一种用于治疗脑缺血的药物组合物及其制备方法

一种用于治疗脑缺血的药物组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗脑缺血的药物组合物及其制备方法，所述药物组合物包括如下重量份配比的原料组成：丹参、红花提取物磷脂复合物30～50份、大豆油70～90份、中链甘油三酯160～180份、乳化磷脂10～20份、泊洛沙姆?188，7～13份、甘油7～13份、油酸0.5～2份、VE 0.5～2份、EDTA?Na2 0.03～0.1份、余量为注射用水；该药物组合物可以制成鼻腔亚微乳制剂，具有脑靶向作用强、生物利用度高、副作用小的优势。该制备方法科学合理、适合工艺化大生产，应用前景广阔。
【专利说明】
一种用于治疗脑缺血的药物组合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及中药新剂型技术领域，尤其涉及一种用于治疗脑缺血的药物组合物及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 脑缺血是由于大脑短暂性血液供应不足引起的脑组织缺血，从而导致局限性脑组 织缺血性坏死，以及相应症状和体征的出现。临床表现为突发性头晕、眼花、耳鸣、眩晕、走 路不稳，严重时出现意识模糊、双目失明或复视、单侧双侧肢体无力与感觉异常、莫名摔倒、 说话不流利等，出现过短暂性脑缺血症状病人一般在一到五年内可能会发生脑梗塞，而患 过脑梗塞的病人中三分之一到三分之二曾经发生过短暂性脑缺血。从相关临床文献和住院 病历可知，缺血性脑损伤是复发性脑水肿疾病的主要诱发因素之一，成为导致人类死亡的 三大疾病之一，近年来发病率逐年升高，诱因增加，病患增多，已引起了国内外医疗行业的 高度重视。
[0003] 丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，是常用的活血化瘀药。药理学研究表明 丹参能改善微循环，扩张血管，降低血小板聚集性及血液粘稠度，改善血液流变学。红花为 菊科植物红花的干燥花，是传统的活血化瘀药。目前临床上较常用的药物有丹参注射液、红 花注射液和丹红注射液用于治疗心脑血管疾病。现有临床用于治疗缺血性脑损伤的主要用 药形式包括静脉注射和口服给药，口服药物生物利用度低，同时存在血脑屏障的阻碍，静脉 注射潜在的临床风险和血脑屏障的阻碍，严重影响了药物入脑，生物利用度极低，在一定程 度上影响了治疗效果。但注射剂潜在的临床风险使其临床使用受到一定的限制。因此，开发 心脑血管外给药替代制剂的研究有一定的临床价值，可作为临床有效补充治疗方式。
[0004] 鼻腔给药作为一种新兴的给药途径，不但可以用于鼻腔疾病的治疗，还可通过鼻 腔的各种通路起到全身治疗的作用。鼻腔与脑脊液之间存在的某些联系，是鼻腔给药与脑 部疾病产生了一定联系，存在着天然的"鼻脑通路"。研究提示，通过鼻腔给药可以绕过血脑 屏障，显著增加药物在脑组织中的分布，用于治疗中枢神经系统疾病。与当前使用的其他方 法相比，鼻腔给药这一非侵入性的给药方法更加简单、安全。对于那些作用于中枢神经系统 且疗效与脑功能有关的药物如用于治疗帕金森、阿尔兹海默氏病等药物，尤其是常规给药 途径下脑内浓度极低的药物，优势更为明显。
[0005] 本发明将丹参、红花提取物制成鼻腔给药亚微乳制剂，它可选择性地蓄积于脑部， 使治疗药物在脑靶区浓度超出传统制剂的数倍至数百倍，明显提高疗效。同时药物在正常 组织分布量较少，可减轻不良反应，达到高效低毒的效果。该制剂可改善药物体内的吸收， 并通过鼻腔给药克服了血脑屏障，达到治疗缺血性脑损伤的目的。

【发明内容】

[0006] 为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一:在于提供一种用于治疗脑缺血的 药物组合物配比；目的之二:还在于提供该药物组合物的制备方法；目的之三，又在于提供 该药物组合物的给药途径。总体来说，本发明药物组合物具有脑靶向作用强、生物利用度 高、副作用小的优势。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 本发明药物组合物活性组分的重量份配比是:丹参提取物0.5~2份、红花提取物 0.5~2份。
[0009] 优选的，所述药物组合物的活性组分的重量份配比为:丹参提取物1份、红花提取 物1份。
[0010] 进一步来说，本发明的药物组合物，其活性组分的制备方法如下：
[0011] ⑴、丹参提取物的制备方法是:取丹参药材，加水浸渍提取，提取液用醇沉法精制 除杂，再经浓缩、干燥处理后，即得；
[0012] ⑵、红花提取物的制备方法为:取红花药材，加水浸渍提取，提取液再浓缩、干燥处 理后，即得。
[0013] 进一步优选地，本发明药物组合物，其活性组分的制备方法如下：
[0014] ⑴、丹参提取物的制备方法为:取丹参药材，加药材重量8~12倍量水，于75~85°C 条件下温浸提取两次，每次浸提时间1~3h，合并提取液，滤过，滤液于55~65°C减压浓缩至 相对密度为1.18~1.22的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为65~75%，静置10~14h，取上清 液，回收乙醇、浓缩、干燥，得丹参提取物；
[0015] ⑵、红花提取物的制备方法为：取红花药材，加药材重量3~7倍量水，于85~95°C 条件下温浸提取2次，每次浸提时间1~3h，合并提取液，滤过，滤液浓缩、干燥，得红花提取 物。
[0016] 更进一步优选地，本发明药物组合物，其活性组分的制备方法如下：
[0017]⑴、丹参提取物的制备方法为:取丹参药材，加药材重量10倍量水，于80°C条件下 温浸提取两次，每次浸提时间2h，合并提取液，滤过，滤液于60°C减压浓缩至相对密度为 1.18~1.22的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为70 %，静置12h，取上清液，回收乙醇、浓缩、干 燥，得丹参提取物；
[0018] ⑵、红花提取物的制备方法为:取红花药材，加药材重量5倍量水，于90°C条件下温 浸提取2次，每次浸提时间2h，合并提取液，滤过，滤液浓缩、干燥，得红花提取物。
[0019] 对于上述技术方案进一步来说，本发明药物组合物中，所述活性组分是以丹参、红 花两种提取物，加入药用辅料制成的磷脂复合物为活性载体。对此，本发明在整个技术方案 中，将之描述成"丹参、红花提取物磷脂复合物"。
[0020] 更进一步来说，本发明治疗脑缺血的药物组合物，它按如下重量份配比的原料组 成:丹参、红花提取物磷脂复合物30~50份、油相230~270份、乳化剂10~20份、助乳化剂7 ~13份、等渗调节剂7~13份、稳定剂0.5~2份、抗氧剂0.5~2份、金属离子络合剂0~0.1 份。
[0021] 进一步优选的，所述油相为大豆油、中链甘油三酯，所述乳化剂为乳化磷脂、所述 助乳化剂为泊洛沙姆-188、所述等渗调节剂为甘油、所述稳定剂为油酸、所述抗氧剂为VE、 所述金属离子络合剂为HDTA-Na 2。
[0022] 进一步优选的，所述本发明药物组合物包括如下重量份配比的原料组成:丹参、红 花提取物磷脂复合物30~50份、大豆油70~90份、中链甘油三酯160~180份、乳化磷脂10~ 20份、泊洛沙姆-188 7~13份、甘油7~13份、油酸0.5~2份、VE 0.5~2份、EDTA-Na2 0.03 ~0 · 1份。
[0023] 更进一步优选的，所述本发明药物组合物包括如下重量份配比的原料组成:丹参、 红花提取物磷脂复合物50份、大豆油90份、中链甘油三酯180份、乳化磷脂20份、泊洛沙姆-188 7份、甘油 13份、油酸2份、VE 0.5份、EDTA-Na2 0.1 份。
[0024] 又进一步优选的，所述本发明药物组合物包括如下重量份配比的原料组成:丹参、 红花提取物磷脂复合物30份、大豆油70份、中链甘油三酯160份、乳化磷脂10份、泊洛沙姆-188 13份、甘油7份、油酸0.5份、VE 2份、EDTA-Na20.03份。
[0025] 再进一步优选的，所述本发明药物组合物包括如下重量份配比的原料组成:丹参、 红花提取物磷脂复合物40份、大豆油80份、中链甘油三酯170份、乳化磷脂15份、泊洛沙姆-188 10份、甘油 10份、油酸 1 份、VE 1 份、EDTA-Na2 0.06份。
[0026]进一步地，本发明药物组合物的剂型为:亚微乳制剂。
[0027]本发明治疗脑缺血的药物组合物，所述亚微乳制剂的制备方法如下：
[0028] ⑴、取甘油、泊洛沙姆-188、EDTA-Na2分散于注射用水中，加热至50~60°C，搅拌至 全部溶解，制得水相；
[0029] ⑵、分别称取丹参提取物和红花提取物，再称取大豆卵磷脂，将三者置于磁力搅拌 器中，加入甲醇，在50~60°C的水浴复合反应1~3小时，回收甲醇至剩余20%体积，制得丹 参、红花提取物磷脂复合物甲醇液；
[0030] ⑶、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油、中链甘油 三酯，继续回收至无甲醇味，再加入Ve、油酸、乳化磷脂，在高速组织捣碎机转速为15000~ 25000rpm搅拌下，再将上述步骤⑴水相，搅拌8~12分钟，制得初乳;用蒸馏水将初乳稀释定 容至处方量，转移至高压均质机中，均质压力为800~1200par，均质时间是6~11次，均质温 度控制在30~50°C，用碱调节pH值至4~6，即得。
[0031] 进一步优选的，本发明治疗脑缺血的药物组合物，所述亚微乳制剂的制备方法如 下：
[0032] ⑴、取甘油、泊洛沙姆-188、EDTA-Na2分散于注射用水中，加热至55°C，搅拌至全部 溶解，制得水相；
[0033] ⑵、分别称取丹参提取物和红花提取物，再称取大豆卵磷脂，将三者置于磁力搅拌 器中，加入甲醇，在55°C的水浴复合反应2小时，回收甲醇至剩余20%体积，制得丹参、红花 提取物磷脂复合物甲醇液；
