116] 第二部分：不同分子量大小的PEG与LMWP形成LMWP-PEG-siRNA偶联物以及LMWP+ PEG+siRNA的物理共混物的影响来评价PEG的分子量对LMWP-PEG-siRNA偶联物的影响。
[0117] 针对分子量依次为1000Da、3500Da、10000Da以及20000Da的PEG分别制备了LMWP-pEG-siRNA偶联物以及LMffP+PEG+siRNA的混合物，来评价PEG的分子量对LMffP-PEG-siRNA偶 联物的影响。
[0118] LMWP与mPEG-NHS(1000Da)、mPEG-NHS(3500Da)、mPEG-NHS(10000Da)、mPEG-NHS (20000Da)在pH = 7.2的缓冲液中室温下反应2h，LMWP上唯一的一个伯氨基与NHS反应生成 l#LMWP-PEG(1000Da)、2#LMWP-PEG(3500Da)、3#LMWP-PEG(10000Da)和4#LMWP-PEG (20000Da)。上述mPEG-NHS中的mPEG表示一端为甲氧基的PEG，m表示封端基团，表示该端没 有活性基团。
[0119]上述得到的LMWP-PEG利用肝素亲和层析柱进行柱分离，分离条件如下：流速 1 · OmL/min，A相：50mM磷酸二氢钠，lOmMEDTA，pH = 7 · 2;B相：50mM磷酸二氢钠，lOmMEDTA，2M 氯化钠，pH=7.2。线性梯度:30min目标物B的浓度从0%增加到100%。
[0120] 结果如图8A所示:LMWP在B的组成>60 %的时候才能被洗脱下来，而1#至4#样品均 在B的组成比例比较低的时候被洗脱，此外随着PEG分子量的增加 LMWP-PEG被洗脱下来时B 的组成越低。从上述结果可以看出LMWP与PEG反应生成LMWP-PEG后，PEG分子的存在会不同 程度地屏蔽LMWP上的正电荷，PEG的分子量越大对LMWP表面的正电荷的屏蔽效应越显著，那 么对应的穿膜肽介导其他分子入胞的能力也越差，因此PEG的分子量不宜过大否则穿膜肽 会损失入胞能力。
[0121] 另外分别将LMWP与siRNA(摩尔比1:1)加入等摩尔的mPEG-NHS(1000Da)、mPEG-NHS (3500Da)、mPEG-NHS(10000Da)、mPEG-NHS(20000Da)在 ρΗ = 7·2 的缓冲液中室温下混合，如 图8Β所示，各组混合物均呈现乳白色，表明带有正电荷的LMWP与带有负电荷的siRNA在电荷 的作用下发生物理聚集而形成的不溶性复合物（1#为siRNA-SH+LMWP-SH，2#为siRNA+LMWP， 3#为siRNA-SH+LMWP+PEG1000,4#为siRNA-SH+LMWP+PEG3500,5#为siRNA-SH+LMWP+ PEG10000，6#为s iRNA-SH+LMWP+PEG20000)。
[0122] 而当 LMWP 分别与 mPEG-NHS(1000Da)、mPEG-NHS(3500Da)、mPEG-NHS(10000Da)、 mPEG-NHS (20000Da)反应生成LMWP-PEG (1 OOODa )、LMWP-PEG (3500Da )、LMWP-PEG (1 OOOODa)、 LMWP-PEG(20000Da)后与siRNA-SH发生反应得到各自的偶联物。具体形态如图8B下排所示 (1#为siRNA-SH+LMWP-SH，7#LMWP-PEG1000-s iRNA，8#LMWP-PEG3500-s iRNA，9#LMWP-PEG 10000-s iRNA，10#为LMWP-PEG20000-SiRNA)。从图 8B中的下排可以看出LMWP-PEG-siRNA 偶联物当PEG分子量>3500Da时，偶联物体系均呈现透明澄清的状态，显示没有不溶性颗粒 的出现。
[0123] 采用粒度仪分别对7#至10#样品进行粒度测量，7#样品的LMWP-PEG1000-siRNA的 平均粒径为14nm，而8#至10#样品的粒径与纯水的粒径相同，即不存在颗粒物。
[0124] 上述两个实验的结果表明，虽然PEG的分子量较小〈lOOODa时，PEG屏蔽LMWP电荷的 能力稍差，但当LMWP与PEG反应形成LMWP-PEG时，均能有效地阻止LMWP与siRNA之间由于电 荷作用而发生的团聚。
[0125] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种核酸偶联物，其特征在于，所述核酸偶联物的分子式为X-Y-B，其中，X为穿膜肽， Y是与所述X共价连接的柔性链段，B是与所述Y共价连接的核酸药物。2. 根据权利要求1所述的核酸偶联物，其特征在于，所述柔性链段是由中性聚合物形成 的线性结构的链段。3. 根据权利要求1或2所述的核酸偶联物，其特征在于，所述柔性链段由聚乙二醇、聚氧 乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺中的任意一种中性聚合物形成。4. 根据权利要求3所述的核酸偶联物，其特征在于，所述中性聚合物的分子量为1000~ 10000，更优选为2000~5000。5. 根据权利要求1所述的核酸偶联物，其特征在于，所述B与所述Y共价连接的共价键包 括^硫键、fe键、醜胺键、醋键或酿键。6. 根据权利要求1所述的核酸偶联物，其特征在于，所述穿膜肽选自如下任意一种:序 列号为SEQIDN0:l的LMWP、序列号为SEQIDN0:2的Tat48-60、序列号为SEQIDN0:3的 Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID N0:4的CAI、序列号为SEQ ID NO:5的HIV-TAT、序列号为 SEQ ID NO:6的MAP、序列号为SEQ ID NO:7的MPGa、序列号为SEQ ID NO:8的M918、序列号为 SEQIDN0:9的R6Pen、序列号为SEQIDN0:10的penetratin、序列号为SEQIDN0:ll的 Pep-1-K、序列号为SEQIDNO:12的ARFl-22、序列号为SEQIDNO:13的TplO、序列号为SEQ ID NO: 14的POD、3~100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4~9个精氨酸残基组成的聚精 氨酸;优选所述聚精氨酸为8个精氨酸组成的聚精氨酸R8。