专利名称：诱导药用阿魏愈伤组织及肧状体再生的技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术。 技术背景新疆药用阿魏(Ferula sinkiangensis K. M. shen)属伞形科阿魏属(Ferula L.)植物， 是我国人民应用历史悠久的中药材之一。早在《唐本草》中就有记载，在其后有关药物的 书籍中，如明朝李时珍的《本草纲目》和清朝吴其浚的《植物名实图考》中，都有阿魏的 记载。历版《中华人民共和国药典》都予以收载，植物种源为新疆阿魏和阜康阿魏，具有 消积散痞、祛湿止痛、杀虫的功效。是新疆特有珍稀药用植物资源。新疆药用阿魏属早春植物，为多年生一次结果草本植物，多生长在戈壁荒漠地带的春 牧场。阿魏药材是从新疆阿魏或阜康阿魏的根或茎中得到的一种油胶树脂之风干块状物， 民族医用其根治病，这种药材采收方式，使得植株难以结籽繁衍，加速了资源的萎缩。近 年来，由于草场超载、干旱、过渡采挖，特别是大面积的开荒，致使新疆阿魏资源锐减， 处于濒危的边缘。因此，研究新疆药用阿魏人工繁殖技术，对保护新疆野生药物资源，维持生物多样性，为医药行业提供稳定、可持续利用的药材资源具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种以阿魏幼苗为材料，诱导愈伤组织及其再生肝状体，并进行 继代培养，进而可实现人工规模化繁殖阿魏。 本发明主要包含以下过程取阿魏幼苗用水冲洗干净，然后用50 85%酒精20 40 s、 0. 05 0. 15%升汞2 4 min 中的至少一种浸洗消毒，然后用无菌水洗涤去消毒残液，切成0.5 1.0cm块在培养皿中 接种于培养基上，置于18 25'C下培养5天以上即可； 上述的培养基的配制如下选用MS为基本培养基，所述培养基用0. lmol/LNaOH或0. lmol/LHCl溶液进行调节至 pH为5. 5 6. 5。作为进一步改进的技术方案，上述的培养基中最好加入激素2，4-D (2，4-二氯苯氧乙 酸)0. l 1.0mg/L、 NAA (奈乙酸)0. l 3.0mg/L、 KT (激动素)0. 5 3. 0)mg/L、 6-BA (6-苄基嘌呤)0. 5 3. Omg/L、 GA30. 1 1. Omg/L之中的一种或几种。上述的培养基的优选组合为下列中至少一种 MS+2， 4-DO. 1 1. Omg/L+KT1. 0 2. Omg/L; MS+NAAO. 1 1. 5mg/L+6-BA0. 5 2. 5mg/L;MS+NAAO. 1 1. 5mg/L+6-BAO. 5 3. Omg/L+GA30. 1 1. Omg/L。 上述的培养基中最好添加5 9g/L的琼脂条，20 40g/L的蔗糖中的一种或几种。 上述的阿魏幼苗可以为实生苗，也可为无性繁殖所得幼苗，最好选择一片真叶以内的 幼苗，优选为无真叶的幼苗，最佳为幼苗的下胚轴部分本发明以新疆阿魏实生或非实生苗为材料，诱导愈伤组织，并进行继代培养，为利用 植物组织培养和细胞培养法繁殖珍稀物种，特别是在开发利用生长周期长、资源稀少的药 用植物方面，提供了一条新的途径，对保护新疆野生药物资源，维持生物多样性，为医药 行业提供稳定、可持续利用的药材资源具有重要的意义，尤其为今后应用生物技术繁育新疆阿魏并进行规模化种植奠定了基础。
具体实施例方式实施例1:取实生未生出真叶的阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85y。的酒精消毒20 40s，再用 0. 05 0. 15%升汞2 4 min浸洗消毒，用无菌水冲洗数次，取其肝轴部分切成0. 5 1. Ocm 块接种在MS附加2， 4-D0. 1 1. Omg/L+KTL 0 2. Omg/L中，18 25'C暗培养5 10天左 右即可发现接种组织块膨大，这时将膨大组织块用解剖刀竖直劈开继代培养15 30天左 右即可诱导出愈伤组织，出愈率为30 70%。实施例2:取实生一片真叶以内的阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85。/。的酒精消毒20 40s，再 用0.05 0. 15%升汞2 4 min浸洗消毒，用无菌水冲洗数次，取其肝轴部分切成0. 5 l.Ocm块接种在MS附加2， 4-DO. 1 1.0mg/L+KT1.0 2. Omg/L中，18 25。C暗培养，5 IO天左右接种组织块膨大。实施例3:与实施例1相比，本实施例的不同是将诱导产生的阿魏愈伤组织转接到MS附加NAAO. 5 1. 5mg /L和6-BA1. 0 3. 0mg/L培养基中愈伤组织增值较快，15 30天可增值2 4倍。实施例4:与实施例1相比，本实施例的不同是将阿魏愈伤组织转接到MS附加GAs0. 1 0. 5mg/L、NAAO. 5 1. 5mg /L和6-BA1. 0 3. Omg/L中培养15 30天继代1次，继代1 3次后即可 发现培肝状体的出现。 实施例5:取无真叶阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85y。的酒精消毒20 40s浸洗消毒，用无菌 水冲洗数次，切成0. 5 1. Ocm块接种在MS附加2， 4-DO. 1 1. Omg/L+KTl. 0 2. Omg/L中， 18 25'C暗培养，5 10天左右接种组织块膨大。