一种新型肝片吸虫多表位疫苗的设计、制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供一种新型肝片吸虫多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白?2 Th和B细胞抗原表位的多拷贝体以及黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基构成。本发明主要通过基因合成技术合成一个人工基因，其包含有鞘脂激活蛋白样蛋白?2的Th和B细胞抗原表位多拷贝体的基因序列，然后将该人工基因与霍乱毒素B亚基的基因序列相偶联，形成一个融合基因。利用大肠杆菌原核表达系统表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得肝片吸虫多表位疫苗。该肝片吸虫多表位疫苗能够诱发机体产生针对鞘脂激活蛋白T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗肝片吸虫感染相关性疾病。
【专利说明】
一种新型肝片吸虫多表位疫苗的设计、制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于畜牧医药领域，具体涉及到一种肝片吸虫多表位疫苗的设计、制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 肝片吸虫(AasciWa Aepaiica)隶属于复殖目（Digenea)片形科(Fasciolidae)的片形 属(Fasciola)，主要寄生于哺乳动物尤其是反刍类动物，其发病范围广、致死率高是制约当 今畜牧业发展的重要传染疾病之一。牛羊的肝脏胆管中如被肝片吸虫寄生，肝组织被破坏 引起肝炎及胆管变硬，同时虫体在胆管内生长发育并产卵，造成胆管的堵塞，影响消化和食 欲;虫体分泌的毒素渗入血液中，溶解红细胞，使家畜发生贫血、消瘦及浮肿等中毒现象;虫 体刺激使胆管壁增生，可造成胆管阻塞、肝实质变性、黄痘等。肝片吸虫是我国危害最重，覆 盖面最广的牲畜寄生虫病之一。每年均有爆发性流行，给我国畜牧业造成巨大的损失。国内 外均有报道肝片吸虫病出现人畜共患，特别是在贫困的农村地区流行。有估计表明在60多 个国家大约有240万人感染肝片吸虫，并且有超过1.8亿人住在肝片吸虫感染区，严重危害 人类健康。
[0003] 研制肝片吸虫疫苗是控制肝片吸虫疾病的一种切实有效的方法。治疗性肝片吸虫 疫苗具有广阔的应用前景，有望代替传统的化学药物疗法，成为预防及治疗肝片吸虫的新 方法。目前治疗肝片吸虫感染主要是化学药物法，大部分使用广谱驱虫药物，其中三氯苯达 唑（TCBZ)是治疗肝片吸虫感染有效的药物，但是有研究表明肝片吸虫已经出现了耐药性， 所以TCBZ不是治疗肝片吸虫的一种长期有效的药物。采用药物法存在诸多弊端：（1)广谱驱 虫药的使用导致肝片吸虫耐药虫体日益增多，药物疗效每况日下。（2)治疗药物在动物体内 是否残留，是否通过食用肉进一步危害人类健康还不得而知。（3)药物治疗难以避免反复治 疗。（4)药物不能达到完全驱虫的效果。因此，传统化学药物治疗不宜在肝片吸虫感染动物 中大规模推广使用，研发肝片吸虫疫苗是一种预防和治疗肝片吸虫感染、更实际和更有前 景的方法。
[0004] 寄生虫疫苗分为弱毒疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、表位疫苗。目前使用的寄生虫 疫苗一般是弱毒疫苗，其保护机制主要是模拟自然感染，刺激机体产生免疫应答主要采取 以下几种途径筛选：（1)通过特殊动物传代或在体外培养使毒力降低，如牛巴贝斯致弱苗就 是通过在切除脾脏牛体内反复传代获得的。（2)筛选缺少某一生活阶段的虫株，如刚地弓形 虫S48株就不能形成包囊。（3)筛选生活周期缩短的虫株，如早熟艾美尔球虫苗。弱毒疫苗应 用不广泛的几个因素是：（1)安全性问题。目前的寄生虫疫苗主要为活苗，虽然可以产生一 定的免疫保护，但毕竟是活的虫体，在特定的情况下，仍有致病的可能。（2)免疫保护效果。 有些寄生虫可以感染多种动物，其疫苗往往对某种动物保护效果较好，对另种动物效果较 差，或者对不同年龄的动物保护效果不一致等缺点。（3)经济效益。尽管有些疫苗免疫保护 性好，但生产成本高、免疫方法复杂、与抗寄生虫药的广谱性相比具有较窄的保护范围均限 制了疫苗在生产中的应用。正是由于上述问题的存在，在一定程度上制约了寄生虫疫苗的 使用，同时，促使人们去研究和开发新的疫苗。
[0005] DNA疫苗是近几年发展起来的一种新型疫苗。因其操作简便，既具有重组亚单位 疫苗的安全性，又具有减毒活疫苗高效、持续诱导全方位免疫应答的优点，该疫苗问世以 来，引起了全世界的研究热潮。DNA疫苗研究已展开了积极的探索。在日本分体吸虫、绦虫、 疟原虫、利什曼原虫、隐孢子虫、弓形虫、锥虫、球虫等疾病中，DNA疫苗研究中取得了较好的 结果，其中疟疾DNA疫苗已获准生产。