[0034] ⑶、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油、中链甘油 三酯，继续回收至无甲醇味，再加入Ve、油酸、乳化磷脂，在高速组织捣碎机转速为20000rpm 搅拌下，再将上述步骤⑴水相，搅拌10分钟，制得初乳；用蒸馏水将初乳稀释定容至处方 量，转移至高压均质机中，均质压力为lOOOpar，均质时间是9次，均质温度控制在40°C，用碱 调节PH值至4~6,即得。本发明具有以下有益效果：
[0035] ⑴、本发明药物组合物的中药活性组分是由丹参和红花提取物，丹参药材中主要 含有脂溶性和水溶性成分，丹酚酸B为其中含量最高的水溶性成分。现代药理学实验表明， 该成分具有良好的抗血栓作用。红花药材中以羟基红花黄色素 A含量最高，红花药理功效的 最有效水溶性部位，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血 小板激活因子与血小板受体的结合，是红花黄色素的活血化瘀有效成分。为了最大将两种 药材中有效成分提取出来，并达到良好的治疗效果。本发明分别对两种药材提取温度及提 取时间进行考察，最终确定最佳的工艺条件，最终获得得丹参提取物，按照药典方法测得实 验室所制丹参提取物中丹酚酸B的含量为16.119% ;最终得红花提取物(收率为35% )。测得 实验室所制提取物中羟基红花黄色素 A的含量为3.117%。
[0036]⑵、分别对不同组分配比的丹参和红花两种提取物，进行体外的抗氧化实验，获得 最佳的组分配比为丹参提取物、红花提取物的最佳配比为：1:1。采用线拴法复制局灶性缺 血模型，并将上述优选的丹参、红花提取物配比进行药理学实验，以神经功能缺损评分、横 木评分、脑指数、梗死体积、生化指标及病理学为观察指标，本发明丹参、红花提取物的疗效 最佳，优于丹红注射液组及丹参提取物组。这也进一步说明，本发明中药活性成分组方的配 比的科学性，具有明显的缺血性脑损伤作用。
[0037]⑶、由于丹参、红花提取物亲脂性较差，药物采用常规的口服制剂或注射液，在人 体吸收后，药物中有效成分很难通过血脑屏障，若将丹参、红花提取物制成鼻用脑靶向制 剂，该制剂具有良好的生物膜透过率，可增加药物的生物利用度，提高对脑缺血病症的治疗 效果。根据鼻腔给药的常见剂型我们选择了水溶液剂、油溶液剂、微乳制剂、亚微乳制剂四 种载药剂型，通过猪鼻黏膜透过实验及蟾蜍上腭纤毛刺激性实验，结果表明，离体猪鼻黏膜 渗透实验中的渗透系数，亚微乳制剂的表观渗透系数和稳态流量均高于其他三组剂型，且 亚微乳制剂对蟾蜍上腭纤毛刺激性最小，因此本发明选择亚微乳制剂作为鼻腔给药理想剂 型。
[0038]⑷、本发明药物组合物的亚微乳制剂的制备工艺研究
[0039] ①将丹参、红花红提取物制成磷脂复合物后可明显改善其油水分配系数，提高其 生物利用度。丹参、红花提取物:大豆卵磷脂=1:1，复合率％ = 60.27%，丹参、红花提取物： 大豆磷脂=1: 2，复合率％ = 97.57%，丹参、红花提取物：大豆磷脂=1: 3，复合率％ = 95.73%，故选择丹参、红花提取物:大豆卵磷脂= 1:2,作为处方最佳配比；本发明亚微乳制 剂的制备工艺采用转相技术将磷脂复合物溶解分散在油相溶液中，采用正交试验方法优化 筛选，结果表明，丹参、红花提取物磷脂复合物的制备是以甲醇作为复合溶剂，复合物会以 极细小的微粒均匀分散到油相中，可达较好的溶解效果。
[0040] ②对处方组成中的油相、载药量、油酸、等渗调节剂、抗氧剂进行考察，确定最优化 处方组成比例，载药量为4%，乳化磷脂用量为1.5%，泊洛沙姆-188用量为1 %，pH调节至5。 按照该工艺制得三批亚微乳制剂的粒径(nm)均在210nm~240nm，PDI在0 · 246~0 · 321;对初 乳温度，剪切速度，剪切时间进行考察，采用星点-效应面法，以高压均质法制备丹参、红花 提取物鼻用脑靶向亚微乳。对优化的亚微乳制剂，进行电镜观察和粒径测定，结果表明，本 发明药物组合物亚微乳制剂，药液粒径细小，分散均匀。粒径，209.55~217.0 (nm)，PDI， 0.216~0.246，zeta电位，-31.51~-34.46。这表明，本发明亚微乳制剂具有粒径小，分散性 和稳定性好的优点。
[0041 ] (5)、本发明药物组合物的亚微乳制剂的药效学实验
[0042]实验结果表明，各制剂组都能延长缺氧小鼠的存活时间，亚微乳组能提高缺血、缺 氧小鼠脑组织中的SOD活力，降低MDA含量，提高ATP酶活性，降低LD水平。且亚微乳高剂量能 减轻脑组织神经功能缺损，脑梗死率、脑水肿与模型组比较(P〈〇.05)，能显著提高血清和脑 组织中SOD、MDA、GSH-PX和NO的生化水平，与模型组相比(P〈0.05)。
[0043] 1、本发明丹参、红花提取物的制备工艺的优化：
[0044] ①、丹参提取工艺
[0045] 对丹参水溶性成分的提取工艺进行研究，以水为溶剂，以丹酚酸B的含量作为评价 指标，考察在不同温度不同时间条件下丹参的动态提取率，确定其最佳提取工艺。
[0046] 提取方法考察:取丹参药材15g，共3份，精密称定，置于圆底烧瓶中并加设冷凝装 置，加20倍量水(所用溶剂量参考相关文献），置于水浴锅或电热套中，分别于70°C、75°C、80 °(：、85°(：、90°(：、微沸的条件下回流提取，各样品分别于提取1〇1^11、2〇1^11、3〇1^11、451^11、 60min、90min、120min、180min时取提取液2mL，同时补充2mL水，测定不同时间样品中丹酸酸 B含量。
[0047] 表1不同温度不同时间浸提液中提取物的含量(mg/ml)
L0049」根据表1数据可知，随着浸提时间的增长，水提液中丹酚酸B的含量不断升高，120 分钟内含量迅速增高，随后增长趋势变缓，到120分钟后丹酚酸B含量曲线趋以平衡。120分 钟以内，温度越高，提取率越高，微沸环境下提取率最高，表明温度对丹酚酸B提取的影响很 大。平衡后80°C环境下含量测定结果最高，原因可能是丹酚酸B长时间在高温环境中会分 解。根据含量测定结果，最终选择最佳提取条件为80°C条件下温浸提取120min。
[0050]优选并确定红花提取物的制备工艺:取丹参适量，加10倍量水，于80°C条件下温浸 提取两次，每次浸提时间2h，合并提取液，滤过，滤液于60°C减压浓缩至相对密度为1.18~ 1.22的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为70%，静置12h，取上清液，减压回收乙醇，并浓缩至稠 膏，于真空干燥箱中进行干燥，最终得丹参提取物。
[0051 ] ②、红花提取工艺研究
[0052] 本研究对红花的提取工艺进行研究，以羟基红花黄色素 A的含量为指标，考察不同 温度条件下的动态提取率，优选较佳的提取工艺。
[0053] 提取方法考察：取红花药材IOg共6份，精密称定，置于圆底烧瓶中并加设冷凝装 置，加5倍量水(所用溶剂量参考相关文献），置于水浴锅或电热套中，分别于50,60,70,80， 90 °C以及微沸的条件下回流提取，各样品分别于提取5，10，15，20，30，45，60，90min时取样 ImL，同时补充ImL溶剂。
[0054] 供试品溶液的制备:精密量取不同温度(50，60，70，80，90 °C及微沸)浸提液2mL，置 于IOmL量瓶中，用25%的甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45μπι微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0055]表2不同温度不同时间浸提液中提取物的含量(mg/ml)
[0057] 根据表2的实验结果可知，随着提取时间的延长，红花浸提液中羟基红花黄色素 A 的含量逐渐升高，60min时曲线趋于平衡。相同提取时间，提取温度越高，提取率越高，提取 温度对羟基红花黄色素 A含量有较大影响。由于羟基红花黄色素 A存在热不稳定性，长时间 高温环境会引起浸提液中羟基红花黄色素 A的水解。温度较高条件下，60min达到平衡后，提 取含量会有不同程度下降。根据含量测定结果，最终选择提取条件为在90°C条件下温浸提 取60min。
[0058] 优选并确定红花提取物的制备工艺：取红花药材，加5倍量水，于90°C条件下温浸 提取2次，每次lh，合并提取液，滤过，滤液于60°C减压浓缩至相对密度为1.18~1.2的清膏， 于真空干燥箱中进行干燥，最终得红花提取物。
[0059] 2本发明丹参、红花提取物组方配比的优化与药效学
[0060] 为了获得疗效更佳的药物组合物的组方配比，我们选取几种丹参提取物及红花提 取物的不同组方配比，并进行体外抗氧化实验研究，得出结论:丹参提取物的抗氧化能力最 强，红花提取物的体外抗氧化能力最弱，而丹参红花混合提取物的体外抗氧化能力又远优 于红花提取物，介于丹参提取物与红花提取物之间。
[0061] 为了验证本发明丹参、红花提取物组方配比的疗效，本试验采用线拴法复制局灶 性缺血模型，以神经功能缺损评分、横木评分、脑指数、梗死体积、生化指标及病理学为评价 手段对各组分进行实验。
[0062] 2.1仪器与试药：
[0063]电子天平;玻璃分针、眼科镊、手术剪、止血钳、缝合针线、不同规格尼龙线。动物： 选用2月龄清洁级健康SD大鼠96只，体重250g左右，雌雄参半，，购自西安交通大学医学部试 验动物中心，合格证号：scxk(陕)2012-003。试药:丹参提取物及红花提取物均为实验室自 制；尼莫地平注射液(辰欣药业股份有限公司，批号1404262102);丹红注射液（山东丹红制 药有限公司，生产批号：14111011);水合氯醛(上海山浦化工有限公司，批号20140905) ;TTC (美国Sigma公司）;试剂盒:一氧化氮合酶(NOS)，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱 甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(批号：20141211,20141212,2141213,20141210)，以上测定试剂 盒均购买自为南京建成生物工程研究所。
