制备人造微环境的方法及其应用
【专利摘要】本发明涉及制备人造微环境的方法及其应用，具体地，所述方法包括：(1)将功能细胞接种在固相载体上；(2)将步骤(1)所获得的固相载体在适于所述功能细胞生长的条件下保持预定时间；以及(3)将步骤(2)所获得的固相载体进行脱细胞化处理，以便获得所述人造微环境。利用本发明所提供的方法，可以制备获得具备低免疫原性，良好的可控性，质量稳定，生产周期短和成分可调控特点并可实现定制化的人造微环境。
【专利说明】
制备人造微环境的方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物医学工程领域，具体地，本发明涉及制备人造微环境的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]再生医学的发展为应对药物治疗难于见效的复杂重大疾病带来了新的希望，逐渐成为临床医学发展的重要方向，有望成为继药物和器械治疗之后下一个医疗健康行业的支柱产业。目前，再生医学已在临床成功地用于皮肤再生，关节软骨重建，肌腱、脊髓损伤修复，免疫系统功能重建等，并在治疗疑难病症(如遗传性疾病和心血管类疾病)和各类器官组织(如神经、肝脏、心脏、胰腺等)修复和再生的动物模型和临床试验中显示出良好效果。
[0003]再生医学领域中，构建人体复杂器官的结构与功能替代物、解决人体器官移植的来源问题、或以组织工程手段修复受损组织器官是人们最早也是最终的梦想。在器官的修复与移植来源供不应求的今天，人工器官替代物有着临床应用的巨大需求，而已经批准进行临床治疗的人工替代物的种类还十分有限，主要集中在皮肤、角膜、软骨等结构与功能还较为简单的器官上，其构建的基本思路可大致分为两种:人工合成替代材料与天然组织的脱细胞化基质材料。
[0004]然而，目前人工合成替代材料与天然组织的脱细胞化基质材料仍有待改进。
【发明内容】
[0005]发明人发现人工合成替代材料与天然组织的脱细胞化基质材料存在以下缺陷:
[0006]1、人工合成替代材料。生物材料一直是组织工程与再生医学中的核心因素，利用一些人工高分子材料或天然高分子材料作为原料来构建人工替代物，以用于临时替代受损器官的功能并帮助其修复，这是目前常见的人工手段。例如皮肤的人工替代物常制成双层结构模拟真实皮肤的表皮与真皮的结构与功能。但单独的材料用于治疗时，由于其结构与成分与天然皮肤有较大区别，其治疗效果受到明显的局限。参考细胞的加入对于许多疾病治疗而言有着明显的促进作用，将细胞与材料结合并用于治疗则会表现出明显改善的治疗效用，但这也带来了许多不便利:细胞的加入带来的可能问题有自体细胞难以扩增和培养，或是异体细胞引起免疫反应。此外，细胞产品的保存运输问题、产品质量问题、可能存在不良副作用的问题等都制约了其在临床治疗上的应用。
[0007]2、天然组织脱细胞化基质材料。鉴于细胞产品在临床治疗上难以实际运用，而相对的，人们日益发现细胞微环境在治疗过程中起到重要作用。利用细胞的微环境来进行治疗而不是引入活性细胞成为了一种新的思路。通过脱细胞化技术将组织中的细胞成分尤其是细胞膜与附着的抗原蛋白除去从而避免了细胞可能带来的免疫排斥反应；同时，脱细胞化保留了组织中的细胞外基质、细胞因子等成分，更好的模拟了细胞生长的正常微环境从而同样可以发挥治疗效果。所以，相较于带细胞的治疗产品而言，脱细胞化治疗产品由于没有细胞成分且从正常组织中得到使其具有保存与运输更为方便的特点。但相较于人工合成材料而言，虽然脱细胞化材料具有更接近体内微环境的成分与结构带来了更好的疗效，但是直接通过组织脱细胞化获得的基质材料其来源受到限制，例如脱细胞化的皮肤修复产品往往是通过对尸体的皮肤或是异种例如猪的皮肤处理后得到，且异体来源组织存在病人等待周期长，伦理问题等，异种来源组织最大的问题则是存在免疫周期。此外其质量难以稳定、材料的物理特性难以保持使其仍具有一定的使用限制。