[0006] 表位疫苗基于抗原表位而制备，具有独特的疫苗设计思路，是研制预防和治疗感 染性疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。表位疫苗与全菌疫苗、基因工程亚 单位疫苗和DNA疫苗相比，具有以下优点：（1)表位疫苗一般稳定、无毒，具有更高的安全性。 (2)抗原表位肽的分子结构小而简单，不会引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。（3)表位疫 苗可对抗原表位进行精确定位，具有更高的免疫针对性和特异性。（4)表位疫苗具有十分灵 活的设计性，可组合不同Th、B细胞抗原表位，制成针对多种病原体的疫苗。（5)表位疫苗选 用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原体快速基因突变所形成的免疫逃避机制。
[0007] 目前，研究人员已经对肝片吸虫抗原蛋白进行了大量研究，并获得了多个肝片吸 虫抗原蛋白，如脂肪酸结合蛋白（FABP)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、组织蛋白酶(CatL)类蛋 白酶和血红蛋白（Hb)均能诱导宿主产生部分保护作用，可作为抗原用于反刍动物中，但是 其效果都不是很理想。鞘脂激活蛋白样蛋白（SAP)是一大类蛋白家族，广泛存在于从原生动 物直至哺乳动物的生物体内，并发挥着各种生物学作用。有实验表明，SAPs参与裂解宿主细 胞用于进一步酶处理为寄生虫提供营养。近年来发现该家族中SAP-2具有很强的细胞溶解 酶活性，结构类似于NK细胞溶解酶，杀伤动物红细胞和外周单核细胞。最近发现FhSAP-2是 一个很好的抗原，它会刺激特定的细胞和体液免疫反应。小鼠接种FhSAP-2 DNA疫苗产生 Thl/Th2混合反应，因此认为FhSAP-2含有T细胞抗原，其中一些可能引起免疫保护反应。
[0008] 目前治疗肝片吸虫病的方法，主要采用广谱驱虫法，存在诸多弊端:如药物在动物 体内残留、肝片吸虫耐药虫体增多等。因此，研制肝片吸虫疫苗是控制肝片吸虫感染的一种 切实有效的方法。FhSAP-2是公认的疫苗的理想抗原;FhSAP-2具有很强的细胞溶解酶活性， 在其寄生过程中起重要作用；在肝片吸虫疫苗免疫保护性机制中，抗体体液免疫应答起重 要作用，而Th细胞免疫应答起关键作用。本发明合理选择FhSAP-2的Th和B细胞抗原表位，激 发有效抑制FhSAP-2的活性和激发特异性细胞免疫应答，为研制针对FhSAP-2的新型治疗性 多表位疫苗奠定实验基础。
【发明内容】
[0009] 本发明的第一个方面是提供了一种新型肝片吸虫多表位疫苗 本发明的第二个方面是提供了该肝片吸虫多表位疫苗的制备方法。
[0010] 本发明的第三个方面是公布了该肝片吸虫多表位疫苗的用途。
[0011] 本发明的第一个方面是提供了一种肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE。该肝片吸虫多 表位疫苗主要由来自鞘脂激活蛋白样蛋白FhSAP-2的B细胞表位（分别是FhSAP 21-30， FhSAP76-85)和T细胞抗原表位(分别是FhSAP7i-8〇，FhSAP81-9〇)和霍乱毒素 B亚基构成，具有以 下优点：（1)肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE含有来自鞘脂激活蛋白样蛋白FhSAP-2的B细胞 表位和T细胞抗原表位，能够激发针对FhSAP-2表位特异性抗体。（2)本发明的肝片吸虫多表 位疫苗CTB-SAPE可激发有效抑制FhSAP-2活性的表位特异性抗体。（3)选择"FhSAP-2的B细 胞表位和T细胞抗原表位"来代替FhSAP-2大分子抗原研制表位疫苗，可有效避免FhSAP-2的 生物学毒性和一些免疫交叉性病理性伤害。
[0012] 本发明的第二个方面是提供了肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的制备方法，其技术 路线简述如下： (1)肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE抗原分子的结构设计 通过生物信息学软件对霍乱毒素 B亚基(CTB)和肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白FhSAP-2 的B细胞表位和T细胞抗原表位的连接顺序和间隔序列，加以分析和确定，设计一个具有科 学合理结构的肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE。