实施例6:取无真叶阿魏幼苗用水冲洗干净，经0.05 0. 15%升汞2 4 min浸洗消毒，用无菌 水冲洗数次，切成0. 5 1. Ocm块接种在MS附加2， 4-D0. 1 1. Omg/L+KTl. 0 2. Omg/L+ 琼脂条5 9g/L中，18 25X;暗培养，5 10天左右接种组织块膨大。实施例7:取实生未生出真叶的阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85。/。的酒精消毒20 40s，再用 0.05 0. 15《升汞2 4min浸洗消毒，用无菌水冲洗1 4次，切成0. 5 1. Ocm块接种在 MS附加2， 4-DO. 1 1. Omg/L+KTl. 0 2. Omg/L+蔗糖20 40g/L的液体培养基中，置于摇 床上100 120转/分钟，18 25"C暗培养5 10天左右即可发现接种组织块膨大，这时将 膨大组织块用解剖刀竖直劈开继代培养15 30天左右即可诱导出愈伤组织，出愈率为 30 70%。实施例8:取实生未生出真叶的阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85%的酒精消毒20 405，再用 0.05 0. 15M升汞2 4min浸洗消毒，用无菌水冲洗2 3次，切成0. 5 1. Ocm块接种在 MS附加2， 4-DO. 1 1. Omg/L+KTl. 0 2. Orfig/L+蔗糖20 40g/L+琼脂条5 9g/L中，18 25'C暗培养5 10天左右即可发现接种组织块膨大，这时将膨大组织块用解剖刀竖直劈开 继代培养15 30天左右即可诱导出愈伤组织，出愈率为30 70%。实施例9:与实施例1相比，本实施例的不同是将诱导产生的阿魏愈伤组织转接到MS附加 NAAO. 1 3. Omg /L和6-BAL 0 3. Omg/L培养基中愈伤组织增值较快，15 30天可增值2 4倍。实施例10:与实施例1相比，本实施例的不同是将阿魏愈伤组织转接到MS附加GA30. 1 0. 5mg/L、 隐O. 5 3. 0mg /L和6-BA1. 0 3, 0mg/L中培养15 30天继代1次，继代1 3次后即可 发现培肝状体的出现。实施例11:取实生未生出真叶的阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85%的酒精消毒20 40s，再用 0. 05 0. 15%升汞2 4 min浸洗消毒，用无菌水冲洗数次，取其肝轴部分切成0. 5 1. Ocm 块接种在MS附加2， 4-DO. 1 1. Omg/L+KTO. 5 3. 3mg/L中，18 25。C暗培养5 10天左 右即可发现接种组织块膨大，这时将膨大组织块用解剖刀竖直劈开继代培养15 30天左 右即可诱导出愈伤组织。实施例12:取实生一片真叶以内的阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85%的酒精消毒20 403，用 0. 05 0. 15%升汞2 4 min浸洗消毒，用无菌水冲洗1 2次，取其肝轴部分切成0. 5 l.Ocm块接种在MS附加2， 4-DO. l 1.0mg/L+KTl. 0 3. Omg/L中，18 25。C暗培养，5 IO天左右接种组织块膨大。实施例13:与实施例10相比，本实施例的不同是将诱导产生的阿魏愈伤组织转接到MS附加 NAAO. 1 3. Omg /L和6-BA1. 0 3. Omg/L培养基中15 30天即可。 实施例14:与实施例1相比，本实施例的不同是将诱导产生的阿魏愈伤组织转接到MS附加 NAAO. 1 3. Omg /L和6-BAO. 5 3. Omg/L培养基中愈伤组织增值较快，15 30天可增值2 4倍。实施例15:与实施例1相比，本实施例的不同是将阿魏愈伤组织转接到MS附加GA30. 1 0. 5mg/L、NAAO. 5 3. Omg /L和6-BAO. 5 2. 5mg/L中培养15 30天继代1次，继代1 3次后即可 发现培肝状体的出现。 实施例16:与实施例1相比，本实施例的不同是将诱导产生的阿魏愈伤组织转接到MS附加 NAAO. 1 3. Omg /L和6-BA0. 5 2. 5mg/L培养基中愈伤组织增值较快，15 30天可增值2 4倍。实施例17:与实施例1相比，本实施例的不同是将阿魏愈伤组织转接到MS附加GA30. 1 0. 5mg/L、 陽O. 5 3. 0mg /L和6-BA1. 0 2. 5mg/L中培养15 30天继代1次，继代1 3次后即可 发现培肝状体的出现。实施例18:取无真叶阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85。/。的酒精消毒20 40s浸洗消毒，用无菌 水冲洗1 3次，切成0. 5 1. Ocm块接种在MS附加2， 4-DO. 1 1. Omg/L+KTl. 0 2. Omg/L 中，18 25'C暗培养，5 10天左右接种组织块膨大。实施例19:取无真叶阿魏幼苗用水冲洗干净，经0.05 0. 15%升汞2 4 min浸洗消毒，用无菌 水冲洗数次，切成0. 5 1. Ocm块接种在MS附加2， 4-DO. 5 1. Omg/L+KTO. 5 2. Omg/L+ 琼脂条5 9g/L中，18 25。