[0008]总体而言，目前针对器官替代修复的产品都基本采取以上的两种治疗策略，能够解决一部分临床对组织替代物的需求，但是仍然存在一系列的问题，特别是对于使用便携性和治疗效果的稳定性的追求仍在继续。而人工合成替代材料与天然组织脱细胞化基质材料之间则有着矛盾与平衡取舍的关系，来源与稳定性是人工合成替代材料的优势，而天然组织脱细胞化基质材料则有着更好的治疗效果。如何平衡这两个问题，或者结合两者的优点是将人工组织修复水平进一步提高的关键。
[0009]本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0010]本发明是发明人基于以下发现所获得的:
[0011]基于多孔生物材料和组织工程为基础，辅助以脱细胞化技术，构建了基于仿生人造组织的脱细胞化人工微环境。这种新型的仿生微环境基于生物材料骨架从而具有稳定的内部结构，在使用过程中具有良好的机械性能及良好的可塑性，使其应用便捷且可根据实际需求调整尺寸等。在力学性质日益受到重视时，稳定的物理性对治疗效果的影响变得越发重要。其次，辅以细胞培养与脱细胞化操作，使其在普通生物材料基础上集成了大量细胞分泌的细胞外基质成分与细胞因子等，从而构建了一个更接近体内天然内环境的人工微环境，能够提高治疗效果。由此，本发明提供了一种具备低免疫原性，良好的可控性，质量稳定，生产周期短和成分可调控特点并可实现定制化的新型脱细胞化人造微环境(仿生微环境治疗物)，为创伤修复，组织器官修复等再生医学治疗提供一种新思路。
[0012]根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备人造微环境的方法，包括:
[0013](I)将功能细胞接种在固相载体上；
[0014](2)将步骤(I)所获得的固相载体在适于所述功能细胞生长的条件下保持预定时间；以及
[0015](3)将步骤(2)所获得的固相载体进行脱细胞化处理，以便获得所述人造微环境。本发明所提供的方法具有以下优势:(I)采用所述方法制备获得的人造微环境使用时无细胞，具有低免疫原性的特点；(2)使用独特的组织工程细胞培养技术及脱细胞化处理技术，可以很好的解决目前现有主流产品面临的免疫原性、生命伦理、生物相容性等问题，同时保留细胞外基质生物活性成分，实现创伤的有效修复；(3)采用所述方法制备获得的人造微环境(脱细胞化仿生微环境)方便长期贮存和运输；(4)采用所述方法制备获得的人造微环境(脱细胞化仿生微环境)具有良好的可控性，避免了因来源不同所导致的质量不稳定，批次间差异性较大等问题；(5)采用所述方法制备获得的人造微环境(脱细胞化微环境)可根据患者需求进行定制化处理，产品生产周期可控，满足临床需求。
[0016]根据本发明的一些实施例，所述功能细胞包括选自动物干细胞、体细胞和癌细胞的至少之一。
[0017]根据本发明的一些实施例，所述动物为哺乳动物，优选为人；
[0018]根据本发明的具体实施例，所述干细胞选自下列至少之一:胚胎干细胞，多潜能干细胞，脂肪干细胞、骨髓干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞、角膜干细胞、皮肤干细胞、上皮干细胞；
[0019]根据本发明的具体实施例，所述体细胞选自下列至少之一:成纤维细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、心肌细胞；
[0020]根据本发明的具体实施例，所述癌细胞为原代癌细胞和/或癌细胞系。
[0021 ]根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括:对所述功能细胞进行-处理，其中还，所述处理包括基因修饰和/或生物化学因子诱导方式。由此可以对所述功能细胞进行体外改造，从而满足不同的实际应用的需要。由此，可以通过细胞基因修饰和/或生物化学因子诱导方式来修饰细胞和改变细胞脱细胞化微环境的有效成分以达到多样化、定制化的要求。