[0013] (2 )重组表达质粒pETCTB-SAPE (含有融合基因 CTB-SAPE )的构建 通过基因合成技术合成一个SAPE的核苷酸序列，将其插入含有霍乱毒素 B亚基(CTB)基 因的重组表达载体pETC中，构建重组表达载体pETCTB-SAPE。
[0014] (3)融合蛋白CTB- SAPE的原核表达及纯化 将重组表达载体CTB-SAPE转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株BL21 (DE3)/pETCTB-SAPE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTP镍离子亲和层析能够获得电泳纯度 的融合蛋白CTB-SAPE，即为肝片吸虫多表位疫苗。
[0015]本发明的第三个方面是提供了肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的用途。肝片吸虫多 表位疫苗CTB-SAPE可用于预防和治疗肝片吸虫感染相关性疾病。
【附图说明】
[0016] 图1:新型肝片吸虫多表位疫苗的分子结构设计特点。
[0017] 图2:重组表达载体pETCTB-SAPE的双酶切鉴定。
[0018] 泳道 1:DNA Marker 2000bp;泳道2:DNA Marker lkd;泳道3:pETCTB- SAPE /Κρη I /Xho I;泳道4:pETCTB- SAPE /Nco I /Xho I 图3:重组表达载体pETCTB- SAPE质粒图谱。
[0019] Nco I和Xho I之间为插入的融合基因 CTB-SAPE 图4:肝片吸虫多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的原核表达。
[0020] 泳道1:蛋白质Marker;泳道2: CTB-SAPE包涵体蛋白；泳道3: CTB-SAPE可溶蛋白。 [0021 ]图5:肝片吸虫多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的Ni-NTA亲和层析纯化。
[0022] 泳道1:蛋白质Marker;泳道2: CTB-SAPE包涵体蛋白；泳道3:纯化后的CTB-SAPE蛋 白样品。
[0023]图6:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE诱发抗鞘脂激活蛋白样蛋白2(FhSAP-2)IgG抗 体的检测。
[0024]肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE都能诱发产生一定滴度抗鞘脂激活蛋白样蛋白2 (FhSAP-2)抗体。
[0025] 图7:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE诱发抗肝片吸虫总蛋白IgG抗体的检测。
[0026] 肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE都能诱发产生一定滴度抗肝片吸虫总蛋白的抗体。 [0027]图8:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE诱发FhSAP-2 21-3Q表位特异性抗体的检测。
[0028] 肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE能够产生较高滴度的FhSAP-221-3Q表位特异性抗体。 [0029]图9:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE诱发FhSAP-276-85表位特异性抗体的检测。 [0030] 肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE能够产生较高滴度的FhSAP-276-85表位特异性抗体。 [0031]图10:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE致敏小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反 应。
[0032]图11:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE与神经节苷脂GM1的结合活性检测。
【具体实施方式】 [0033] 材料 1. IPTG溶液:称取1.2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml无菌水，充分混匀溶解后， 定容至50ml。用0.22μπι滤器过滤除菌，小份分装，-20°C保存。