[0064] 2.2试验方法
[0065] 动物分组:取96只大鼠，随机分为6组，分别为模型组、尼莫地平组、丹红注射液组、 丹参提取物组、丹红配伍组(丹参提取物与红花提取物质量比为1:1)、假手术组，鉴于线拴 法模型存在的死亡率存在，考虑到该因素，每组实验动物设为16只，雌雄各半。
[0066] 2.3药物配制及给药方案
[0067]丹参提取物溶液的配制：精密称取丹参提取物适量，溶于生理盐水中，制成1.5g/ ml的溶液;丹红配伍组溶液的配制：依据已知的丹红注射液工艺，丹参与红花的生药用量比 例为3:1;丹参提取物与红花提取物：按质量比1:1进行配伍。取丹红混合提取物适量，溶于 生理盐水中，制成Ig/ml的溶液。
[0068] 2.4给药方案:预防给药7天，每天分别于上午7点，晚上七点对不同组给相应药物， 每天给药两次;第8天进行线拴法模型的制作。丹参提取物组、丹红配伍组采取滴鼻给药的 方式，滴鼻给药〇. Iml;模型组和假手术组也采取滴鼻给药方式，滴鼻给药0.1 ml生理盐水； 尼莫地平组及丹红注射液组采取腹腔注射的方式，尼莫地平组按给药量2ml/kg进行腹腔注 射，丹红注射液按给药量0.5ml/kg进行腹腔注射。
[0069] 2.5血管内栓线阻断法建立大鼠局灶性脑缺血模型：
[0070] 大鼠用10%水合氯醛(35mg/kg)实施腹腔麻醉注射。仰卧位固定，碘伏擦拭消毒， 腹侧颈正中线切开皮肤。沿胸锁乳突肌内缘将肌肉和筋膜进行分离。分离右侧颈总动脉 (CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉（ICA)。在右侧颈总动脉的远心端、近心端及颈外动脉处 挂线备用。用微动脉夹临时夹闭颈内动脉，然后于靠近心脏一段结扎右侧颈总动脉和颈外 动脉。在距右侧颈总动脉分叉位置4mm处剪一小开口，将事先准备好的鱼线插入到颈内动脉 中。然后用绕在右侧颈总动脉离心脏较远端的细线轻轻系牢鱼线。用眼科镊将鱼线推至离 血管分叉处18_，轻柔地系牢右侧颈总动脉远心端得细线。常规缝合伤口。假手术组只进行 麻醉和血管分离手术，不进行血管结扎，也不插入鱼线。2小时后将栓线向外拔出5mm，以实 现再灌注。各用药组再灌注后立即给予相应药物，假手术组和模型组则给予等量的生理盐 水。
[0071] 2.6指标测定：
[0072] 2.6.1大鼠神经功能缺损评分:大鼠造模2小时后进行再灌注，再灌注3小时后，进 行5分制神经功能评分。0分:无明显神经功能缺损症状；1分:提尾时左前肢内收屈曲，不能 完全伸展左前肢，属于轻度局灶性神经功能缺损;2分:爬行时向左侧旋转、划圈，属于中度 局灶性神经功能缺损;3分:站立时向左侧倾斜，属于重度局灶性神经功能缺损;4分:不能自 发行走或出于昏迷状态。
[0073] 2.6.2横木行走评分:横木长80cm，宽2.5cm，距离地面IOcm处。0分:能跳上平衡木； 1分:能跳上平衡木，在横木上行走机会在50 %以下；2分:能跳上平衡木，在上面行走机会在 50%以上;3分:在未栓塞侧后肢帮助下能跳上平衡木，但因受到瘫痪侧后肢拖累不能帮助 向前移动;4分:在平衡木上不能行走，但可坐在上面;5分:不能在平衡木上停留，会掉落。 [0074] 2.6.3脑梗死率的测定:脑梗死率的测定采用红四氮唑（TTC)染色法。于再灌注24 小时候断头取脑，去除嗅球、延髓和小脑，在4 °C的生理盐水条件下，去除组织中的脂肪，血 丝等杂质，并拭干水分，准确称取全脑重，于-4°C冰箱中冷冻24小时左右，间隔2mm连续做5- 6个脑冠状切片，加入2 % TTC溶液，浸没切片，置于37 °C烘箱中解育30min，每隔5-10min翻动 脑片，使均匀接触染色液。TTC可被线粒体过氧化氢酶还原，正常脑组织染为红色，梗死组 织则为白色。用眼科镊分离梗死区(苍白区）与正常区（非苍白区），分别准确称重，计算梗死 百分比，即梗死率=苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)*1〇〇%。
[0075] 2.6.4生化指标的测定:于大鼠腹主动脉取血5ml，用可调高速离心机离心（3500r/ min)10min，取上清液，置4 °C冰箱保存备用。取大鼠血浆，参照南京建成生物工程研究所提 供的试剂盒(SOD、MDA、谷胱甘肽过氧化物酶，一氧化氮合酶)操作说明进行试验操作。
[0076] 2.6.5病理学损伤评价:取大鼠全脑放于装有中性福尔马林的小瓶内备用。将脑组 织进行切片，以甲醛饱和液和PH7.4的PBS缓冲液配制的10%中性甲酸固定液(体积比为1: 9)浸泡8小时，沥干固定液，依次用70%、80 %、90%、95%和无水乙醇浸泡脱水，沥干，再用 二甲苯浸泡半小时，沥干，浸赔、包埋，然后切片、摊片、烤片，最后HE染色、封片、归档。根据 形态学表现按照表3评分标准进行评价。
[0077]表3脑切片病理学损伤评价表
[0079] 统计学处理:数据采以Λ 土S表示，统计采用单因素方差分析和t检验，以P〈0.05为 统计结果有统计学意义。釆用SPSS19.0统计软件对每组各指标进行统计学分析。
[0080] 2.7试验结果：
[0081 ] 2.7.1大鼠神经功能缺损评分及横木评分结果
[0082] 表4不同给药组大鼠评分结果(n = 10)
[0084] 注：与模型组相比，*Ρ〈0·05
[0085] 表4表明，与模型组相比，各给药组大鼠的神经功能缺损及横木评分存在显著性差 异，说明该实验造模成功。各给药组中，丹红注射液组的神经功能缺损评分及横木评分均为 最低;尼莫地平组的神经功能缺损评分低于两个提取物组，但横木评分高于两个提取物组； 丹红配比组与丹参提取物组之间的评分结果也存在差异，说明由于脑缺血机制的复杂性及 药物治疗机制的复杂性，无法单纯由这两项评分来判断治疗效果的优劣性，还需要进行进 一步的试验研究。
[0086] 2.7.2脑梗死率的测定
[0087] 表5大鼠脑梗死率试验结果(η = 6)
[0089] 注：与模型组相比，*Ρ〈0·05
[0090] 表5表明，与模型组相比，各给药组大鼠的脑梗死率没有显著性差异，从直观分析 可知，给药组均有一定的治疗效果，尼莫地平组的治疗效果最佳，丹红配比组的治疗效果要 优于丹红注射液组及丹参提取物组。
[0091] 2.7.3生化指标的测定
[0092] 表6生化指标测定结果(η = 6)

[0095] 注：与模型组相比，*Ρ〈0·05。
[0096] 由表6的实验结果可知，SOD及GSH中，模型组与丹红配比组有显著性差异，其他组 别数据无显著性差异。由数据直观观察可知，SOD测定结果中，给药组的SOD含量均高于模型 组，丹红配比组的SOD含量最高，丹红注射液组次之，丹参提取物组介于两组之间;MDA测定 结果中，给药组的MDA含量均低于模型组，丹红配制组的MDA含量最低，丹红注射液组的测定 结果介于丹红配比组与丹参提取物组之间；GSH测定结果中，给药组的GSH含量均高于模型 组，丹红配比组的含量最高，丹参提取物组的高于丹红注射液组;NOS组中，各给药组的NOS 含量均第二模型组，丹红配比组的含量最低。根据以上四组评价指标进行综合分析可知，给 药组通过增加机体内SOD及GSH的含量，降低MDA及NOS的含量，来起到治疗缺血性脑损伤的 作用，其中，丹红配比组的治疗效果最佳。
[0097] 2.7.4病理学损伤评价:通过显微镜观察得，可以得到:模型组，中能观察到较多胶 质细胞增生和严重组织水肿（20倍光镜下的照片）；且能观察到重度炎性细胞浸润（10倍光 镜下照片）。丹红注射液组，中能观察到轻度胶质细胞增生及轻度组织水肿。尼莫地平组，中 能观察到轻度胶质细胞增生及轻度组织水肿；中能观察到少量胶质细胞增生及轻度炎性细 胞浸润及轻度组织水肿；（20倍光镜下照片）中能观察到少量胶质细胞增生及轻度炎性细胞 浸润及轻度组织水肿。丹参提取物组，（20倍光镜下照片）中能观察到少量胶质细胞增生及 轻度组织水肿。（20倍光镜下照片）中能观察到中能观察到少量胶质细胞增生及轻度炎性细 胞浸润及轻度组织水肿。丹红配比组图1-中能观察到中能观察到少量胶质细胞增生及轻度 组织水肿。根据大鼠脑切片的病理学损伤评价，得出表7。与模型组相比，四个给药组对病变 均有一定的缓解作用，其中，丹红配比组的缓解抑制作用最好。
[0098] 表7脑损伤大鼠脑切片病理损伤评分表G )
[0100] 表7表明，与模型组相比，各给药组均有一定的治疗作用，能够有效缓解大鼠脑组 织细胞的水肿、胶质细胞增生及炎性细胞浸润的情况。其中，丹参、红花提取物配比组的治 疗效果最佳，优于丹红注射液及丹参提取物组。
[0101] 3、本发明药物组合物剂型的优选
[0102] 3.1、不同剂型动物鼻黏膜体外渗透性试验
[0103] 3.1.1仪器与试药
[0104] 3.1.1.1仪器
[0105] U3000高效液相色谱仪（美国戴安），色谱柱BDS HYPERSILC-C18柱（4.6mmX 250mm)，AR1140电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司），水平扩散池（上海玉研科学 仪器有限公司），pH计（奥立龙pHS-3C)，恒温磁力搅拌器(常州国华电器有限公司），猪鼻黏 膜(取自咸阳市五陵故园屠宰场）。
[0106] 3.1.1.2试药
[0107]丹参酚酸B水提物、红花黄色素水提物（自制），大豆卵磷脂(pc多50%，上海太伟药 业），丹参酚酸B标准品（中国食品药品检定研究院，批号：111562-201213)、羟基红花黄色素 A标准品（中国食品药品检定研究院，批号：11637-201208);大?油(浙江省龙游县田雨山大 豆油开发有限公司），甲醇乙腈为色谱纯，水为纯净水，注射用丙三醇（上海大亮化工有限 公司）。
[0108] 3.1.2受试制剂的制备
[0109] 3.1.2.1水溶液剂
[0110] 取丹参、红花提取物磷脂复合物5g，加 ρΗ5.8的磷酸缓冲液50mL研磨，4000转/min 离心10分钟，取上层溶液作为水溶液。
