一种制备流感疫苗的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备流感疫苗的方法，包括以下步骤：种毒的制备、Vero细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养、制苗病毒液的繁殖、病毒液的灭活及纯化。本发明用细胞系代替鸡胚组织培养制造禽流感病毒可解决鸡胚自身及受外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性；本发明应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定；本发明可以大量降低生产成本，不会受制于原料供应，而且生产周期短；应用本方法生产疫苗，环境污染少且易于处理；而现有的鸡胚生产法会产生的大量废胚等废物，且处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。
【专利说明】_种制备流感疫苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及流感病毒疫苗领域，具体地，涉及一种制备流感疫苗的方法。
【背景技术】
[0002]传统的制备流感病毒疫苗的方法是使用鸡胚制备的，国内使用鸡胚培养疫苗已经有50多年的历史。目前使用的流感疫苗主要是鸡胚制备的灭活的流感三价裂解疫苗，包括甲型流感病毒株、H3N2和乙型流感病毒株以及大流感疫苗。病苗株的主要来源是由WHO根据每年全球流感病毒的变化规律推荐的用于下一年度流感疫苗生产用流感病毒流行株的表面抗原来决定的，将WHO推荐的流行野毒株与鸡胚高产株双重感染产生重配或反遗传学重配，得到新的疫苗株，在鸡胚上具有高产的特性，但鸡胚存在有潜在污染的可能，以及潜在的鸡胚蛋白引起的变态反应，而且培养周期过长，不易于控制产量。不利于用于应对大规模的流感爆发；该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；鸡胚不同批次间的差异大；难以扩大生产；鸡胚自身被细菌或其它病毒污染而致生产的疫苗存在质量及安全隐患；生产疫苗后的废胚数量多，无害化处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种制备流感疫苗的方法，以克服现有流感病毒疫苗的制备方法生产周期过长、所制备的疫苗存在安全隐患的问题。
[0004]本发明解决上述问题所采用的技术方案是:一种制备流感疫苗的方法，包括以下步骤:
1)种毒的制备
a)细胞的传代与培养:将Vero细胞经胰酶细胞分散液消化传代，在无血清培养液的培养基上继续培养Vero细胞使之形成单层细胞；
b)种毒的接种、繁殖:用细胞维持液，将来源WHO提供的Hl或H3或B型流行毒株，稀释10_4倍后接种在生长良好的上述单层细胞，同时加入l_3ug/L的Type IX胰酶，继续培养，至细胞50-100%以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代6代作为生产种子；
2)Vero细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取生长良好的Vero细胞，经胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种在生物反应器中；
3)制苗病毒液的繁殖:当生物反应器中的微载体上的Vero细胞基本长满，且细胞计数结果达I X 106/ml以上后将上述种毒接种在Vero细胞上，种毒接种后培养液中加入l_3ug/L的Type IX胰酶，种毒接毒量为0.0001-0.1MOI，每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测上清液的HA效价和TCID50，待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液即为病毒液，所述为载体使用前需清洗、灭菌； 4)病毒液的灭活及纯化:上述的病毒液灭活后进行浓缩，所得超滤液用KII连续离心机进行蔗糖密度梯度离心，得到超离液，对超离液进行超滤透析去除蔗糖后进行分子筛凝胶层析，获得的病毒液通过超滤透析再度离心去除蛋白，收集上清液，然后过滤除菌、细胞碎片后，即得纯化的病毒液。
[0005]进一步地，微载体为plastic plus微载体。选用plastic plus微载体作为细胞生长的载体，该载体不含动物源的蛋白满足生物安全的要求。
[0006]进一步地，膜酶为Thermo scientific HyQTase -膜酶。Thermo scientificHyQTase -胰酶为植物来源的胰酶，避免了动物源性蛋白。
[0007]一种流感病毒疫苗，所述流感病毒疫苗由一种制备流感疫苗的方法制备而成。
[0008]—种流感病毒疫苗的应用，将流感病毒疫苗应用到流感预防。
[0009]综上，本发明的有益效果是:
1、本发明用细胞系代替鸡胚组织培养制造禽流感病毒可解决鸡胚自身及受外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。
[0010]2、本发明可以大量降低生产成本，不会受制于原料供应，而且生产周期短，每个生产周期仅需5-7天，相比现有鸡胚培养法的15天以上大大缩短。
[0011]3、本发明应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定，易操作、产量大占用场地小，易于快速扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