[0034] 2.卡那青霉素(Kana)|C液（100 mg/mL):称取100mg卡那青霉素(Kana)溶于lmL无 菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μπι细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20 °(：冰箱中。
[0035] 3.培养基：（1)LB液体培养基:称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸 馏水至l〇〇〇ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。（2)LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB培养 液，高压灭菌后，倾倒平板。
[0036] 4. DNA电泳缓冲液（50 X TAE):称取242g Tris、37.2g Na2EDTA · 2H20和57.1ml 冰乙酸，加水至1 〇〇〇ml，使用时稀释50倍。
[0037] 5. SDS-PAGE电泳缓冲液(5X):称取Tris粉末 15.1g、甘氨酸 94g、SDS 5.0g;加入 约800ml的去离子水，搅拌溶解;加去离子水定容至1L，室温保存;注意：加水时应让水延着 壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。
[0038] 6.考马斯亮蓝蛋白染色试剂：（1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用）:考马斯 亮蓝G-250 100mg溶解在50ml 95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸馏水稀释至 1000ml。（2)脱色液:250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。
[0039] 8.实验动物：BALB/c小鼠：为SPF级，雄性，8~10周龄，购自北京维通利华实验 动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2012-0001。
[0040] 9. ELISA试剂：（1)包被液：1.6g Na2C03,2.9g NaHC03,0.2g NaN3,加双蒸水至 1L， 调pH值至9.6。（2)洗涤液：分别称取0.2g KH2P〇4,2.9g Na2HP〇4.12H20,8.0g NaCl，0.2g KC1，0.5ml Tween-20,加入ddH20定容至 1000 ml(PBST)。（3)封闭液:称取3.0g BSA溶解于 l〇〇ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4°C保存。（4)底物液:可溶性单组份TMB底物溶液。（5)终 止液:量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml (1M H2S〇4)。
[0041 ] 10.淋巴细胞增殖实验主要试剂（1)小鼠脾脏淋巴细胞分离液(达科为生物技术 有限公司）（2)RPMI-1640完全培养液:在RPMI-1640基础培养液加入10%胎牛血清、100U/ml 青霉素、100μg/ml链霉素。（3)RPMI-1640不完全培养液:称取10.4g RPMI-1640干粉、2.4g HEPES、0.75gNaHC03，加去离子水至1000ml，pH7.4，超滤除菌，分装。
[0042] 实例1:肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的分子结构设计 根据"机体对肝片吸虫的免疫保护性机制"和"鞘脂激活蛋白样蛋白抗原表位的免疫学 性质"，选择鞘脂激活蛋白样蛋白Th和B细胞表位FhSAP21-3Q、FhSAP76-85、FhSAP7i-8〇和 FhSAP81-9Q用于新型肝片吸虫多表位疫苗的构建。在新型肝片吸虫多表位疫苗的设计中，本 课题组将Th细胞表位放在B细胞表位的前端，有助于B细胞表位的有效递呈，再经过生物信 息学DNAstar和RANKPEP软件的分析和评价，抗原表位顺序确定为?1^4?71-8()-?1134? 81-90-FhSAP21-30- FhSAP81-9〇;选择KK作为相邻Th抗原表位的间隔序列，选择GS作为相邻財允原表 位的间隔序列；将尿素酶抗原表位FhSAP 21-3Q、FhSAP76-85、FhSAP7i-so和FhSAP81-9〇分别拷贝两 次;选择霍乱毒素 B亚基(CTB)作为分子内免疫佐剂，融合在FhSAP多表位肽(SAPE)的N端，增 强FhSAP多表位肽(SAPE)的免疫原性。
