专利名称：从阿魏(FERULA)属植物中制备ferutinine的方法
技术领域：
本发明涉及阿魏(/^"/a s/7/ )的植物提取物以及从所述提取物中分离 ferutinine的方法。
背景技术：
大量阿魏属植物含有具有雌激素活性的 s烯，还称为植物雌激素，即调 节激素功能的物质，对合成激素在治疗经前期综合征和与绝经及衰老有关的
紊乱中的用途而言显然是有效的选择。某些种类的阿魏(尸mi/")提取物在古 代:f皮用作避孕药和用于治疗阳萎和绝经期紊乱。近来，已经公开(WO 0230438)阿魏(/^ / fl^i/o幼V/" ￡.)的醇提取物作为抗癌药。
阿魏属植物中含量最丰富的化合物是jaeschkenadiol (II)衍生物，
胡萝卜烷酯是已知的化合物，例如在Phytochemistry，第"巻，n。3,第 597-623页，1994中公开。式(I)中，R为直链或支链的饱和或不饱和脂肪族酰 基，或者是任选被取代的芳香族g。 R^团的实例有异戊^、当归5it&、
特别是具有通式(I)的胡萝卜烷酯，
笨甲i^、对羟基千基、藜芦酰基或肉桂酰基。
来源于阿魏(Fmi/" w/;)的胡萝卜烷酯是类似于SERMs (选择性雌激素 受体调节剂)的雌激素调节剂；其中，ferutinine(Ia)呈现出显著的雌激素活
性，而其它的胡萝卜烷酯则具有相当弱的活性。<formula>formula see original document page 4</formula>
具体而言，ferutinine是雌激素受体a激动剂(ERa)及雌激素受体(3激动剂 /拮抗剂(ERp)。还已经证明ferutinine与雌激素受体的结合力比他莫昔芬高。
因此，有必要得到富含ferutinine的提取物或者对从含有femtinine前体 的植物材料中提取ferutinine纯品进行优化。
从文献(J. Org. Chem. USSR (Engl. Transl.); EN; 28; 10; 1992; 1666-1673)中获知下迷方法该方法包括^f吏胡萝卜烷酯全提取物水解产生 jaeschkenadiol粗品，随后用适宜被保护的对羟基苯甲酸、例如用对乙酰氧 基苯曱酸使jaeschkenadiol重新酯化。但是，此方法的产率相当低(约45%)， 这主要是由于竟争性酯交换反应而造成的。
发明详述
现已发现使用对新戊酰lL^苯甲酸作为酯化剂可以避免导致低转化产 率的竟争性反应。
因此，本发明的目的是制备ferutinine (Ia)的方法，
(,a)
该方法包括以下步骤
a) 从阿魏(/^"/"5/，/0中提取胡萝卜烷酯；
b) 使胡萝卜烷酯碱水解，产生jaeschkenadiol(II);
c)用对新戊酰氧基苯曱酸(III)使jaeschkenadiol (II)酯化,
产生对新戊酰基ferutinine (IV);
<formula>formula see original document page 5</formula>d) 4吏对新戊酰基ferutinine (IV)7jC解为ferutinine。
"胡萝卜烷酯"表示如上定义的通式(i)化合物；所述的酯可通过如下方
法得到用常规的方法、例如通过用低级醇提取的方法，提取阿魏(/^,"/ 5/7/7)、优选大阿魏CFd/to cww附wi/s)及赫蒙阿魏(Fww/fi Ae/7W0W/S)的才艮茎或 地上部分。从含有1:1比例的ferutinine和jaeschkenadiol苯甲酸酯(通过色语 法不易分离)的赫蒙阿對艮茎开始，ferutinine纯品可通过如下方法分离用 曱醇提糾艮，用5。/。KOH处理提取物，用脂肪烃、醚、酯或氯化溶剂^^提皂 化提取物。
或者，胡萝卜烷酯可通过于35至65'C、优选45'C的温度和200至260bar (即2 x 104至2.6 x 1()4千帕斯卡)、优选245bar (即2.45 x 104千帕斯卡)的压力下 用超临界C02萃取而得到。分离器内(或多个分离器内)的温度为25至45X:， 压力为约50bar(即5000千帕斯卡)。在这些实验条件下，胶状材料(使所需化 合物回收困难)不被提取。残余物可根据实施例所报道的方法直接进行皂化。
根据上文所述的方法，其中胡萝卜烷酯从大阿魏中提取.