[0022]根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括:对所述功能细胞进行调控式培养，其中，可以通过调控培养的培养时间、培养基、添加物和氧气含量中的至少一种，从而来调控所述功能细胞的多样性。由此，可以通过细胞培养条件来修饰细胞和改变细胞脱细胞化微环境的有效成分以达到多样化、定制化的要求。
[0023]根据本发明的一些实施例，所述接种是将单细胞悬浮液滴加至所述固相载体上而进行的，其中，所述单细胞悬浮液含有所述功能细胞。
[0024]根据本发明的一些实施例，所述单细胞悬浮液是通过将所述功能细胞进行胰酶处理而得到的。
[0025]根据本发明的一些实施例，所述单细胞悬浮液的浓度为lX105/mL-lX107/mL。
[0026]根据本发明的具体实施例，所述单细胞悬浮液的浓度为lX106/mL。
[0027]根据本发明的一些实施例，所述步骤(I)包括:
[0028](1-1)将单细胞悬浮液滴加到所述固相载体上；
[0029](1-2)将步骤(1-1)所获得的固相载体在二氧化碳培养箱中静置2小时。由此，可以使得功能细胞粘附到固相载体上。
[0030]根据本发明的一些实施例，所述固相载体由可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料所构成。由此，固相载体的材料来源不受限；生产周期短；固相载体所采用的材料可以是人工材料及天然材料的结合，从而可以诱导细胞再生;并且可以通过调控固相载体所采用的材料的物理性质(如硬度等)或化学修饰从而满足不同的需求。
[0031]根据本发明的具体实施例，所述可交联的人工合成生物材料选自下列至少之一:聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯；
[0032]根据本发明的具体实施例，所述可交联的天然生物材料选自下列至少之一:明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白。
[0033]根据本发明的一些实施例，所述固相载体通过交联法制备获得，所述交联法选自下列至少之一:化学交联法、物理交联法、辐射交联法、酶催化交联法。其中，需要说明的是，所述交联法的选择基于所述固相载体所采用的生物材料。
[0034]根据本发明的具体实施例，采用化学交联法制备获得所述固相载体。
[0035]根据本发明的一个实施例，采用化学交联法与冷冻干燥法相结合的方法来制备获得所述固相载体，所述化学交联法与冷冻干燥法相结合的方法包括以下的步骤:
[0036]Al)将天然鱼皮提取明胶溶解在水中，置于冰上冷却，再加入一定量的戊二醛，得到预聚物溶液A;
[0037]A2)将步骤Al中得到的预聚物A加入到合适大小的模具中，并置于-20°C中发生化学交联反应；
[0038]A3)A2的操作20h后，将模具置于室温中，适当清洗后在_60°C环境中冷冻干燥适当的时间得到干燥的三维多孔细胞支架骨架。
[0039]在上述的方法中，所述的预聚物溶液A中的天然鱼皮提取明胶的含量可为每10ml所述的预聚物A中含有l_30g天然鱼皮提取明胶;所述的戊二醛在所述的预聚物A中的含量体积分数可为0.01 % -1.00 %。
[0040]根据本发明的一些实施例，所述固相载体为三维多孔支架。
[0041]根据本发明的具体实施例，所述三维多孔支架的孔径为1-999μπι，孔间距为1_999μm，孔隙率参数为50%-99.9%。
[0042]根据本发明的具体实施例，所述三维多孔支架的体积为0.lym3-100cm3。
[0043]根据本发明的具体实施例，所述三维多孔支架呈片状，球状或多角状。其中，需要说明的是，所述三维多孔支架的形状不受特别限制，可以根据实际情况进行调整。