[0012]4、应用本方法生产疫苗，环境污染少且易于处理。而现有的鸡胚生产法会产生的大量废胚等废物，且处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是细胞法制备流感疫苗的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例及附图，对发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0015]实施例:
如图1所示，一种制备流感疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)种毒的制备
a)细胞的传代与培养:将Vero细胞经Thermoscientific HyQTase -胰酶细胞分散液消化传代，以HycloneSFM4MegaVir或相当的无血清培养液细胞生长液继续培养形成单层细胞；
b)种毒的接种、繁殖:用细胞维持液，将来源WHO提供的当年流行Hl，H3及B型流行毒株，稀释10_4接种在生长良好的上述单层细胞，同时加入3ug/L的Type IX胰酶，继续培养，至细胞50-100%以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代6代作为生产种子；
2)Vero细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取生长良好的Vero细胞，经Thermoscientific HyQTase -胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种反应器中； 3)制苗病毒液的繁殖:生物反应器中的微载体上的Vero细胞基本长满，且细胞计数结果达I X 106/ml以上后将上述种毒接种在Vero细胞上，种毒接种后培养液中加入3ug/L的Type IX胰酶，种毒接毒量为0.0001-0.1M0I，每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测上清液的HA效价和TCID50，待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液即为病毒液，所述为载体使用前需清洗、灭菌；
4)病毒液的灭活及纯化:上述的病毒液灭活后进行浓缩，所得超滤液用KII连续离心机进行蔗糖密度梯度离心，得到超离液，对超离液进行超滤透析去除蔗糖后进行分子筛凝胶层析，获得的病毒液通过超滤透析再度离心去除蛋白，收集上清液，然后过滤除菌后，即得纯化的病毒液。
[0016]所述微载体为plastic plus微载体。
[0017]如上所述，可较好的实现本发明。
【权利要求】
1.一种制备流感疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)种毒的制备 a)细胞的传代与培养:将Vero细胞经胰酶细胞分散液消化传代，在无血清培养液的培养基上继续培养Vero细胞使之形成单层细胞； b)种毒的接种、繁殖:用细胞维持液，将来源WHO提供的H1或H3或B型流行毒株，稀释10_4倍后接种在生长良好的上述单层细胞，同时加入l_3ug/L的Type IX胰酶，继续培养，至细胞50-100%以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代6代作为生产种子； 2)Vero细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取生长良好的Vero细胞，经胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种在生物反应器中； 3)制苗病毒液的繁殖:当生物反应器中的微载体上的Vero细胞基本长满，且细胞计数结果达1 X 106/ml以上后将上述种毒接种在Vero细胞上，种毒接种后培养液中加入l_3ug/L的Type IX胰酶，种毒接毒量为0.0001-0.1M0I，每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测上清液的HA效价和TCID50，待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液即为病毒液，所述为载体使用前需清洗、灭菌； 4)病毒液的灭活及纯化:上述的病毒液灭活后进行浓缩，所得超滤液用KII连续离心机进行蔗糖密度梯度离心，得到超离液，对超离液进行超滤透析去除蔗糖后进行分子筛凝胶层析，获得的病毒液通过超滤透析再度离心去除蛋白，收集上清液，然后过滤除菌后，即得纯化的病毒液。
2.根据权利要求1所述的一种制备流感疫苗的方法，其特征在于，所述微载体为plastic plus 微载体。
3.根据权利要求1或2所述的一种制备流感疫苗的方法，其特征在于，所述胰酶为Thermo scientific HyQTase -膜酶。
4.一种流感病毒疫苗，其特征在于，所述流感病毒疫苗由权利要求1所述的一种制备流感疫苗的方法制备而成。
5.一种流感病毒疫苗的应用，其特征在于，如权利要求2所述的流感病毒疫苗应用到流感预防。
【文档编号】C12R1/93GK104436185SQ201410685181
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】高鹏, 符晓阳, 左红, 代荣涛 申请人:成都威尔诺生物科技有限公司