[0111] 3.1.2.2 油溶液剂
[0112]取大豆油50mL，加入丹参、红花提取物磷脂复合物5g，研磨使其分散均匀，4000转/ min离心10分钟，取上层液作为油溶液剂。
[0113] 3.1.2.3 微乳制剂
[0114] 取磷脂复合物4g，吐温-80 20g，甘油20g，中链油1.6g加水至IOOmL将丹红磷脂复 合物、吐温-80、甘油、大豆油混合均匀后，加水至100mL，所得微乳为半透明液体。微乳制剂 采用转相法制备，转相乳化法是先将乳化剂/助乳化剂与油相混匀，再向油相中缓慢加入水 相，加水时不断搅拌，加到足够量停止，即得所需要微乳制剂。
[0115] 3.1.2.4亚微乳制剂
[0116] 取磷脂复合物4g，大豆油10g，吐温-80 20g，甘油20g，泊洛沙姆-188 1.5g，乳化磷 月旨〇. 6g。将油相和水相同时加热到55°C后，混合搅拌制备初乳，后用高压均质机制备亚微 乳。
[0117] 3.1.2.5体外渗透实验操作
[0118]取下猪鼻部(2h内处死），割开鼻腔，用镊子剥下鼻腔薄膜，用生理盐水清洗残留的 血渍，铺开，立刻使用。采用水平渗透扩散池，两侧池内分别放入磁力转子，将离体猪鼻黏膜 固定在两池之间。给药池中加入6mL溶液，接收池加入6mL生理盐水。装置置于37°C环境中 (水浴37±1°C)，开动搅拌器匀速搅拌。于实验开始后的第5、10、15、30、45、60、90、120、150、 180、240、300min分别用移液管从接受池吸取ImU同时补ImL生理盐水，将样品液离心 (150000r · Hiirr1HOmin,取上清液测定药物浓度，计算药物稳态流量Vss和表观渗透系数 Papp0
[0119] 3.1.2.6样品测定及结果
[0120] 取上述各剂型原溶液lmL，加甲醇适量，超声处理lOmin，并用甲醇定容IOmU按上 述色谱条件测定其中丹参酚酸B和羟基红花黄色素 A的含量。测出的含量为各制剂的初始含 量Co，丹参酚酸B(水溶液为0 · 56mg/mL，油溶液为0 · 67mg/mL，微乳为1 · 04mg/mL，亚微乳为 I . 17mg/mL)羟基红花黄色素 A(水溶液为0.162mg/mL，油溶液为0.182mg/mL，微乳为 0.297mg/mL，亚微乳为0.324mg/mL)，按照上述方法收集各时间点的透过液，按照上述方法 测定峰面积，计算丹参酚酸B和羟基红花黄色素 A的含量。各剂型累计透过量。
[0121] 以离体鼻黏膜累积透过量R对渗透时间t进行拟合，用下面公式计算药物的表观渗 透系数(Papp，cm-2 · s-〇及稳态流量(Vss，yg · cm-2 · s-
[0122]
[0123] Co为各剂型的初始浓度，S为渗透池的透过_枳，dR/dt由累积透过量-时间拟合曲 线的斜率求得。按照公式计算表观渗透系数Papp及稳态流量Vss两个参数，绘制出各制剂中 丹参酚酸B参见附图2和羟基红花黄色素 A累积透过量的曲线图参见附图3。
[0124] 从上述数据和曲线分析可得出，0~120min内各剂型丹参酚酸B和羟基红花黄色素 A的累积透过量对时间呈良好的线性关系，对0~120min内的数据分别用零级动力学方程、 Hguichi方程和一级动力学方程进行拟合，根据相关系数结果分析，一级动力学方程拟合度 最佳。分析结果提示，制剂中药物透过猪鼻黏膜扩散属于以膜两侧浓度差为动力的被动扩 散。直观分析可以看出，亚微乳药物的透过量远远大于其他剂型。根据上述公式计算Papp和 Vss，进一步分析和预测各剂型透膜效果。
[0125] 表8不同剂型中丹参酚酸B透膜测定结果
[0129] 从上述实验数据，计算出四中制剂在离体猪鼻黏膜渗透实验中的渗透系数，亚微 乳制剂的表观渗透系数和稳态流量均高于其他三组剂型，结果说明亚微乳制剂是丹红磷脂 复合物通过鼻腔给药的较为理想的剂型。
[0130] 3.2不同剂型蟾蜍上腭纤毛刺激性评价
[0131] 由于上述四中不同鼻腔给药的剂型，所用的辅料不同，可能对鼻黏膜的刺激也有 一定差异，以蟾蜍为研究对象，观察四种剂型对蟾蜍上腭纤毛的刺激性，评价的指标是给药 后蟾蜍上腭纤毛持续运动的时间。以1 %的去氧胆酸钠做为阳性对照，用生理盐水做为阴性 对照。
[0132] 将蟾蜍仰卧固定，在上腭纤毛处滴加等量的上述四中溶液，使药液完全浸没上腭 后，用生理盐水清洗，分离蟾蜍两眼之间的黏膜，用生理盐水洗净，平铺到载玻片上，给表面 加200μ1生理盐水后，盖上盖玻片，10 X 40倍光学显微镜下观察上腭纤毛的运动情况，再置 于加有蒸馏水的色谱缸中，温度维持在20°C~25°C。隔一段时间取出，在显微镜下观察，上 腭纤毛停止运动时，记录时间，实验结果见下表10。
[0133] 表10不同剂型对蟾蜍上腭纤毛刺激性结果
[0135]注:与 I % 去氧胆酸钠组比较，pc〈0.01，pb〈0.05，pa>0.05 [0136]表10结果表明，亚微乳制剂对蟾蜍上腭纤毛刺激性最小。
[0137] 3.3本发明药物组合物处方与制备工艺研究 [0138] 3.3.1复合物分散方法及转相机制的研究 [0139] 3.3.1.1溶解分散方法研究
[0140]常用的药物溶解分散方法有搅拌、研磨、匀浆等方法，对上述几种溶解方法进行优 选，评价指标为溶解分散后的宏观、微观状态、不同溶解分散方法所得样品中丹参酚酸B、羟 基红花黄色素 A含量的均匀性。
[0141]表11不同溶解分散方法实验结果
[0145]表13丹参酚酸B含量测定结果
[0147] 3.3.1.2转相机制的研究
[0148] 3.3.1.2.1转相过程及机理解析
[0149] 丹参、红花提取物磷脂复合物的制备是以甲醇作为复合溶剂，用减压干燥法回收 甲醇，由于中链油可以溶解在甲醇中，实验研究发现药物与磷脂反应复合后，在旋转蒸发 仪中回收甲醇至一定量，停止回收甲醇，按处方量加入油相，继续回收剩余甲醇，随着甲醇 量的减少，复合物会以极细小的微粒均匀分散到油相中，可达较好的溶解效果。
[0150] 3.3.1.2.2转相时机的研究
[0151] 我们考察了回收甲醇后剩余量是100 %、80 %、60 %、40 %、30 %、20 %时开始转相， 结果表明回收甲醇至100%~30%的剩余量时开始转相，此时复合物可以均匀分散到油相 中。而回收甲醇至剩余量是20%时转相，甲醇溶液中已有明显的沉淀出现，此时丹参、红花 提取物磷脂复合物不能很好地分散在油相中。所以最终确定以回收甲醇剩余量为至30%的 时候作为转相的最佳时机，可以减少油相的受热时间，保证制剂的稳定性。
[0152] 3.3.2、影响亚微乳制剂成型的主要因素
[0153] 乳化剂及其用量:乳化剂选择不仅要考虑乳化剂的乳化能力及乳化剂本身的理化 性质，还要考虑制成乳剂后油水界面膜的稳定性。通常将离子型乳化剂与非离子型乳化剂 联合使用，离子型乳化剂可以增强电位，增强乳剂的稳定性，而非离子乳化剂乳化能力强， 能减小乳滴粒径。本研究分别选择乳化卵磷脂和泊洛沙姆为乳化剂和助乳化剂。载药量:通 过前面载药量的研究表明，6%以下的载药量可以有效实现药物在油相中均匀分散，但载药 量过高会影响亚微乳制剂的稳定性，载药量过低则很难实现药物疗效，通过预实验结果，最 终设计考察的载药量分别为4%、5%、6%。乳剂pH值:pH值不仅影响药物自身的稳定性，也 影响着亚微乳制剂的Zeta电位，从而影响亚微乳制剂的稳定性。还要考虑到鼻腔耐受药物 的合适PH值范围是(4.5~6.5)。
[0154] 3.3.2.1油相用量筛选
[0155] 制备亚微乳制剂常用的油相有大豆油(LCT)、中链甘油三酯油(MCT)、棉籽油、红花 油、芝麻油、玉米油、鱼油、海狗油等，中链甘油三酯油(MCT)做为油相有一定的毒性和刺激 性，结合预实验结果及实验成本我们把MCT: LCT的比例设为2:1，目的在保证载药量的同时 降低刺激性。亚微乳油相的一般浓度为10~30 %左右，油相比例过小，载药量变小，但若油 相比例过大会降低制剂稳定性。
[0156] 表14油相用量筛选结果(n = 3)

[0159] 根据表14结果，可以看出，油相比例过大不符合亚微乳制剂的指标要求，油相比例 过小则会影响制剂的载药量，所以我们选用25%的油相比例作为本制剂的油相用量。
[0160] 3.3.2.2载药量的初步考察
[0161] 载药量是药物是否发挥疗效的关键因素，我们根据上述实验中的转相方法与结果 考察油相中的载药量，以转相后油相的颜色性状作为指标，初步考察载药量，设计大豆油的 用量为25mL(100mL制剂的量）。
[0162] 表15不同载药暈考察结果
[0164] 表15表明，按照这种转相方法制备，载药量可以达到6%，多次重复试验，按此工 艺，载药量可以初步确定为4%~6%。
[0165] 3.3.2.3油酸用量考察
[0166] 处方中加入药物以后，亚微乳的两相界面会发生改变，需加入稳定剂，来加大分子 间作用力而提高膜的稳定性。亚微乳剂常用的稳定剂有油酸、油酸钠，油酸钠降低油水界面 张力的能力强于油酸，但油酸钠水溶性强很难固定在油水界面膜上，且油酸钠适于中性或 弱碱性制剂，不适合鼻腔给药，所以我们选择油酸为稳定剂。存留于乳化剂界面膜上的油酸 使乳滴带负电而产生静电斥力，增加了电位，防止乳滴的聚集，从而增强了亚微乳的稳定 性。根据文献用量结合预实验，考察了油酸用量0mL、0. lmL、0.2mL时对制剂稳定性的影响。
[0167] 表16油酸用量考察结果
[0169] 3.3.2.4等渗调节剂的考察
[0170]为了使亚微乳制剂能更好的被鼻黏膜吸收并减少刺激性，必须使制剂与鼻黏膜等 渗或者略高渗(280-320m〇sm〇l/kg)。低渗制剂容易发生鼻黏膜水肿，而且低渗药液和高渗 药液都可以降低鼻黏膜纤毛运动频率。本制剂同时考察了1%、1.5%和2%的甘油对渗透压 的影响，结果三种浓度的渗透压分别为435±8.97、357±12.03、323±5.72表明2%的甘油 用量会导致本制剂高渗，原因可能是药物和辅料也存在一定的渗透压，经过多次试验测得 当甘油用量为1 %时，制剂渗透压符合要求。
[0171] 3.3.2.5抗氧剂的考察