[0044]根据本发明的具体实施例，采用制孔技术制备获得所述三维多孔支架中的孔，所述制孔技术选自下列至少之一:致孔剂(porogen)滤除法、相分离法、乳液冷冻干燥法、溶剂蒸发法、气体泡沫法、纤维粘合法等。
[0045]根据本发明的一些实施例，所述三维多孔支架可以通过模具制备获得。发明人根据所述三维多孔支架的形状，对模具进行加工处理，以便获得所述三维多孔支架。
[0046]根据本发明的具体实施例，所述模具加工处理方法为下述至少一种:激光刻蚀(laser cutting);机械钻孔(mechanical drilling);影印石版术(photolithography)、微接触打印技术(microcontact printing)、微流体图案技术(microf luidic patterning)、层流图案技术(laminar flow patterning)、模版图案技术(stencil patterning)、压印光刻技术(Imprint lithography)、流体光刻技术(flow lithography) ο
[0047]根据本发明的一些实施例，所述脱细胞化处理是采用化学方式的方法和/或物理方式的方法。
[0048]根据本发明的具体实施例，所述化学方式的方法所采用的试剂选自下列至少之一:酸性溶液，碱性溶液，高渗溶液，低渗溶液，离子洗涤剂，非离子洗涤剂，两性离子洗涤剂，醇类，丙酮，磷酸三丁酯，酶类，螯合剂。
[0049]根据本发明的具体实施例，所述酸性溶液为乙酸和/或过氧乙酸。
[0050]根据本发明的具体实施例，所述碱性溶液选自氢氧化钙，硫化钠和氢氧化钠中至少一种。
[0051 ] 根据本发明的具体实施例，所述离子洗涤剂选自SDS，SDC和Triton X-200中至少一种。
[0052]根据本发明的具体实施例，所述非离子洗涤剂为TritonX-100。
[0053]根据本发明的具体实施例，所述两性离子洗涤剂选自CHAPS，硫代甜菜碱10，SB-10和SB-16中至少一种。
[0054]根据本发明的具体实施例，所述酶类选自核酸酶，胰酶和中性蛋白酶中至少一种。
[0055]根据本发明的具体实施例，所述螯合剂为EDTA和/或EGTA。
[0056]根据本发明的具体实施例，所述物理方式的方法选自下列至少之一:反复冻融，压力，气压，渗透作用，电激法，灌流，搅动和超临界流体。
[0057]根据本发明再一个方面，本发明提出一种人造微环境，所述人造微环境是通过前面所述方法制备获得的。本发明制备获得的人造微环境具有以下优势:(I)使用时无细胞，具有低免疫原性的特点；(2)可以很好的解决目前现有主流产品面临的免疫原性、生命伦理、生物相容性等问题，同时保留细胞外基质生物活性成分，实现创伤的有效修复；(3)便于长期贮存和运输；(4)具有良好的可控性，避免了因来源不同所导致的质量不稳定，批次间差异性较大等问题；(5)可根据患者需求进行定制化处理，产品生产周期可控，满足临床需求；(6)应用领域广泛，包括但不限于:分子/材料/细胞的芯片用于研究细胞治疗分子/细胞、材料/细胞、细胞/细胞相互作用;体外模型构建;细胞治疗;组织工程;再生医学;化妆品工业;病理研究;临床诊断治疗等等。
[0058]本发明具有以下优势:
[0059]I)使用人工支架材料诱导细胞再生(是人工材料及天然材料的结合)，材料来源不受限，生产周期短；
[0060]2)可以通过生物材料支架的调控控制材料的物理性质如硬度等，并可修饰不同化学成分以满足不同需求；
[0061]2)可以通过对细胞培养、细胞基因的调控来修饰细胞和改变脱细胞化微环境的有效成分以达到多样化、定制化的要求；
[0062]3)使用时无细胞，具有低免疫原性的特点；
[0063]4)使用独特的组织工程细胞培养技术及脱细胞化处理技术，可以很好的解决目前现有主流产品面临的免疫原性、生命伦理、生物相容性等问题，同时保留细胞外基质生物活性成分，实现创伤的有效修复；
[0064]5)所述脱细胞化仿生微环境方便长期贮存和运输；