根据上文所述的方法，其中胡萝卜烷酯从赫蒙阿魏中提取。
根据上文所述的方法，其中胡萝卜烷酯用超临界二氧化碳在35至65。C的 温度M x 104至2.6 x 104千帕斯卡的压力下提取。
根据上文所述的方法，其中温度为45"C。
才艮据上文所述的方法，其中分离在25至45 €的温度及4500至5500千帕斯 卡的压力下进行。
根据上文所述的方法，其中步骤c)和d)依次进行而无需回收对新戊酰基 ferutiniiic (IV)。
将jaeschkenadiol用对新戊酰ltJ^苯甲酸酯化，在相同反应溶剂中用碱、 优选伯胺、更优选乙二胺处理，产生ferutinine纯品。4艮据本发明的一个优 选实施方案，步骤c)和d)可方便地依次进行而无需回收中间体对新戊酰基 ferutinine。
本发明的另 一个目的是ferutinine、对新戊酰基ferutinine以及阿魏 (Fer"/fl印p)提取物、优选大阿魏和赫蒙阿魏提取物的美容和皮肤病学用途。
当应用于皮肤时，ferutinine和阿魏(7^w/as/^)提取物令人惊讶地被证 明能够增加胶原的生物合成，并且能够起滋补、营养及保湿的作用，由此产 生紧致性(firmness)及弹性。此外，它们还可减少皮脂分泌，并且在控制多
毛症和面部男性化方面发挥着显著的作用。因此，含有ferutinine或阿魏
0Fw"to w/;)提取物的组合物在美容或皮肤病学领域中可用于治疗浅表或深 皱紋或者其它不美观的方面以及用于治疗多种痤疳及皮脂溢形式。
Ferutinine及阿魏(/^w/fl印/;)提取物可以与常规赋形剂混合配制成乳奮 剂、凝胶剂及洗剂的形式，所述赋形剂例如^Remington，sPharmaceutical Sciences Handbook, XVII ed.， Mack出版社，N.Y" U.S.A.中所述的那些，优选 在大豆卵磷脂或磷脂、例如月桂酰磷脂酰^A肉豆蔻酰磷脂酰^(它们 可掺入7jC/油和油/水型乳剂或者透皮硬骨剂中)的存在下配制。
以下实施例更为详细地解释了本发明。 实施例
实施例l -从赫蒙阿魏根中分离jaeschkenadiol
将250g研细的赫蒙阿魏根(粒径分布2mm)用l升MeOH渗滤提取。用 溶剂浸渍两天并渗滤后，重复操作(4xl升)，得到112.28曱醇提取物(45%)。 通过TLC(石油St/乙酸乙酯8/2, femtinineRf: 0.14)监测药物是否提取完 全。
将甲醇提取物用513mllO。/oKOH甲醇溶液回流。l小时后，TLC分析(石 油醚-乙酸乙酯8/2， ferutinine Rf: 0.14; Rf jaeschkenadiol: 0.31)表明>^应 完全。冷却后，反应混合物用水(500ml)稀释，用石油醚提取(4x500ml)。所 合并的石油醚相用盐水洗涤，干燥，蒸发。所得的半晶质残余物用冷石油醚 (水箱温度)洗涤，得到7.5gjaeschkenadiol结晶。母液通过色谱法(50g硅胶， 石油醚-乙酸乙酯95:5)纯化，得到a-没药醇(870mg)、 a-没药醇与 j aesehkenadiol的混合物以;5Lj aeschkenadiol纯品(结晶后得3.4g)。 jaeschkenadiol和a-没药醇的混合物用母液汇集，进行色谱法(50g硅胶，石油 醚-乙酸乙酯95:5)，得到l,95gjaeschkenadiol结晶(总产量12.85g， 5.1%),
该化合物具有以下理化性质及光谱特性
IR光i昝(KBr， cm-1): 3339， 2965， 2卯5， 2875， 1470， 1375,1047， 968, 858 质谱(C丄)
M++l-H20=221; M++12H2O=203
NMR光傳(300MHZ， CDC13) 5 : H9 5.43m， H2 3.9m， H14 1,78s， H15
1.00s, H12 0.95d J 4.98， H13 0.91d J 5.13。
实施例2 -从大阿魏根中分离jaeschkenadiol
将250g研细的大阿魏根(粒径分布2mm)用l升MeOH渗滤提取。用溶 剂浸渍两天并渗滤后，重复^Mt(4xl升)；曱醇提_取物浓缩至相当于研细根 的重量的体积，向拔^取物中加入10。/。KOH(10ml)。将碱性溶液回流2小时， 然后冷却，用200ml正己烷反fe次。通过TLC(石油Si/乙酸乙酯8/2)监测药 物是否提取完全。