[0172] 为了防止制剂中原辅料的氧化，拟向油相中直接加入0.1 %的VE，为防止金属离子 对原辅料的催化，向水相中加入〇. 006 %的金属离子络合剂EDTA-Na2。
[0173] 通过上述处方优选的预实验，结合正交实验，对载药量、乳化卵磷脂用量、助乳化 剂泊洛沙姆-188以及PH值进行综合筛选，评价指标为亚微乳粒径，PDI等指标的归一值。 [0174]正交分析结果表明，载药量对亚微乳粒径的大小以及成型有着极其显著的影响， pH值也对亚微乳的成型有显著影响，其它两个影响不显著，综合上述结果，同时考虑到生产 制剂时的成本，同时考虑到制剂在偏酸性环境下比较稳定的特点，最终得出的最佳水平组 合是A1B1C1D1，即载药量为4%，乳化磷脂用量为1.5%，泊洛沙姆-188用量为1%，ρΗ调节至 5〇
[0175] 3.3.2.6处方因素验证试验
[0176] 按照上述优化出来的处方因素进行验证试验，结果三组实验的粒径和PDI指数都 符合亚微乳制剂的要求。表明优化的参数稳定可行。
[0177] 表17三批验证实验结果 L〇179」3.4初乳的制备工艺研咒
[0180] 3.4.1初乳温度的考察
[0181]根据磷脂复合物的复合温度，考虑到磷脂的稳定性，选择55°C作为制备初乳的温 度。制备好的初乳需要迅速冷却，以防止乳滴的凝聚。
[0182] 3.4.2剪切时间的考察
[0183] 采用前述转相方法，在回收完甲醇后，向油相中加入乳化卵磷脂S-75、油酸和维生 素 E，其余泊洛沙姆-188、甘油及EDTA-Na2等加入水中溶解，将水相加入油相中，转移至烧 杯，用高速剪切仪分别以剪切强度为20000rpm，分别剪切8、10、12min，在相应时间点取初乳 适量，迅速冷去后在电子显微镜下观察油滴的乳滴分布情况，拍下初乳镜检图，见附图4-6。
[0184] 3.4.3剪切转速的考察
[0185] 根据基本工艺流程中的方法，剪切一定时间，设置高速剪切仪转速为15000rpm、 20000rpm、25000rpm，各制备初乳一份，取样镜检，镜检图见附图7-9。
[0186] 3.4.4亚微乳制备工艺的考察
[0187] 根据处方因素的考察结果及初乳制备工艺筛选研究的结果，进一步采用高压均质 法制备丹红鼻用脑靶向亚微乳。本实验我们采用星点设计-效应面来优化均质工艺中的各 项参数，均质前粒径参见附图10,均质后粒径的变化参见附图11。
[0188] 影响均质后亚微乳制剂效果的因素有均质压力，均质次数，均质时的温度，在此三 个因素中均质次数就是均质时间，因为同样体积的的药液在规定压力条件下完成一次的时 间是确定的，所以这三个因素均属连续变量，可以采用星点设计效应面进行优化。评价指标 为亚微乳的粒径以及roi，计算每份样品评价指标的OD值来进行优化。
[0189] 3.4.5星点设计实验
[0190]采用软件设计星点设计因素水平编码表，见表18。
[0191]表18星点设计因素水平编码表
[0193] 3.4.5.1制备工艺的评价指标
[0194] 按照上述处方因素的优化结果，按处方量将甘油、泊洛沙姆-188、EDTA_Na2分散于 适量注射用水中，置磁力揽拌器中加热至55°C，并搅拌至全部溶解;分别称取0.67g丹参酚 酸B提取物和0.67g红花水提物，再称取大豆卵磷脂2.61g，将三者混匀，置于磁力搅拌器中， 加入400mL甲醇，在55 °C的水浴复合反应2小时，回收甲醇至剩余约120mL，加入油相，继续回 收至无甲醇味，在高速组织捣碎机(20000rpm)搅拌下将水相加入到油相中，搅拌10分钟，每 次制得初乳;用蒸馏水将初乳稀释定容至处方量，转移至高压均质机中，以星点设计因素水 平表中条件制备亚微乳，用〇. lmol/L的氢氧化钠调节pH值至5，即得。
[0195]本研究考察的是亚微乳制剂制备的工艺条件，评价指标是亚微乳制剂的粒径大 小，PDI大小，这两个指标的结果是越小越好，所以我们采用上面的公式1、3计算归一值，算 出最终的OD值。
[0196] 本研究使用Design-Exper8.0软件设计实验方案进行工艺筛选，按照上述各指标 的测定方法测定结果见表19将实验结果用hassan方法分别进行归一 (0-1)处理，计算各个 指标结果的归一值，算出三个指标结果的几何平均数，进而算出总评归一值0D，0D=(dl* d2*d3…dn)l/n其中15~20次试验为6次中心点试验，用于考察模型的误差。
[0197]试验的方差结果，将总评归一值采用Design-Exper8.0软件进行分析，本次试验以 OD值为因变量对三个因素进行拟合，二次方拟合的相关系数R2为0.9762，P〈0.0001三次方 拟合的相关系数R2为0.8882，P〈0.0001根据表19可以看出，各因素中的一次项、二次项、三 次项都具有显著性的差异，因此说明二项式拟合模型是成功的模型，实验值和预测值基本 吻合。拟合方程为0D = +0·56+0·28Xl+0·10X2+0·037X3-0·018XlX2-0·040XlX3-3·314E-003Χ2Χ 3-0.0 12Xi2-0.0 5 6X22-0.0 2 3X32 〇
[0198]表19星点效应面实验设计与指标测定结果

[0201] 从星点设计因素等高图中优选出的较佳区域为 两个因素等高图中优选出Χι(995~1000)，X2(30~50);从B、C两个因素等高图中优选出X2 (9.22~10)，乂3(39~50)，通过上述优化的情况，得出的最加范围是乂1(995~1000)而(9.22 ~10);Χ 3(39~50)〇
[0202] 考虑到工业化生产以及操作的方便性等原因，最终确定处方和制备工艺为:载药 量为4%，乳化磷脂用量为1.5%，泊洛沙姆-188用量为1%，ρΗ为5。均质压力是1000 parJ^ 质时间是9次，均质温度控制在40 °C，均质压力是1000 par。
[0203] 3.4.5.2验证实验
[0204] 按照上述的处方及制备工艺，制出三批样品用来验证优选的制备工艺的可靠性。 评价的指标是亚微乳制剂的粒径、粒度分布roi、Zeta电位，结果见表20,粒径测定图参见附 图12、Zeta电位测定图参见附图13。
[0205] 表20三批验证实验结果
[0207] 4本发明药物组合物亚微乳制剂的初步药效学研究
[0208] 观察亚微乳制剂对急性缺血缺氧小鼠脑组织功能的保护作用及对缺血大鼠脑组 织的保护作用。
[0209] 4.1对小鼠急性缺血缺氧脑组织功能的影响
[0210] 本研究复制了小鼠急性脑缺血缺氧模型，分别给予丹参、红花提取物水溶液、磷脂 复合物水溶液、磷脂复合物亚微乳后，通过生化指标的测定，研究三种制剂对小鼠急性缺血 缺氧脑组织功能的影响。
[0211] 4.1.1动物、试药及仪器
[0212] 4.1.1.1动物：昆明种小鼠，清洁级，雄性，体重20±2g，由中国人民解放军第四军 医大学实验动物中心提供，动物使用许可证号:SCXK-(军)2012-0007。
[0213] 4.1.1.2试药:丹酚酸B提取物（自制)红花黄色素提取物（自制）；丹红磷脂复合物 (自制)丹红磷脂复合物亚微乳（自制）尼莫地平注射液(辰欣药业股份有限公司，生产批号： 1404262102);丹红注射液：（山东丹红制药有限公司，生产批号：14111011);钠石灰(上海五 四化学试剂厂，生产批号：20140315);试剂盒:考马斯亮蓝蛋白，乳酸(LD)，丙二醛(MDA)，超 氧化物歧化酶（SOD)，超微量ATP酶（ATP):(批号：20150401,20150330,20150409， 20150408)，以上测定试剂盒:均为南京建成生物工程研究所产品。
[0214] 4.1.1.3仪器:UV-1700型紫外可见分光光度计，BS-200S-WEI型电子天平(北京赛 多利斯公司）；FLUKO F6/10-10G型超细匀浆机（弗鲁克上海流体机械制造有限公司）； Finnpipette移液器(上海斯丹赛生物技术有限公司）。
[0215] 4.1.2实验方法
[0216] 4.1.2.1急性脑缺血性缺氧实验
[0217] 72只小鼠，雌雄各半，分为6组，每组12只，分别为空白对照组、尼莫地平阳性对照 组、丹红注射液阳性对照组、丹红磷脂复合物组(4g磷脂复合物匀浆法溶于IOOmL水溶液 中）、丹参、红花提取物配比组(丹参提取物与红花提取物1:1的比例，浓度为〇.〇15g/mL)、丹 红磷脂复合物亚微乳组。尼莫地平组以4mL/kg的剂量腹腔注射，注射前用等量的生理盐水 稀释，丹红注射液以0.8mL/kg的剂量腹腔注射，注射前用10倍的生理盐水稀释，丹红磷脂复 合物亚微乳组滴鼻给药50ul，丹红磷脂复合物组(滴鼻给药50μ1，丹参、红花提取物配比组 滴鼻给药50μ1。每天给药一次，连续给药10天。第十天给药1小时后在乙醚浅麻醉下用剪刀 于双耳连线处快速断头，记录小鼠断头后张口喘息的次数，取小鼠大脑置于_80°C冰箱中保 存备用。
[0218] 4.1.2.2小鼠存活时间测定
[0219] 72只小鼠，雌雄各半，分为6组，每组12只，分别为空白对照组、尼莫地平阳性对照 组、丹红注射液阳性对照组、丹红磷脂复合物组、丹红水提物组、丹红磷脂复合物亚微乳组。 给药剂量与方法同上，各组小鼠同时放进装有钠石灰的密闭广口瓶中，记录小鼠存活时间。
[0220] 4.1 · 2 · 3脑组织 S0D、MDA、LD、ATP测定
[0221] 小鼠断头后取出大脑，准确称重后用生理盐水1:9在冰水浴中制成10%脑匀浆， 于-80°C冰箱冻存备用。脑组织生化指标按说明书操作测定。
[0222] 4.1.3结果
[0223] 4.1.3.1急性脑缺血性缺氧试验
[0224] 采用SPSS 19.0统计软件进行分析，结果显示亚微乳组和磷脂复合物组能明显延 长急性脑缺血缺氧小鼠的呼吸时间并增加张口次数，与空白对照组相比P〈〇. 05。丹红水提 物配比组与空白对照组相比虽没有统计学意义P>〇.05,但是数值明显提高，具体结果见表 21〇
[0225] 表21各组药物对急性脑缺血性缺氧小鼠呼吸时间和张口次数(i±S,n = 6)
[0232]注a:P〈0.05，b:P〈0.01