7. 根据权利要求1所述的核酸偶联物，其特征在于，所述核酸药物包括核苷酸单体或寡 聚核苷酸，优选所述寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，所述取代的寡核 苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，所述非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、micr 〇RNA、核 酸适体、肽核酸、诱骗0DN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种;更优选所述寡聚核苷 酸为长度为19~23bp的siRNA。8. 根据权利要求7所述的核酸偶联物，其特征在于，所述长度为19~23bp的siRNA为SEQ ID NO: 17至SEQ ID NO: 172中的任意一种。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的核酸偶联物，其特征在于，所述核酸偶联物的给 药途径为静脉注射、皮下注射、黏膜给药或者经皮给药;所述黏膜给药包括鼻腔黏膜、口腔 黏膜、直肠黏膜和阴道黏膜中的任意一种。10. -种核酸偶联物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括： 穿膜肽的活化步骤，将穿膜肽的N端或C端特异性地与中性聚合物进行共价结合，得到 活化的穿膜肽； 核酸药物的活化步骤，在所述核酸药物反义链的3'端或者正义链的任意一端引入不同 于磷酸基团或羟基基团的反应活性基团，得到活化的核酸药物；以及 共价连接步骤，所述活化的穿膜肽与所述活化的核酸药物通过亲核反应或亲电加成反 应得到所述核酸偶联物。11. 根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述中性聚合物为包括聚乙二醇、 聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺；优选所述中性聚合物的分子量为1000~ 10000，更优选为2000~5000。12. 根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述反应活性基团包括氨基、巯基、 羧基、马来酰亚胺基和N-羟基琥珀酰亚胺基中的任意一种。13. 根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述穿膜肽选自如下任意一种:序 列号为SEQIDN0:l的LMWP、序列号为SEQIDN0:2的Tat48-60、序列号为SEQIDN0:3的 Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID N0:4的CAI、序列号为SEQ ID NO:5的HIV-TAT、序列号为 SEQ ID NO:6的MAP、序列号为SEQ ID NO:7的MPGa、序列号为SEQ ID NO:8的M918、序列号为 SEQIDN0:9的R6Pen、序列号为SEQIDN0:10的penetratin、序列号为SEQIDN0:ll的 Pep-1-K、序列号为SEQIDNO:12的ARFl-22、序列号为SEQIDNO:13的TplO、序列号为SEQ ID NO: 14的P0D、3-100个赖氨酸残基组成的聚赖氨酸以及4~9个精氨酸残基组成的聚精氨 酸;优选所述聚精氨酸为8个精氨酸残基组成的聚精氨酸R8。14. 根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述核酸药物包括核苷酸单体或寡 聚核苷酸，优选所述寡聚核苷酸为非取代的寡核苷酸或取代的寡核苷酸，所述取代的寡核 苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，所述非取代的寡核苷酸选自锁核酸、siRNA、mirc 〇RNA、核 酸适体、肽核酸、诱骗0DN、催化性RNA以及CpG二核苷酸中的任意一种;更优选所述寡聚核苷 酸为长度为19~23bp的siRNA。15. 根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述长度为19-23bp的siRNA为SEQ ID NO: 17至SEQ ID NO: 172中的任意一种。16. -种权利要求1至9中任一项所述的核酸偶联物在体外筛选药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种核酸偶联物、其制备方法及其应用。该核酸偶联物的分子式为X?Y?B，其中，X为穿膜肽，Y是与X共价连接的柔性链段，B是与Y共价连接的核酸药物。该核酸偶联物通过利用柔性链段来连接核酸药物和穿膜肽，由于柔性链段能够在物理空间上间隔核酸药物和穿膜肽，阻止强电负性的核酸药物与呈正电性的穿膜肽之间相互吸引形成发夹结构，从而避免了核酸药物与穿膜肽间因静电作用而发生聚集沉淀的问题，使得核酸药物进入细胞后能够在细胞质或细胞核内发挥其生物活性，提高其生物利用度。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/7088, A61K48/00, A61P31/12, G01N33/53, A61P1/16, A61P31/20, A61K47/48
【公开号】CN105727304
【申请号】CN201610083905
【发明人】杨志民, 贺慧宁, 叶俊晓, 王建新, 黄永焯, 龚俊波
【申请人】天津医科大学
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2016年2月6日