所合并的己烷相用盐水洗涤，干燥，蒸发。所得的半晶质残余物用冷石 油醚(水箱温度)洗涤，得到3.5gjaeschkenadiol结晶。才艮据实施例l将母液纯 化。产量0.8gjaeschkenadio1，与实施例l的产物具有相同的理化性质。
实施例3 -从大阿魏地上部分分离jaeschkenadiol
将lkg研细的大阿魏地上部分用二氧化碳于45"C;^245bar(即2.45《104 千帕斯卡)下在超临界气体萃取用装置中提取。分离器内(或多个分离器内) 的温度为25至45匸，压力为约50bar(即5000千帕斯卡)。在这些条件下，胶 状材料(使所需化合物回收困难)不^L提取.将仅含有亲脂性化合物和水的残 余物按照实施例1和2中所报道的方法用曱醇溶解并用碱处理，使 jaeschkenadiol酯水解。纯化后，得到5.1g化合物純品，与实施例l的产物具 有相同特性。
实施例4-对新戊酰氧基苯甲酸的合成
将4-羟基苯甲酸(114.5g， 829mmol)在搅拌下溶解于吡咬(l.lS升)中，在水 浴上冷却至T〈5。C 。向所得溶液中加入4-二曱氨基吡咬(DMAP， 0.3当量， 248.8mmo1，30.4g)及新戊酰氯(3当量,2.487mol，300g，293.6ml)。溶液温热至 室温，在搅拌下放置2小时，然后加入水(2,29升)(放热反应将溶液在冰浴 中冷却)，在搅拌下另外放置3小时。
将溶液倒入分液漏斗中，用CH2C12 (3 x 750ml)萃取。所合并的二氯甲 烷相用2M H2S04 (4 x 750ml)和饱和NaCl溶液(1 x 1150ml)洗涤，然后经 Na2S04 (60g)干燥。
将溶液通过纸过滤器过滤，真空蒸发溶剂，得到残余物，将该残余物用 石油醚于30-50。研磨(3x400ml),抽滤，在静态干燥器中于45。C真空干燥15 小时。得到130.5g具有以下光语特性的产物。
IR光i普(KBr， cm"): 3680， 2978， 2361， 1753， 1686， 1603， 1427， 1289， 1204， 1163,1103。
质谦(C.I.): M++1-223
NMR光镨(300MHZ， D誦DMSO) 5 H3=7 8.00 d J=8.48， H4=6 7.23 d J=8.55， CH3 1.34 s。
实施例S-由jaeschkenadiol合成femtinine
将jaeschkenadiol (lOOg， 419.5mmol)在搅拌下于室温溶解于CH2Cl2 (600ml)中。向所得溶液中加入对新戊酰氧基苯甲酸(1.4当量，587.3mmo1， 130.5g)^J)MAP (0.3当量，125.9mmo1， 15.4g)。溶液在搅拌下放置10分钟， 使试剂溶解完全，然后加入N,N，-二环己基碳二亚胺(DCC， 1.8当量， 755.1mmo1， 155.8g)。 2小时后反应完全。
溶液浓缩至2体积(200ml),用5体积CH3CN(500ml)稀释，然后滤除二环 己基脲沉淀，用另外5体积CH3CN(2x250ml)洗涤。将所合并的有拟目倒入 分液漏斗中，用10% w/v Na2C03 (2 x 250ml)和NaCl饱和溶液(1 x 250ml)萃 取，然后经Na2SO4(100g)干燥。滤除Na2S04，溶剂真空蒸发，产生360g具 有以下光谱特性的化合物(IV):
3H N證(300 MHZ, CDC13》S 8.09 (在J=9.0 Hz， H3，-H5')， 7,20 (d， J=8,7 Hzs H2f-H6,)， 5,60 (brt,河.7 Hz, H9), 5,35 (td， J,.4-2.9 Hz, H6)， 2*58 (dd， J-13,i-m,9他》 H7b)， 2.34 (dd, 1-2.3 Hz, H7a)， 2.07 (m， HIO)， 2.04 (d， J=2.7 Ha H5)， 1.97 (d, J,.7 Hz， H2a), 1.89 (m， Hll), 1,86 (s, Hi4)， 1.63 (m， H2b)， 1,57 (m， H3a)， 1.41 (s， C(C,)， 1.30 (tn, H3b)， U4 (s， H15)' G.99沐=6,9 Hz， H12), (d,Hz， H13),
