5 为 siRNA 的二聚体，泳道 6 为 LMWP-PEG-S-S-siRNA 用谷胱甘肽 还原后的siRNA。从中可以看出，所得LMWP-PEG-S-S-siRNA的为单一条带，纯化较高。
[0087] 从图4A中可以看出小分子量鱼精蛋白LMWP的分子量为1880Da;图4B显示了MW = 3500的NHS-PEG-Mal的分子量分布；图4C表明了LMWP与PEG共价偶联后形成的LMWP-PEG分子 量分布；图4D显示了Μ0Ε的分子量为6497.48;图4E显示LMWP-PEG-S-S-M0E的分子量分布。由 此表明，琼脂糖凝胶电泳和MALDI-T0F MS均验证，上述共价偶联物合成成功。
[0088] 实施例 2LMWP-PEG-S