[0233] 由表22结果显示，亚微乳组对所选四种生化指标与空白对照组相比均有显著性差 异(P〈0.05)，丹红配比组与空白对照组均无显著性差异(P>0.05)，但SOD含量升高，MDA含量 降低，ATP酶活力升高。磷脂复合物组与空白对照组相比，LD水平和ATP酶活力显著降低和升 高（P〈0.05)，S0D和MDA含量与空白对照组相比无显著性差异(P>0.05)，但SOD含量有所升 高，MDA含量有所降低。
[0234] 4.1.3.3各组小鼠常压密闭性耐缺氧试验结果
[0235] 表23各组药物对常压密闭性耐缺氧小鼠存活时间的影响土S，n = 6)
[0238] 注a:P〈0.05，b:P〈0.01
[0239] 由表23结果显示，亚微乳组和磷脂复合物组与空白对照组相比有显著性差异(P〈 0.05)，明显提高小鼠的存活时间，丹红配比组与空白组相比无显著性差异(P>0.05)，但是 存活时间延长。
[0240] 4.1.3.4常压密闭小鼠脑组织生化指标结果
[0241] 表24各组常压密闭小鼠脑组织生化指标结果? ±S,n = 6)
[0243] 注a:P〈0.05，b:P〈0.01
[0244] 表24结果显示，亚微乳组和磷脂复合物组与空白对照组相比有显著性差异（P〈 0.05)丹红配比组与空白对照组相比各生化指标均无显著性差异(P>0.05)，但SOD含量增 高，MM含量降低，LD水平下降，ATP酶活力增高。结果可以说明磷脂复合物抗脑缺氧的能力 强于丹红配比组，而丹红磷脂复合物亚微乳抗小鼠脑缺氧能力更强。
[0245] 4.2对大鼠局造型脑缺血损伤的保护作用
[0246] 4.2.1动物、试药及仪器
[0247] 4.2.1.1动物:选用2月龄清洁级健康SD大鼠128只，体重250±25g，雌雄各半，购于 西安交通大学医学部实验动物中心，合格证号:scxk(陕)2012-003。
[0248] 4.2.1.1试药:丹酚酸B提取物（自制)红花黄色素提取物（自制）尼莫地平注射液： 辰欣药业股份有限公司，批号1504262102,丹红注射液：山东丹红制药有限公司，生产批号： 15111011，水合氯醛:上海山浦化工有限公司，批号20140905，TTC:美国Sigma公司。试剂盒： 一氧化氮(NO)，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，考马 斯亮蓝蛋白，（批号：20151211,20151212,2151213,20151210,20151211)，以上测定试剂盒： 均为南京建成生物工程研究所产品。
[0249] 4.2.1.3仪器:UV-1700型紫外可见分光光度计;BS-200S-WEI型电子天平(北京赛 多利斯公司）；FLUKO F6/10-1OG型超细匀浆机(弗鲁克（上海)流体机械制造有限公司），多 功能酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司）,Finnpipette移液器(上海斯丹赛生物技术有 限公司）。
[0250] 4.2.2方法
[0251] 4.2.2.1动物分组及给药
[0252] 待大鼠适应1周饲养后，随机分为8组，即模型组、尼莫地平组、丹红注射液组、亚微 乳高剂量组、亚微乳中剂量组、亚微乳低剂量组、假手术组、空白乳剂组，每组16只。给药:各 组每天给药一次，连续给药7天。模型组和假手术组滴0.1 mL生理盐水，尼莫地平组腹腔注射 按2mL/kg腹腔注射，丹红注射液按0.5mL/kg腹腔注射，亚微乳高剂量组以0.8mL/kg的剂量 滴鼻给药，亚微乳中剂量组以〇. 4mL/kg的剂量滴鼻给药，亚微乳低剂量组以0.2mL/kg的剂 量滴鼻给药。4.2.2.2血管内栓线阻断法建立大鼠局灶型脑缺血模型
[0253] 大鼠用10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉。仰卧固定后，用碘伏消毒，切开腹侧 颈正中线皮肤。分离筋膜和肌肉，分离到气管前肌，沿右侧胸锁乳突肌肌腱向下分离，见到 颈动脉鞘后可上拉钩，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。在CCA远 心端和近心端及ECA处挂线备用。动脉夹夹闭ICA，近心端结扎CCA、ECA。在距CCA分叉部4_ 处剪一小口，将栓线插入到ICA。然后用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。用眼科镊轻推 栓线，这时从血管分叉处开始算距离，当插入深度在18mm时，轻柔地紧紧系牢CCA远心端的 细线。常规缝合伤口。假手术组只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管和导入栓线。2小时后 再灌注。各用药组再灌注后立即给予相应药物，假手术组和模型组给予等容量的生理盐水。
[0254] 4.2.2.3大鼠神经功能缺损评分
[0255] 大鼠脑缺血2小时再灌注3小时后，进行5分制神经功能评分。
[0256] 0分:无明显神经功能缺损症状;1分:提尾时左前肢内收屈曲，不能完全伸展左前 肢，属于轻度局灶性神经功能缺损;2分:爬行时向左侧旋转、划圈，属于中度局灶性神经功 能缺损;3分:站立时向左侧倾斜，属于重度局灶性神经功能缺损;4分:不能自发行走或出于 昏迷状态。
[0257] 4.2.2.4脑梗死率的测定
[0258] 脑梗死率的测定采用红四氮唑(TTC)染色法，于再灌注24小时候断头取脑，去除嗅 球、延髓和小脑，在4°C的生理盐水条件下，去除组织中的脂肪，血丝等杂质，并拭干水分，准 确称取全脑重，于-4 °C冰箱中冷冻24小时左右，间隔2mm连续做5-6个脑冠状切片，加入2% TTC溶液，浸没切片，置于37 °C烘箱中孵育30min，每隔5-10min翻动脑切片，使染色均匀。正 常脑组织被染成红色，梗死脑组织被染成白色。用眼科镊分离苍白区（梗死区）和非苍白区 (正常区），准确称重，计算梗死率（梗死率=苍白区重量八苍白区重量+非苍白区重量） X100%)〇
[0259] 4.2.2.5脑指数的测定
[0260] 大鼠断头取脑准确称重，计算脑指数，脑指数=全脑重量(g)/体重(g)。
[0261] 4.2.2.6大鼠血浆的制备
[0262] 大鼠腹主动脉取血5mL，用可调高速离心机离心（3500r/min)10min，取上清液，置4 °(：冰箱保存备用。
[0263] 4.2.2.7脑组织切片的制备
[0264] 取大鼠全脑放于装有中性福尔马林的小瓶内备用。脑组织切片，以甲醛饱和液和 pH7.4的I3BS缓冲液配制的10 %中性甲醛固定液(体积比为1:9)浸泡8小时，沥干固定液，依 次用70 %、80 %、90 %、95 %和无水乙醇浸泡脱水，沥干，再用二甲苯浸泡半小时，沥干，浸 赔、包埋，然后切片、摊片、烤片，HE染色方法染色、封片、归档。
[0265] 4.2.2.8脑组织病理形态学评分标准
[0266] 表25脑组织形态学评分标准
[0269] 4.2.2.9制剂对大鼠脑组织病理形态学的影响
[0270] 附图14~21是大鼠局灶性脑缺血损伤的脑组织病理学切片，附图14模型组中可以 观察到较多胶质细胞增生和严重组织水肿，其他药物组能观察到少量胶质细胞增生及轻度 组织水肿。
[0271] 4.2.2.10生化指标的测定
[0272] 取大鼠血浆及脑匀浆液，参照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒(S0D、MDA、 谷胱甘肽过氧化物酶，一氧化氮合酶)操作说明操作。
[0273] 4.2.3实验结果
[0274] 4.2.3.1对神经功能的影响
[0275] 表26各组大鼠神经行为学评分（X ±S,n = 6)
[0277] 注:与模型组相比，aP〈0.05; bp〈0.01
[0278] 研究表明：各药物组和阳性对照组的神经功能评分均小于模型组，有显著性差异 (P〈0.01)，说明丹红磷脂复合物亚微乳对缺血再灌注损伤后脑神经功能有保护作用。空白 乳剂组神经行为学评分大于模型组(P>〇. 05)。
[0279] 4.2.3.2 脑梗死率
[0280] 表27各组大鼠脑梗死率(7 ! s,n = 6)
[0282] 注:与模型组相比，ap〈0 · 05; bp〈0 · 01
[0283] 数据显示，丹红注射液组和尼莫地平组的数值较模型组有显著性差异(P〈0.05)， 各药物组的数值虽然没有明显的差异，但是数值明显降低，说明鼻腔给予丹红磷脂复合物 亚微乳制剂对大鼠局灶性脑缺血损伤有一定改善作用，但是效果不显著，空白乳剂组脑梗 死体积比和模型组接近(P>〇. 05)。
[0284] 4.2.3.3对大鼠脑指数的影响
[0285]表28各组大鼠脑指数的影响（? ±S，n = 6)
[0287] 注：与模型组相比，aP〈0 · 05; bP〈0 · 01
[0288] 上述实验结果可以看出，假手术组的脑指数小于模型组，有显著性差异(P〈0.01)， 说明脑缺血再灌注后血脑屏障通透性增加造成脑水肿，造模成功;尼莫地平组和丹红注射 液组脑指数小于模型组，有显著性差异(P〈〇.01)说明尼莫地平和丹红注射液能减轻脑缺血 再灌注后血脑屏障通透性增加；虽然丹红配比组和丹酚酸B组与模型组无显著性差异(P> 0.05)，但是数值小于模型组，说明该制剂对改善大鼠局灶性脑缺血引起的脑水肿有一定改 善作用。
[0289] 4.2.3.4对大鼠脑组织中各生化指标的影响
[0290] 表29大鼠脑组织中S0D、MDA、GSH-PX和NO水平（i 土gn = 6)
[0292] 注:与模型组相比，aP〈0 · 05; bp〈0 · 01