将化合物(IV)在搅拌下于室温溶解于2升CH2Cl2中。向所得溶液中加入 乙二胺(10当量，280ml)。 3小时后反应完全。溶液冷却至O'C，倒入分液漏斗
中，用0X:的3MH2SO4(2x750ml，放热M)及饱和NaCl溶液(1 x 500ml)洗 涤。有^M目经Na2SO4(100g)干燥，过滤，蒸发至干。将残余物(230g)装到用 5.8升己烷乙酸乙酯=9:1的混合物平衡的>^柱(2.51(§)上，用70升相同混合 物'决脱。汇集含有产物的级分，真空蒸发溶剂，产物在静态干燥器中于45t: 干燥24小时。
得到139g (92.4%)具有以下光谱特性的产物
IR光i普(KBr， cm1): 3410， 1686， 1655， 1608， 1593,1560， 1279， 1165， 1099
771。
质谦(C丄)M++l-H20=341
NMR光i昝(200MHZ， CDC13): 5 H3，=7， 7.94 d J=8, 4，=6， 6.88 d J=8, H9 5.56 m， H2 5.23 dt J=ll， H14 1.80 brs, H15 1.10 s， H13 0.94 d J=6.5, H12 0.82d J=6.5。
实施例6-赫蒙阿魏提取物的制备
将lkg赫蒙阿魏整林植物用5体积丙酮提^3次。将所合并的丙酮提取物 浓缩至相当于开始生物量重量的0.5份，用2份水稀释。在己烷的存在下，用 稀KOH在剧烈搅拌下调节水溶液pH至7.8。弃去己烷相，^M目酸化至pH5， 用正己烷反提。含有ferutinine的己烷相浓缩至干，产生"g含有约35。/。 ferutinine的提取物。
实施例7 -用于治疗浅表皱紋的含有ferutinine的制剂 将ferutinine掺入具有以下组分的乳骨剂中
Ferutiniiic0.20g
卡波姆934 (卡波普934 P-Goodrich)0.60g
丙二醇3.00g
咪峻啉基脲0.30g
Kathon CG0.05g
EDTA二钠0.10g
PEG-5大豆甾醇(Genero1122 E5-Henkel)2.00g
辛基十二烷醇(Eutanol G-Henkel)4.00g
麦芽油 4.00g
珪油350cps 0.50g
石更脂酸甘油酯(Cutine GMS-Henkel) 7.00g
聚山梨酯60 (Tween 60-ICI) 5.00g
生育酚 0.20g
抗坏血酸棕榈酸酯 O.lOg
10% NaOH溶液 2.00g
香料(186909-Dragoco) 0.20g 纯化水 至100.00g
实施例8 -含有赫蒙阿魏纯提取物的制剂，所迷提取物含30。/。 ferutinine及 20% jaeschkenadiol苯甲酸酯
赫蒙阿魏提取物0.5g
卡波姆934 (卡波普934 P-Goodrich)0.60g
丙二醇
咪峻啉基脲0.30g
Kathon CG0.05g
EDTA二钠O.lOg
PEG-5大豆甾醇(Generol 122 E5-Henkel)2.00g
辛基十二烷醇(Eutanol G-Henkel)4.00g
麦芽油4.00g
珪油350cps0.50g
硬脂酸甘油酯(Cutine GMS-Henkel)7.00g
聚山梨酯60 (Tween 60-ICI)5.00g
生育酚0.20g
抗坏血酸棕榈酸酯O.lOg
10。/。NaOH溶液2.00g
香料(186909-Dragoco)0.20g
纯化水至100.00g
实施例9-含有ferutiniiie的^J^剂
Ferutiiiine 0.30g
咪唑啉基脲 0.30g
尼泊金曱酯 0.20g
羟乙基纤维素(Natrosol 250 HHX-Aqualon) 2.00g
纯化水 至100ml
实施例10-含有阿魏0Fww/" w/;)提取物的美容制剂
赫蒙阿魏提取物 0.5g
。米唑啉基脲 0.30g
尼泊金甲酯 0.20g
羟乙基纤维素(Natrosol 250 HHX-Aqualon) 2.00g
纯化水 至100ml
实验
产品效能