[0065]6)所述脱细胞化仿生微环境具有良好的可控性，避免了因来源不同所导致的质量不稳定，批次间差异性较大等问题；
[0066]7)所述脱细胞化微环境可根据患者需求进行定制化处理，产品生产周期可控，满足临床需求。
【附图说明】
[0067]图1是根据本发明的一个实施例制备人造微环境的方法流程示意图。
[0068]图2(A)是根据本发明的实施例1制备人造微环境的模具结构示意图。
[0069]图2(B)是根据本发明的实施例1制备人造微环境的高通量模具结构示意图。
[0070]图3(A)是根据本发明的实施例1制备获得的三维多孔支架结构示意图。
[0071]图3(B)是根据本发明的实施例1制备获得的三维多孔支架阵列结构示意图。
[0072]图3(C)是根据本发明的实施例1制备获得的三维多孔支架扫描电子显微镜结构示意图(200X)。
[0073]图3(D)是根据本发明的实施例1制备获得的三维多孔支架扫描电子显微镜结构示意图(100X)0
[0074]图4(A)是根据本发明的实施例2制备获得的人造微环境在脱细胞前，细胞存活状态示意图。
[0075]图4(B)是根据本发明的实施例4制备获得的人造微环境中残留细胞的DNA染色图。
[0076]图4(C)是根据本发明的实施例4制备获得的人造微环境扫描电子显微镜结构示意图。
[0077]图4(D)是根据本发明的实施例4收集制备获得的人造微环境中的蛋白进行电泳的蛋白谱图示意图。
[0078]图4(E)是根据本发明的实施例4制备获得的人造微环境培养3T3细胞的存活状态示意图。
[0079]图5是根据本发明的实施例5，采用本发明制备获得人造微环境进行小鼠皮肤修复实验的结果示意图。
【具体实施方式】
[0080]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0081 ] 实施例
[0082]实施例1、利用化学成胶与冷冻干燥法制备三维多孔支架与高通量支架平台
[0083]一、制备三维多孔细胞支架骨架
[0084]1、激光雕刻制备所需的模具
[0085]采用Ray jet激光雕刻机切割厚度分别为0.3mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、3mm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)平板(两面均附着有隔离膜)形成模具组件。模具组件设计由软件AutoCAD完成，可根据需要设计成不同形状不同大小，如圆形模具中我们使用外径为5cm内径为2.5cm的圆环来实现浇注材料的圆形结构;通过改变内环形状可制成方形、三角形等多种其他形状模具组件。激光雕刻机的主要加工参数为:切割能量100%，切割次数2，切割线速度10%。得到模具组件后将其紧密贴合在载玻片上得到所需的完整模具，如图2(A)所示，其中图2(A)为正常使用大小的模具，其中心形状可随意调整。
[0086]在构建微型化高通量的脱细胞化仿生微环境时需要制备高通量的模具板:采用Ray jet激光雕刻机切割厚度分别为0.3mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、3mm的聚甲基丙稀酸甲酯(PMMA)平板形成模具。模具设计由软件AutoCAD完成:模具长75mm，宽25mm，其中均匀分布有6X16个直径为Imm的小孔作为细胞支架的支撑处，每个微孔大小相同。激光雕刻机的主要加工参数为:切割能量100%，切割次数2，切割线速度10%。得到的即为完整模具，如图2(B)所示，其中图2(B)为特制的高通量的模具板，可在一片模具板上同时制备6X16个微型化的支架。
[0087]2、配制成胶反应溶液
[0088]本实施例中制备细胞支架所用到生物材料为鱼皮提取的明胶材料。配制成胶溶液时，先使用去离子水配制好浓度为10%(w/v)的明胶溶液，在60°C环境中充分溶解并在使用前进行一定冷却。本实例中使用的化学交联剂为戊二醛，戊二醛在成胶溶液中最终的浓度为0.0l %-ι %。配制成胶溶液时将明胶溶液与交联剂按上述浓度进行均匀混合并置于冰上得到反应溶液。