[0293] 从上述实验结果可以看出，假手术组脑组织中的生化指标与模型组相比较均有统 计学意义(P〈〇.05、P〈0.01)，造模成功，阳性对照组脑组织中的生化指标与模型组相比，有 显著差异(P〈0.05、P〈0.01)，说明所选的阳性对照尼莫地平和丹红注射液对以上各生化指 标影响较大。制剂组脑组织中的SOD活性与模型组相比较有显著性差异(P〈0.01)，高剂量制 剂组中的MDA、GSH-PX和NO的水平与模型组相比有显著性差异(P〈0.05、P〈0.01)，中剂量和 低剂量制剂组中的MDA、GSH-PX和NO的水平与模型组相比无显著性差异(P>0.05)，但数值明 显有所改变，说明对MDA、GSH-PX和NO的活性影响不大，空白乳剂组中的各生化指标与模型 组接近，说明空白乳剂对大鼠缺血性脑损伤后脑组织中的S0D、MDA、GSH-PX和NO的活性没有 影响。
[0294] 4.2.3.5对大鼠血清中各生物化学指标的影响
[0295] 表3〇大鼠血清中S0D、MDA、GSH-PX和NO水平(? 土§，η = 6)
[0297] 注:与模型组相比，aP〈0.05; bp〈0.01
[0298] 指标较模型组都有显著性差异(P〈0.05)，说明造模成功。尼莫地平组、丹红注射液 组中S0D、GSH-PX酶水平MDA、N0含量与模型组有显著性差异(？〈0.01，？〈0.05)，各药物组 GSH-PX酶活力较模型组无显著性差异，但是数值均大于模型组，说明各药物组可提升局灶 性脑缺血损伤大鼠血清中GSH-PX酶活力，但无显著效果;高剂量组和中剂量组脑组织中的 SOD、MDA、N0水平较模型组有显著性差异(P〈0.05)，低剂量组脑组织中各生化指标与模型组 相比没有显著性差异(P>〇.05)，但数值有明显变化，空白乳剂组中各生化指标的数值与模 型组数值接近，说明空白乳剂对大鼠缺血性脑损伤或血清中的SOD、MDA、GSH-PX和NO的活性 没有影响。
【附图说明】
[0299] 图1-本发明丹参红花提取物组的大鼠脑组织切片显微图；
[0300] 图2-四种剂型中丹参酚酸B累积透过量对时间的动力学曲线；
[0301] 图3-四种剂型中羟基红花黄色素 A累积透过量对时间的动力学曲线；
[0302]图4-剪切8min的本发明亚微乳制剂显微图（X 400倍）；
[0303]图5-剪切IOmin的本发明亚微乳制剂显微图（X400倍）；
[0304]图6-剪切1211^11的本发明亚微乳制剂显微图（\400倍）；
[0305]图7-转速15000rpm本发明亚微乳制剂剪切的显微图（X400倍）；
[0306]图8转速20000rpm本发明亚微乳制剂剪切的显微图（X400倍）；
[0307]图9-转速25000rpm本发明亚微乳制剂剪切的显微图（X400倍）；
[0308]图10-本发明亚微乳制剂均质前镜检图片（X400倍）；
[0309]图11-本发明亚微乳制剂均质后镜检图片（X400倍）；
[0310]图12-本发明亚微乳制剂粒经测定图；
[0311] 图13-本发明亚微乳制剂Zeta电位测定图；
[0312] 图14-模型组对大鼠脑组织病理形态学的影响（XlO(Hf);
[0313] 图15-尼莫地平组对大鼠脑组织病理形态学的影响（XlO(Hf);
[0314] 图16-丹红注射液组对大鼠脑组织病理形态学的影响（X 100倍）；
[0315] 图17-本发明亚微乳高剂量组对大鼠脑组织病理形态学的影响（XlO(Hf);
[0316] 图18-本发明亚微乳中剂量组对大鼠脑组织病理形态学的影响（XlO(Hf);
[0317] 图19-本发明亚微乳低剂量组对大鼠脑组织病理形态学的影响（XlO(Hf);
[0318]图20-空白乳剂组对大鼠脑组织病理形态学的影响（X 100倍）；
[0319]图21-假手术组对大鼠脑组织病理形态学的影响（X100倍）。
【具体实施方式】
[0320]为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说 明。除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术 语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
[0321] 实施例1
[0322]⑴、丹参提取物的制备方法为：取丹参100g药材，加药材重量10倍量水，于80°C条 件下温浸提取两次，每次浸提时间2h，合并提取液，滤过，滤液于60°C减压浓缩至相对密度 为1.18~1.22的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为70 %，静置12h，取上清液，减压回收乙醇，并 浓缩至稠膏，于真空干燥箱中进行干燥，最终得丹参提取物；
[0323]⑵、红花提取物的制备方法为:取红花100g药材，加药材重量5倍量水，于90 °C条件 下温浸提取2次，每次浸提时间2h，合并提取液，滤过，滤液于60°C减压浓缩至相对密度为 1.18~1.2的清膏，于真空干燥箱中进行干燥，最终得红花提取物。
[0324] 实施例2
[0325] ⑴、丹参提取物的制备方法为:取丹参100g药材，加药材重量8倍量水，于75°C条件 下温浸提取两次，每次浸提时间lh，合并提取液，滤过，滤液于65°C减压浓缩至相对密度为 1.18~1.22的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为65 %，静置14h，取上清液，减压回收乙醇，并浓 缩至稠膏，于真空干燥箱中进行干燥，最终得丹参提取物；
[0326]⑵、红花提取物的制备方法为：取红花50g药材，加药材重量7倍量水，于85 °C条件 下温浸提取2次，每次浸提时间Ih，合并提取液，滤过，滤液于55 °C减压浓缩至相对密度为 1.18~1.2的清膏，于真空干燥箱中进行干燥，最终得红花提取物。
[0327] 实施例3
[0328]⑴、丹参提取物的制备方法为:取丹参50g药材，加药材重量12倍量水，于85°C条件 下温浸提取两次，每次浸提时间3h，合并提取液，滤过，滤液于65 °C减压浓缩至相对密度为 1.18~1.22的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为75 %，静置IOh，取上清液，减压回收乙醇，并浓 缩至稠膏，于真空干燥箱中进行干燥，最终得丹参提取物；
[0329]⑵、红花提取物的制备方法为:取红花100g药材，加药材重量3倍量水，于95 °C条件 下温浸提取2次，每次浸提时间3h，合并提取液，滤过，滤液于65°C减压浓缩至相对密度为 1.18~1.2的清膏，于真空干燥箱中进行干燥，最终得红花提取物。
[0330] 实施例4
[0331] ⑴、取甘油10g、泊洛沙姆-188，10g、EDTA-Na2 0.06g，分散于注射用水中，加热至 55 °C，搅拌至全部溶解，制得水相；
[0332]⑵、分别称取丹参提取物6.67g和红花提取物6.67g，再称取大豆卵磷脂26.67g，将 三者置于磁力搅拌器中，加入甲醇，在55°C的水浴复合反应2小时，回收甲醇至剩余20%体 积，制得丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液；
[0333] ⑶、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油80g、中链甘 油三酯170g，继续回收至无甲醇味，再加入VElg、油酸lg、乳化磷脂15g，在高速组织捣碎机 转速为20000rpm搅拌下，再将上述步骤⑴水相，搅拌10分钟，制得初乳；用蒸馏水将初乳稀 释定容至处方量，转移至高压均质机中，均质压力为lOOOpar，均质时间是9次，均质温度控 制在40°C，用0. lmol/L的氢氧化钠调节pH值至5，即得。
[0334] 实施例5
[0335] ⑴、取甘油13g、泊洛沙姆-188,7g、EDTA_Na2 O.lg，分散于注射用水中，加热至50 °C，搅拌至全部溶解，制得水相；
[0336]⑵、分别称取丹参提取物16.67g、红花提取物8.33g，再称取大豆卵磷脂25g，将三 者置于磁力搅拌器中，加入甲醇，在50°C的水浴复合反应3小时，回收甲醇至剩余20%体积， 制得丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液；
[0337] ⑶、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油90g、中链甘 油三酯180g，继续回收至无甲醇味，再加入VE 0.5g、油酸2g、乳化磷脂20g，在高速组织捣碎 机转速为15000rpm搅拌下，再将上述步骤⑴水相，搅拌12分钟，制得初乳；用蒸馏水将初乳 稀释定容至处方量，转移至高压均质机中，均质压力为1200par，均质时间是6次，均质温度 控制在30°C，用磷酸氢二钠调节pH值至6，即得。
[0338] 实施例6
[0339] ⑴、取甘油7g、泊洛沙姆-188，13g，EDTA-Na2 0.03g，分散于注射用水中，加热至60 °C，搅拌至全部溶解，制得水相；
[0340]⑵、分别称取丹参提取物2g和红花提取物4g，再称取大豆卵磷脂24g，将三者置于 磁力搅拌器中，加入甲醇，在60°C的水浴复合反应1小时，回收甲醇至剩余20%体积，制得丹 参、红花提取物磷脂复合物甲醇液；
[0341] ⑶、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油70g、中链甘 油三酯160g，继续回收至无甲醇味，再加入VE 2g、油酸0.5g、乳化磷脂IOg，在高速组织捣碎 机转速为25000rpm搅拌下，再将上述步骤⑴水相，搅拌8分钟，制得初乳；用蒸馏水将初乳稀 释定容至处方量，转移至高压均质机中，均质压力为SOOpar，均质时间是11次，均质温度控 制在50°C，用碳酸氢钠调节pH值至4，即得。
[0342] 实施例7
[0343] ⑴、取甘油9g、泊洛沙姆-188,9g、EDTA-Na2 0.05g，分散于注射用水中，加热至50 ~60°C，搅拌至全部溶解，制得水相；
[0344]⑵、分别称取丹参提取物8g、红花提取物12g，再称取大豆卵磷脂20g，将三者置于 磁力搅拌器中，加入甲醇，在55°C的水浴复合反应1.5小时，回收甲醇至剩余20%体积，制得 丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液；