在对40名年龄为39至56岁的女性志愿者进行的双盲研究中评价对皮肤 弹性和紧致性以及对皱紋测定法(rugometry)的作用，测定了实施例7的乳青 剂的效能。研究之前进行7天调节期，在此期间受试者必须戒绝使用保湿产 品、防晒霜及液体化妆品，并避免晒黑处理及过度暴露在紫外线中。
受试者允许使用常规的眼部*部护理产品、搽脸粉和非保湿皂。
将受试者随机分成两组， 一组用安慰乳骨剂处理，另一组用实施例7的 乳骨剂处理。乳骨剂以标准量(O.Sg,即从管中挤出0，5cm乳骨)涂于面部，一 曰两次，早晚各一次。治疗前及治疗五周后进行以下测量。
在每个测量期之前，所有受试者在23C及相对湿度50。/。的气候室中停留 30分钟。每一期包括在下述指定的皮肤区域用角质层测定仪(corneometer) 测量三次、用肤质测定仪(cutometer)测量三次以及眶周区的硅印模(silicon impression),
所有40名受试者均完成了研究。
肤质测定法(Cutometrv)
肤质测定仪是用于以非损伤方式测量皮肤机喊性能的市售装置 (Cutometer SEM 575， Courage & Khazaka，德国)。更为详细地说，它测量 皮肤表面在通it2mm开口的探针受到500mmHg的负压时的垂直形变。透入 探针中的皮肤长度以0.01mm的精度进行目测。探针与计算^M目连，计算机 记录皮肤随时间的形变。从所得曲线可外推出多个变量来评价皮肤的弹性、 粘弹性及粘性行为。
记录以下M: 即时膨胀(Ue)，在0.1秒时测量； 延迟膨胀(Uv);
最终膨胀(Uf)，在10秒时测量；以及 即时缩回(Ur)。
试验使用皮肤测定仪在两颊进行。
在安慰剂组中未观察到显著变化。处理5周后，治疗组的延迟膨胀(U" 显著降低(16。/。,p0.05)。该^L良映了皮肤的粘弹性能和真皮行为。5周后 i^见察到Ue的显著变化(-12。/0, p<0.05)， Ue主要受角质层的水合性能及^M^ 性能的影响。Uv和Ue的降低以及Ur的稳定表明皮肤的紧致性增加。 角质层测定法(Corneometry)
柔软光滑的皮肤外观主要取决于角质层中存在有充足量的水分。
角质层测定仪是测量由皮肤水合变化引起的电容变化的市售装置 (Cor歸meter CM 825 Combi 3, Courage & Khazaka，德国)。
试验使用角质层测定仪在两颊进行。
5周后，在治疗组中观察到显著变化，具体而言，皮肤水合增加l7.5。/0, 而在安慰剂组中水合降4氐3% 。 铍玟测定法(Ru2ometry)
硅印模在处于坐姿的受试者中进行。在开始时以^5周后，采用"Silflo 硅印模材料，，(从Flexico，UK可得)获得印模(2 x 5cm)。
然后用采用Quantirides-Monaderm软件的皮肤图像分析仪系统(Skin Image Analyzer System)分析印模，该系统可将皮肤樣沐伏与中等皱紋及深
皱紋区别开，并计算它们的数量和深度；最终，获得皱紋的总面积值。 5周后，在治疗组中观察到显著变化。具体而言，观察到皱紋面积减少
21.3% (p<0.05)，而在安慰剂组中则减少0.4%。
已经观察到，主要是中等及深皱紋的数量和深度在统计学上显著减少。
结论
该研究可作出如下结论实施例7的乳骨剂在治疗有时间迹象及光老化 迹象的皮肤中具有良好的美容活性，因为它可增加皮肤的紧致性和水合作 用，并可减小平均皱紋面积，特别是深的微小皱紋和大皱紋部位。皮肤明显 变得更紧致和更光滑。
权利要求
1.阿魏(Ferula spp)提取物在制备美容和/或皮肤病学组合物中的用途。
2. ferutinine在制备美容和/或皮肤病学组合物中的用途。
3. 对新戊酰氧基ferutinine在制备美容和/或皮肤病学组合物中的用
全文摘要
本发明涉及从阿魏(Ferula spp)提取物中制备ferutinine(Ia)的方法，该方法包括提取物的碱水解和用对新戊酰氧基苯甲酸进行的处理。本发明还涉及提取物和ferutinine在美容及皮肤病学领域中的用途。
文档编号A61Q19/08GK101371818SQ20081014891
公开日2009年2月25日 申请日期2004年3月23日 优先权日2003年4月4日
发明者A·克里斯托尼, E·梅尔卡利, E·邦巴尔代利, G·丰塔纳 申请人:因德纳有限公司