[0043]结果:肝片吸虫多表位疫苗CTB- SAPE的分子结构设计特点和思路如（图1)所示。 [0044] 实例2:重组表达载体pETCTB- SAPE(含有融合基因 CTB- SAPE)的构建 (1)多表位肽SAPE核苷酸序列的基因合成 将前期设计的多表位肽SAPE的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相 应的核苷酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司进行基因合成。
[0045] (2 )多表位肽SAPE基因与pETC表达载体的连接 通过质粒小量提取试剂盒(天根)提取重组质粒pUCSAPE和pETCTB(郭乐博士惠赠），用 Kpn I/Xho I分别进行双酶切，双酶切反应体系如下：
37°C酶切反应2 h，然后用1%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。分别利用琼脂糖凝胶 DNA回收纯化试剂盒回收多表位肽SAPE基因和pETCTB表达载体双酶切产物。将回收的 pETCTB线性化载体和SAPE基因通过互补的粘性末端，在T4 DNA连接酶的作用下(4 °C过夜） 连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组表达质粒PETCTB-SAPEJ4 DNA连接酶连接体系如 下：
结果:利用Nco I/Xho I双酶切待检重组质粒pETCTB-SAPE，37°C反应2h，用1%的琼脂 糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段为620bp，与融合基因 CTB-SAPE的理论大小一致，如 (图2)所示。再将pETCTB-SAPE送交南京金斯瑞生物科技公司，采用T7启动子和终止子通用 引物进行基因测序，证明PETCTB-SAPE中融合基因 CTB-SAPE的核苷酸序列完全正确，且无移 码突变。重组表达载体pETCTB-SAPE的质粒图谱如（图3 )所示。
[0046]实例3:多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的原核表达 将验证正确的重组表达质粒pETCTB-SAPE转化进E.coli BL21(DE3)菌株中。在预先制 备好的含50yg/mL Kana的LB平板上，接种环划线基因工程菌株pETCTB-SAPE/BL21(DE3)，倒 置于37°C培养箱，过夜培养12~16h后，挑取单个菌落，接种于含SOyg/mL Amp的LB培养基 中，37°C，180rpm，培养12~16h。以2%接种量分别接种重组菌于含SOyg/mL Kana LB培养基 中，37°C，180rpm振荡过夜，次日晨再将该菌液以1%接种量接种于含SOyg/mL Kana的LB液体 培养基中，37°C，180rpm摇瓶3h后，加入IPTG使终浓度达到lmmol/L，37°C，180rpm诱导表达， 以空载体菌pET28a/BL21 (DE3)作为阴性对照。
[0047] 结果：将基因工程重组菌株pETCTB-SAPE/BL21 (DE3)在PH值为7、IPTG浓度为 lmmol/L、诱导温度37°C、诱导时间为6h的情况下进行诱导表达。与对照菌株对比，基因工程 重组菌株PETCTB-SAPE/BL21 (DE3)在约26KD处出现目的蛋白条带，与肝片吸虫多表位肽融 合蛋白CTB-SAPE的理论大小相符合（图4)。多表位肽融合蛋白CTB-SAPE在包涵体蛋白中存 在。
[0048]实例4:多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的纯化 Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化 将Ni-NTA填料充分混匀后加入层析柱中，溶液可通过重力作用缓慢流出，待完全加入 后，将上层筛板平放入柱中；向装填好的柱中加入适量的去离子水将乙醇冲洗干净后，加入 8倍柱体积的Binding buffer平衡，平衡结束后即可上样;收集菌体后，每100mg菌体加入1-5ml Binding Buffer，超声裂解菌体；12000rpm离心，弃上清；将沉淀重悬于含8M尿素的 Binding Buffer中，冰浴lh，使包涵体溶解;将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小 时；使用15倍柱体积的Wash buff er冲洗柱子，收集流穿峰；使用5倍柱体积的Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰；依次使用3倍柱体积的Binding Buffer和5倍柱体积的去离子 水洗涤后，用3倍柱体积的20%乙醇平衡，4 °C保存。
[0049]结果:经Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分 析，可以发现目的蛋白集中在250mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在 250mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度可达电泳纯（图5)。