[0089]3、冷冻成胶与冷冻干燥得到三维多孔支架
[0090]准备好激光雕刻制备的模具并置于冰上预冷，根据模具的厚度与底面积计算其所需成胶溶液的体积。将混合好的反应溶液按计算得到的体积取一定量并迅速置于模具中，此时反应溶液液面应与模具上表面平齐。将充满反应溶液的模具迅速置于_20°C环境中静置，进行成胶反应，20小时后取出置于室温时冰晶融化，将材料从模具中取出并进行适当的清洗，清洗后的材料在-60摄氏度下冷冻干燥2小时得到支架骨架，如图3(A)所示，其中，图3(A)为形状方形的脱细胞化人工微环境，。
[0091]在构建微型化高通量的脱细胞化仿生微环境时，将高通量的模具板先置于等离子表面处理机中进行清洗，是成胶溶液能较便利的充满小孔。将混合好的反应溶液置于冰上，将高通量的模具板浸没与成胶溶液中进行稍许震荡。取出模具板并在特定的支撑架上悬空放置;将模具板随即置于-20°C环境中静置，20小时后取出置于室温融化，将模具板整体进行清洗，清洗后的模具板整体进行放入冷冻干燥机中在-60°C的环境中冷冻干燥I小时，去除两面的隔离膜后即得到微型化的支架骨架阵列，如图3(B)所示，其中，图3(B)为微型化高通量的脱细胞化人工微环境阵列。
[0092]4、电镜观察所得三维多孔支架
[0093]将冷冻干燥后的三维多孔支架进行电镜观察，可见支架内孔连通较好，如图3(C)和图3 (D)所示，其中，图3 (C)为SEM(200X)下的脱细胞化人工微环境材料的表面结构，图3(D)为SEM( 1000X)下的脱细胞化人工微环境材料的表面结构。
[0094]实施例2、功能细胞自动装载到三维多孔细胞支架形成仿生人造组织
[0095]本发明所述三维多孔细胞支架具有良好的机械性能，且有很好的吸水性，因而细胞可以通过滴加的方式直接被吸附到支架内。本实施例以间充质干细胞为例进行说明。
[0096]1、按照实施例1和制备明胶三维多孔支架。
[0097]2、将冷冻干燥后的三维多孔支架紫外灭菌。
[0098]3、细胞用胰酶处理，配置成一定浓度的细胞单细胞悬液。吸取细胞悬液直接滴加到三维多孔支架表面，数秒后可见细胞悬液全部被吸收。二氧化碳孵箱内等待2小时以使细胞粘附到三维多孔支架上。
[0099]4、培养3天后，live/dead染色观察，如图4(A)所示，可见细胞生长状况良好。
[0100]实施例3、通过高通量支架平台得到游离仿生微组织
[0101]1、制备特制顶板
[0102]特制顶板选用聚二甲基硅氧烷(PDMS)，通过软蚀刻技术制作而成。以与高通量支架平台对应特制顶板为例进行制备:将PDMS按照主剂与硬化剂以质量比10:1比例混合均匀。将实施例1中制备的高通量的模具板放于已事先做好的深度为2_3mm的PDMS凹槽内。将混合好无气泡的PDMS混合液倒入模具，并保证模具表面有一定厚度的PDMS存在;然后在表面放置好一张载玻片，之后抽真空至模具小孔内及模具与玻璃之间无气泡存在。
[0103]2、获得游离三维多孔微支架
[0104]获得制备好的微型化支架阵列后，利用获得的特制顶板将分布于各小孔中的微型化三维细胞支架取出并置于漏斗中进行富集，通过实施例1中相同的清洗与冷冻干燥步骤得到游离的三维多孔微支架
[0105]3、获得游离的仿生微组织
[0106]利用得到的游离的三维多孔微支架，通过实施例2中相同的吸取细胞的步骤可使细胞粘附到三维多孔微支架内并生长，培养三天后，可得到游离的仿生微组织。
[0107]实施例4、脱细胞化技术得到脱细胞化仿生微环境
[0108]本实施例将实施例2和实施例3中的得到的仿生微组织分别进行脱细胞化处理得到仿生微环境。本实施例脱细胞技术以化学方式为例进行说明。
[0109]1、细胞在三维多孔支架内培养三天后，弃去培养基，PBS清洗三遍。
[0110]2、用离子洗涤剂之一 SDC清洗2小时，以完全去除细胞。