C暗培养，5 10天左右接种组织块膨大。实施例20:取实生未生出真叶的阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85。/。的酒精消毒20 40s，再用 0.05 0.15W升汞2 4min浸洗消毒，用无菌水冲洗1 3次，切成0. 5 1. Ocm块接种在 MS附加2， 4-DO. 1 1. Omg/L+KTO. 5 2. Omg/L+蔗糖20 40g/L的液体培养基中，置于摇 床上100 120转/分钟，18 25t:暗培养5 10天左右即可发现接种组织块膨大，这时将 膨大组织块用解剖刀竖直劈开继代培养15 30天左右即可诱导出愈伤组织，出愈率为 30 70%。实施例21:取实生未生出真叶的阿魏幼苗用水冲洗干净，经50 85y。的酒精消毒20 40s，再用 0.05 0. 15W升汞2 4min浸洗消毒，用无菌水冲洗2 4次，切成0. 5 1. Ocm块接种在 MS附加2， 4-D0. 1 1. Omg/L+KT1. 5 3. Omg/L+蔗糖20 40g/L+琼脂条5 9g/L中，18 25'C暗培养5 10天左右即可发现接种组织块膨大，这时将膨大组织块用解剖刀竖直劈开 继代培养15 30天左右即可诱导出愈伤组织，出愈率为30 70%。
权利要求
1、一种诱导药用阿魏愈伤组织及肧状体再生的技术，其特征在于主要包含以下工艺过程取阿魏幼苗用水冲洗干净，然后用50～85％酒精20～40s、0.05～0.15％升汞2～4min中的至少一种浸洗消毒，然后用无菌水洗涤去消毒残液，切成0.5～1.0cm块在培养皿中接种于培养基上，置于18～25℃下培养5天以上即可；上述的培养基的配制如下选用MS为基本培养基并调节至pH值为5.5～6.5。
2、 根据权利要求1所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术，其特征 在于所述的培养基MS中加入下列激素中的一种或几种2,4-DO. l 1.0mg/L、NAAO. 1 3. Omg/L、 KT 0. 5 3. Omg/L、 6-BA 0. 5 3. Omg/L、 GA30. 1 1. Omg/L。
3、 根据权利要求2所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术，其特征 在于所述的培养基优选组合为下列中至少一种MS+2， 4-DO. 1 1. Omg/L+KT1. 0 2. Omg/L; MS+NAAO. 1 1. 5mg/L+6-BAO. 5 2. 5mg/L;MS+NAAO. 1 1. 5mg/L+6-BAO. 5 3. Omg/L+GA30. 1 1. Omg/L。
4、 根据权利要求1或2、 3所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术， 其特征在于所述的培养基中添加5 9g/L的琼脂条和20 40g/L的蔗糖的一种或几 种。
5、 根据权利要求1或2、 3所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术， 其特征在于所述的阿魏幼苗选择一片真叶以内的幼苗。
6、 根据权利要求4所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术，其特征 在于所述的阿魏幼苗选择一片真叶以内的幼苗。
7、 根据权利要求1或2、 3所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术， 其特征在于所述的阿魏幼苗选择无真叶的幼苗。
8、 根据权利要求4所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术，其特征 在于所述的阿魏幼苗选择无真叶的幼苗。
9、 根据权利要求5所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术，其特征 在于所述的阿魏幼苗选择无真叶的幼苗。
10、 根据权利要求6所述的诱导药用阿魏愈伤组织及肝状体再生的技术，其特征 在于所述的阿魏幼苗选择无真叶的幼苗。
全文摘要
本发明涉及一种诱导药用阿魏愈伤组织及肧状体再生的技术，主要包含以下过程取洗干净的阿魏幼苗用酒精、升汞溶液的至少一种消毒，切成0.5～1.0cm块在培养皿中接种于pH值为5.5～6.5的MS基本培养基18～25℃下培养5天以上即可。本发明以新疆阿魏实生或非实生苗为材料，诱导愈伤组织，并进行继代培养，为利用植物组织培养和细胞培养法繁殖珍稀物种，特别是在开发利用生长周期长、资源稀少的药用植物方面，提供了一条新的途径，对保护新疆野生药物资源，维持生物多样性，为医药行业提供稳定、可持续利用的药材资源具有重要的意义，尤其为今后应用生物技术繁育新疆阿魏并进行规模化种植奠定了基础。
文档编号C12N5/06GK101228849SQ200810072820
公开日2008年7月30日 申请日期2008年2月5日 优先权日2008年2月5日
发明者凯撒·苏莱曼, 林 姜, 军 朱, 李晓瑾, 王果平, 石明辉, 贾晓光, 阿依别克·热河木都拉 申请人:新疆维吾尔自治区中药民族药研究所