[0050] 实施例5:多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特异性研究 (l)BALB/c小鼠的免疫 实验分组:将SPF级BALB/c小鼠随机分为3组，分别为新型多表位融合蛋白CTB-SAPE免 疫组、重组霍乱毒素 B亚基(rCTB)免疫组和PBS免疫组。每组6只BALB/c小鼠，共18只，详细分 组如下图所示：
免疫方式：用75%酒精对小鼠腹部消毒，然后腹部多点皮下注射表位融合蛋白CTB-SAPE和弗氏完全佐剂的混合乳化剂;每隔一周加强免疫一次，第2、3周加弗氏不完全佐剂， 第4周直接注射表位融合蛋白溶液加强免疫。
[0051 ]抗血清的采集:在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完 全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，一 80°C冻存备用。
[0052] (2 )抗血清中特异性抗体的ELI SA检测 将抗原(FhSAP-2、肝片吸虫总蛋白、FhSAP-221-3Q和FhSAP-276-85)用包被液稀释成5yg/ ml或者10μg/ml，100yl/孔包被ELISA板，4°C过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μ1封闭 液，37 °C封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清（鼠抗CTB-SAPE抗血清和鼠抗rCTB抗血清）和 小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μΙ/孔，在37°C下孵育60min。用洗涤液洗4次后， 加入HRP标记的羊抗鼠46(1:10000)，10(^1/孔，在37°(：下孵育111。用洗涤液洗4次后，加入 TMB底物显色液，室温避光反应15min，加50μ1终止液终止反应。用酶标仪测定各孔0D45Q值。 [0053] 结果:FhSAP-2的包被浓度为10μg/ml，通过ELISA检测，肝片吸虫多表位疫苗CTB- SAPE能够产生针对FhSAP-2的特异性IgG抗体，而PBS免疫组不能产生抗FhSAP-2抗体（图6); 肝片吸虫总蛋白的包被浓度为l〇μg/ml，通过ELISA检测，多表位疫苗CTB-SAPE能够产生抗 肝片吸虫总蛋白的抗体，而PBS免疫组不能产生抗肝片吸虫总蛋白的特异性抗体（图7); FhSAP-2抗原表位FhSAP-221-3〇和FhSAP-276-85的包被浓度为10μg/ml，通过ELISA检测，多表 位疫苗CTB-SAPE能够产生较高水平的FhSAP-2 21-3〇和FhSAP-276-85特异性抗体，PBS免疫组 不能产生针对FhSAP-2表位特异性的抗体（图8和图9)。上述结果说明新型肝片吸虫多表位 疫苗CTB-SAPE能够刺激机体产生针对FhSAP-2的高滴度表位特异性抗体，具有很好的免疫 原性。
[0054] (3)小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验 将经抗原免疫的小鼠脱白处死，泡75%酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开 小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏(暗红色）。在小平皿中放入2~ 3ml Lympholyte ?-M淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨 小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离 液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约lml的1640培养基；1000g~1500g离心20min。 离心结束后淋巴细胞会在1640培养基下层悬浮。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基制备 成一定浓度的细胞悬液(5 X 104/ml)。在96孔平底培养板中，每孔加入50μ1细胞，同时加入 CTB-SAPE和FhSAP-2各40μg/ml、FhSAP-2 Th细胞抗原表位肽（FhSAP-27i-so和FhSAP-2si-9〇) 和生理盐水各50μ1，终体积为100μΙ/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置 37°C 5% C02培养箱中培养60h后，向各孔中加入MTS溶液20μ1，继续培养4h后用酶标仪读取 0D49Q值。刺激指数(SI)多2时，判断为阳性;刺激指数计算公式如下：