[0111]3、DNA酶和RNA酶清洗2小时，完全清洗DNA及RNA。
[0112]4、最后用PBS清洗2小时，之后冷冻干燥。所得脱细胞化微环境可在_20°C保存数周或更长时间。
[0113]5、通过电镜观察可见所得脱细胞化微环境仍保留有很好的三维结构，westernblot检测可说明含有大量天然细胞外基质成分和细胞因子等，如图4(C)和图4(D)所示，其中，图4(C)脱细胞化后SEM观察可见支架内蛋白的残留和图4(D)收集支架内蛋白样品电泳后银染可见多种蛋白条带的存在，正是完整保留的天然细胞微环境有利于其后续发挥治疗作用。此外，DNA染色可见无明显可见的DNA残留，如图4(B)所示，其中，图4(B)脱细胞化后DAPI检测未见DNA残留，证明细胞去除干净，避免免疫原性的产生。
[0114]6、为了验证所得脱细胞化微环境具有很好生物活性，我们将3T3细胞种植到脱细胞化微环境内，可见细胞生长良好，如图4(E)所示，证明其具有很好的生物相容性。
[0115]实施例5、小鼠的全层皮肤损伤模型的构建与其辅助修复
[0116]1、激光雕刻制备小鼠皮肤支撑体
[0117]采用Ray jet激光雕刻机切割厚度分别为1mm、1.5mm、2mm、3mm的聚甲基丙稀酸甲酯(PMMA)平板形成模具。模具设计由软件AutoCAD完成:模具首先是一个外径1.6cm，内径
0.8cm的圆环，其次在圆环上依次均勾分布有8个内径为0.5mm的小孔。激光雕刻机的主要加工参数为:切割能量100 %，切割次数2，切割线速度10%。得到的模具用于小鼠皮肤的固定可防止小鼠皮肤的蜷缩。
[0118]2、小鼠全层皮肤损伤模型的构建
[0119]用异氟醚对小鼠进行麻醉并进行模型构建。正式的手术前需要对小鼠进行去毛的处理，通过去毛器理去小鼠背部偏上部及其周围的小鼠毛发;其次，用笔在去毛的区域中标记出一块直径为0.6cm的圆形区域作为欲切除的皮肤范围标记也可以便于手术切除的观察。在实际的手术剪除中，通过手术剪完整的去除标记的皮肤，在去除皮肤时还应注意去除其下方的肉筋膜并完成评分的剪除。
[0120]在皮肤去除过程结束后，还需要将支撑体古代在小鼠的皮肤表面:支撑与皮肤间的固定一是依靠一定的粘性物质使支撑体完整的粘合在皮肤上，二是通过支撑体上准备的小孔与皮肤之间的缝合来实现长时间的固定。
[0121]3、通过本发明进行辅助修复
[0122]在构建了稳定的全层皮肤损伤的小鼠模型后，可以使用本发明的去细胞化的细胞微环境支架进行伤口的辅助修复。使用前将本发明得到的细胞微环境支架浸入生理盐水中进行湿润处理，随后即可帖附至伤口表明。通过支架与周围的缝合实现其固定，并通过透明敷料的封闭实现防止感染和水分流失的作用。14天后，可见脱细胞化仿生微环境治疗组较无材料对照物恢复效果好，如图5所示，A为对照组即物任何治疗措施小鼠在第I天的伤口情况;B为实验组即通过脱细胞化人工微环境进行治疗的小鼠第I天的伤口情况。C为对照组即物任何治疗措施小鼠在第14天的恢复效果;D为实验组即通过脱细胞化人工微环境进行治疗的小鼠第14天的恢复情况。
[0123]此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0124]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0125]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1.一种制备人造微环境的方法，其特征在于，包括: (1)将功能细胞接种在固相载体上； (2)将步骤(I)所获得的固相载体在适于所述功能细胞生长的条件下保持预定时间；以及 (3)将步骤(2)所获得的固相载体进行脱细胞化处理，以便获得所述人造微环境。