[0345] ⑶、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油85g、中链甘 油三酯165g，继续回收至无甲醇味，再加入VE 0.8g、油酸1.5g、乳化磷脂12g，在高速组织捣 碎机转速为22000rpm搅拌下，再将上述步骤⑴水相，搅拌9分钟，制得初乳;用蒸馏水将初乳 稀释定容至处方量，转移至高压均质机中，均质压力为900par，均质时间是8次，均质温度控 制在35°C，用碱调节pH值至5，即得。
[0346] 实施例8
[0347] ⑴、取甘油llg、泊洛沙姆-188，llg、EDTA_Na2 0.08g，分散于注射用水中，加热至 50~60°C，搅拌至全部溶解，制得水相；
[0348]⑵、分别称取丹参提取物8g，红花提取物12g，再称取大豆卵磷脂20g，将三者置于 磁力搅拌器中，加入甲醇，在60°C的水浴复合反应2.5小时，回收甲醇至剩余20%体积，制 得丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液；
[0349] ⑶、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油75g、中链甘 油三酯175g，继续回收至无甲醇味，再加入VE 1.5g、油酸0.8g、乳化磷脂18g，在高速组织捣 碎机转速为17000rpm搅拌下，再将上述步骤⑴水相，搅拌10分钟，制得初乳；用蒸馏水将初 乳稀释定容至处方量，转移至高压均质机中，均质压力为800~1200par，均质时间是6~11 次，均质温度控制在30~50°C，用碱调节pH值至4~6，即得。
[0350] 根据上述的实施例对本发明作了详细的描述。需要说明的是，以上的实施例仅仅 是为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可 以设计出本发明的多种替换方式和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述组合物中活性组分的重量份 配比如下:丹参提取物0.5~2份、红花提取物0.5~2份。2. 如权利要求1所述治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述组合物中活性组分的 重量份配比如下:丹参提取物1份、红花提取物1份。3. 如权利要求2所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述组合物中活性组分 的制备方法如下： ⑴、丹参提取物的制备方法是:取丹参药材，加水浸渍提取，提取液用醇沉法精制除杂， 再经浓缩、干燥处理后，即得； ⑵、红花提取物的制备方法为：取红花药材，加水浸渍提取，提取液再浓缩、干燥处理 后，即得。4. 如权利要求3所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述组合物中活性组分 的制备方法如下： ⑴、丹参提取物的制备方法为:取丹参药材，加药材重量8~12倍量水，于75~85°C条件 下温浸提取两次，每次浸提时间1~3h，合并提取液，滤过，滤液于55~65°C减压浓缩至相对 密度为1.18~1.22的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为65~75%，静置10~14h，取上清液，回 收乙醇、浓缩、干燥，得丹参提取物； ⑵、红花提取物的制备方法为:取红花药材，加药材重量3~7倍量水，于85~95 °C条件 下温浸提取2次，每次浸提时间1~3h，合并提取液，滤过，滤液浓缩、干燥，得红花提取物。5. 如权利要求4所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述组合物中活性组分 的制备方法如下： ⑴、丹参提取物的制备方法为：取丹参药材，加药材重量10倍量水，于80°C条件下温浸 提取两次，每次浸提时间2h，合并提取液，滤过，滤液于60°C减压浓缩至相对密度为1.18~ 1.22的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为70 %，静置12h，取上清液，回收乙醇、浓缩、干燥，得丹 参提取物； ⑵、红花提取物的制备方法为:取红花药材，加药材重量5倍量水，于90°C条件下温浸提 取2次，每次浸提时间Ih，合并提取液，滤过，滤液浓缩、干燥，得红花提取物。6. 如权利要求1-5任一所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述活性组分是 以丹参、红花两种提取物，加入药用辅料制成的磷脂复合物为活性载体。7. 如权利要求6所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，该组合物按如下重量份 配比的原料组成:丹参、红花提取物磷脂复合物30~50份、油相230~270份、乳化剂10~20 份、助乳化剂7~13份、等渗调节剂7~13份、稳定剂0.5~2份、抗氧剂0.5~2份、金属离子络 合剂0~0.1份。8. 如权利要求7所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述油相为大豆油、中 链甘油三酯，所述乳化剂为乳化磷脂，所述助乳化剂为泊洛沙姆-188,所述等渗调节剂为甘 油，所述稳定剂为油酸，所述抗氧剂为VE，所述金属离子络合剂为EDTA-Na2。9. 如权利要求8所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，该组合物按如下重量份 配比的原料组成:丹参、红花提取物磷脂复合物30~50份、大豆油70~90份、中链甘油三酯 160~180份、乳化磷脂10~20份、泊洛沙姆-188 7~13份、甘油7~13份、油酸0.5~2份、VE 0.5~2份、EDTA-Na2 0.03~0.1 份。10. 如权利要求9所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，该组合物按如下重量 份配比的原料组成:丹参、红花提取物磷脂复合物50份、大豆油90份、中链甘油三酯180份、 乳化磷脂20份、泊洛沙姆-188 7份、甘油13份、油酸2份、VE 0.5份、EDTA-Na2 0.1份。11. 如权利要求9所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，该组合物按如下重量 份配比的原料组成:丹参、红花提取物磷脂复合物30份、大豆油70份、中链甘油三酯160份、 乳化磷脂10份、泊洛沙姆-188 13份、甘油7份、油酸0.5份、VE 2份、EDTA-Na2 0.03份。12. 如权利要求9所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，该组合物按如下重量 份配比的原料组成:丹参、红花提取物磷脂复合物40份、大豆油80份、中链甘油三酯170份、 乳化磷脂15份、泊洛沙姆-188 10份、甘油10份、油酸1份、VE 1份、EDTA-Na2 0.06份。13. 如权利要求7-12任一所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述药物组合 物的剂型为:亚微乳制剂。14. 如权利要求13所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述亚微乳制剂的制 备方法如下： ⑴、取甘油、泊洛沙姆-188、EDTA-Na2分散于注射用水中，加热至50~60°C，搅拌至全部 溶解，制得水相； ⑵、分别称取丹参提取物和红花提取物，再称取大豆卵磷脂，将三者置于磁力搅拌器 中，加入甲醇，在50~60°C的水浴复合反应1~3小时，回收甲醇，制得丹参、红花提取物磷脂 复合物甲醇液； (3)、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油、中链甘油三酯， 继续回收至无甲醇味，再加入Ve、油酸、乳化磷脂，在高速组织捣碎机转速为15000~ 25000rpm搅拌下，再将上述步骤⑴水相，搅拌8~12分钟，制得初乳;用蒸馏水将初乳稀释定 容至处方量，转移至高压均质机中，均质压力为800~1200par，均质时间是6~11次，均质温 度控制在30~50°C，用碱调节pH值至4~6，即得。15. 如权利要求14所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述亚微乳制剂的制 备方法如下： ⑴、取甘油、泊洛沙姆-188、EDTA-Na2分散于注射用水中，加热至55°C，搅拌至全部溶解， 制得水相； ⑵、分别称取丹参提取物和红花提取物，再称取大豆卵磷脂，将三者置于磁力搅拌器 中，加入甲醇，在55°C的水浴复合反应2小时，回收甲醇至剩余20%体积，制得丹参、红花提 取物磷脂复合物甲醇液； (3)、向步骤(2)中的丹参、红花提取物磷脂复合物甲醇液中加入大豆油、中链甘油三酯， 继续回收至无甲醇味，再加入Ve、油酸、乳化磷脂，在高速组织捣碎机转速为20000rpm搅拌 下，再将上述步骤⑴水相，搅拌10分钟，制得初乳；用蒸馏水将初乳稀释定容至处方量，转移 至高压均质机中，均质压力为1000 par，均质时间是9次，均质温度控制在40°C，用碱调节pH 值至4~6,即得。16. 如权利要求14或15所述的治疗脑缺血的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物 给药途径为鼻腔喷雾方式给药。
【文档编号】A61P9/10GK105943606SQ201610574938
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】史亚军, 张小飞, 郭东艳, 邓翀, 崔春利, 邹俊波
【申请人】陕西中医药大学