结果：多表位疫苗CTB-SAPE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经FhSAP-2及CTB-SAPE刺激均 能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激 时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE中FhSAP-2的Th抗原表 位(FhSAP-27i-8Q、FhSAP-2 81-9Q)均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生针对各自Th抗原 表位的细胞免疫应答(图10)。
[0055] 实例5:GM1-ELISA检测多表位疫苗CTB-SAPE中CTB组分的分子免疫佐剂活性 将神经节苷脂GM1或者牛血清白蛋白（BSA)用包被液稀释至10μg/ml，100μΙ/孔，包被 ELISA板，4 °C过夜。用TOST洗涤4次;每孔加入300μ1封闭液，37 °C封闭2h;用洗涤液PBST洗4 次后，4°C保存。将多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和重组霍乱毒素 B亚基(rCTB)按照一定比例 稀释（100μg/ml到Ο · 78μg/ml)，加入100μΙ/孔，37°C放置60min。用洗涤液PBST洗4次，加入鼠 抗CTB多克隆抗体（1:1000)，100μΙ/孔，37°C温育60min。洗涤4次；加入HRP标记羊抗鼠 IgG (1:10000)，100μΙ/孔，37°C放置30min。洗涤4次后，加入TMB底物显色液，37°C孵育lOmin，50 μL终止液终止反应。用酶标仪检测各孔OD45Q值。
[0056] 结果:通过GM1-ELISA检测多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB是否具有形成五聚 体和神经节苷脂GM1结合的活性。多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB的0D45Q都显著高于阴 性对照组(包被BSA)，证明多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB均具有形成五聚体和神经节 苷脂GM1结合的活性，也说明新型多表位疫苗CTB-SAPE中CTB组分具有较好的分子免疫佐剂 活性(图11)。
【主权项】
1. 一种新型肝片吸虫多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素 B亚基 (CTB)和鞘脂激活蛋白样蛋白-2多表位肽SAPE构成，其氨基酸序列如序列1所示。2. 如权利要求1所述，一种新型肝片吸虫多表位疫苗，其核苷酸序列如序列2所示。3. 如权利要求1所述，鞘脂激活蛋白样蛋白_2多表位肽SAPE主要由鞘脂激活蛋白样蛋 白-2的Th和B细胞抗原表位的多拷贝体构成，其氨基酸序列如序列3所示。4. 如权利要求3所述，鞘脂激活蛋白样蛋白-2多表位肽SAPE的核苷酸序列如序列4所 不。5. 包含权利要求2和4中所述的核苷酸序列的表达载体，转基因细胞系及宿主菌。6. 如权利要求1所述，霍乱毒素 B亚基（CTB)和鞘脂激活蛋白样蛋白-2多表位肽SAPE之 间的间隔序列为DPRVPSS。7. -种新型肝片吸虫多表位疫苗的制备方法，通过基因合成技术合成鞘脂激活蛋白样 蛋白-2多表位肽SAPE的核苷酸序列，将其融合在霍乱毒素 B亚基(CTB)基因的下游，构建含 有融合基因 CTB-SAPE的重组表达载体pETCTB-SAPE及其重组基因工程菌，重组基因工程菌 株发酵后，经Ni-NTA镍离子交换层析，获得该疫苗的融合蛋白CTB-SAPE。8. 按照权利要求1和7所述的肝片吸虫多表位疫苗，其特征在于能够激发机体产生针对 肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白-2 T细胞免疫应答和有效抑制肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋 白-2活性的高滴度表位特异性抗体。9. 按照权利要求1和8所述的肝片吸虫多表位疫苗，其特征是可以用作预防和治疗肝片 吸虫感染的药物组合。
【文档编号】C12R1/19GK105903007SQ201610421480
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】陈刚, 汤锋, 李润乐, 康明, 周虎, 冯琳
【申请人】青海大学