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述功能细胞包括选自动物干细胞、体细胞和癌细胞的至少之一； 任选地，所述动物为哺乳动物，优选为人； 任选地，所述干细胞选自下列至少之一:胚胎干细胞，多潜能干细胞，脂肪干细胞、骨髓干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞、角膜干细胞、皮肤干细胞、上皮干细胞； 任选地，所述体细胞选自下列至少之一:成纤维细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、心肌细胞； 任选地，所述癌细胞为原代癌细胞和/或癌细胞系。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述接种是将单细胞悬浮液滴加至所述固相载体上而进行的，其中，所述单细胞悬浮液含有所述功能细胞。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述单细胞悬浮液是通过将所述功能细胞进行胰酶处理而得到的。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述单细胞悬浮液的浓度为lX105/mL-lX107/mL，任选地，所述单细胞悬浮液的浓度为IX106/mL。6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(I)包括: (1-1)将单细胞悬浮液滴加到所述固相载体上； (1-2)将步骤(1-1)所获得的固相载体在二氧化碳培养箱中静置2小时。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相载体由可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料所构成， 任选地，所述可交联的人工合成生物材料选自下列至少之一:聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯； 任选地，所述可交联的天然生物材料选自下列至少之一:明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相载体为三维多孔支架， 任选地，所述三维多空支架的孔径为1_999μπι，孔间距为1-999μπι，孔隙率参数为50%-99.9% ； 任选地，所述三维多孔支架的体积为Iym3-1 OOcm3; 任选地，所述三维多孔支架呈片状，球状或多角状。9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述脱细胞化处理是采用化学方式的方法和/或物理方式的方法， 任选地，所述化学方式的方法所采用的试剂选自下列至少之一:酸性溶液，碱性溶液，高渗溶液，低渗溶液，离子洗涤剂，非离子洗涤剂，两性离子洗涤剂，醇类，丙酮，磷酸三丁酯，酶类，螯合剂； 任选地，所述酸性溶液为乙酸和/或过氧乙酸； 任选地，所述碱性溶液选自氢氧化妈，硫化钠和氢氧化钠中至少一种； 任选地，所述离子洗涤剂选自SDS，SDC和Triton X-200中至少一种； 任选地，所述非离子洗涤剂为Triton X-100 ； 任选地，所述两性离子洗涤剂选自CHAPS，硫代甜菜碱1，SB-10和SB-16中至少一种； 任选地，所述酶类选自核酸酶，胰酶和中性蛋白酶中至少一种； 任选地，所述螯合剂为Η)ΤΑ和/SEGTA ； 任选地，所述物理方式的方法选自下列至少之一:反复冻融，压力，气压，渗透作用，电激法，灌流，搅动和超临界流体。10.一种人造微环境，其特征在于，所述人造微环境是通过权利要求1-9任一项所述方法制备获得的。
【文档编号】A61L27/22GK105999414SQ201610443519
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】杜亚楠, 李雅倩, 蒋书萌
【申请人】清华大学