专利名称：利用共溶剂进行酶催化法过酸的制备的制作方法
技术领域：
下文涉及利用多组分系统进行酶催化法过酸合成和原位酶催化领域。具体地讲， 提供了利用酶的过水解活性和多组分系统(即，在本发明的背景下，涉及利用至少两种在期望的反应时间前分开贮存的反应组分进行过氧羧酸制备的系统)进行过氧羧酸制备和有效递送的方法，其中酶在结构上归类为属于糖酯酶CE-7家族，而该家族包括先锋霉素乙酰基水解酶(CAH，E. C. 3. 1. 1. 41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE，E. C. 3. 1. 1. 72)。针对以下用途， 能以足够有效的浓度制备至少一种过氧羧酸表面消毒或卫生处理、医疗器械灭菌、食品加工设备灭菌，以及适用于衣物洗涤护理应用如消毒、漂白、脱色、除臭、和卫生处理。
背景技术：
过酸组合物已报道是有效的抗微生物剂。针对不希望有的微生物生长，对硬质表面、肉制品、活植物组织和医疗设备进行清洁、消毒、和/或卫生处理的方法已有所描述(如美国专利6，545，047、美国专利6，183，807、美国专利6，518，307、美国专利5，683，724、和美国专利申请公布2003/0026846)。过酸可用于制备衣物洗涤剂所用的漂白组合物也有所报道(美国专利3，974，082、美国专利5，296，161、和美国专利5，364，554)。过氧羧酸可通过羧酸烷基酯和过氧化物试剂，例如过氧化氢的化学反应制备(参见"Organic Peroxides，，,Daniel Swern编辑，第 1 卷，第313-516页；Wiley Interscience, New York, 1971)。然而，在弱碱性至酸性pH值(约8至约4)条件下，反应通常不能足够快地进行，以至于不能制备出适于许多商业消毒和/或漂白应用的过氧羧酸浓度。克服过氧羧酸化学法制备缺点的一种方法是使用具有过水解活性的酶催化剂。美国专利申请11/638, 635以及美国专利申请公布2008/0176783、2008/0176299、和 2009/0005590 (授予DiCosimo等人)公开了在结构上归类为糖酯酶CE-7家族的成员(如先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[ΑΧΕ])的酶，它们的特征在于具有显著的过水解活性，可将羧酸酯转化(在合适的过氧源存在下，如过氧化氢)为过氧羧酸，浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂。已证实，糖酯酶CE-7家族的一些成员具有足够的过水解活性，一旦将反应组分混合后，能在1分钟内由一元醇、二醇和甘油的乙酰酯生成4000至 5000ppm的过乙酸，并在5分钟至30分钟内生成高达9000ppm的过乙酸(DiCosimo等人， U. S. 2009/0005590)。在各引用的专利申请公布中，DiCosimo等人描述的酶催化法过酸生成系统可基于多反应组分的使用，这些反应组分在需要形成过酸溶液前保持分离。据观察，当使用包含第一酶催化剂/底物组分和第二组分(含有水性过氧源)的多组分系统时，一种或多种不溶于水或部分不溶于水底物的使用会在混合两种组分后导致至少以下三种情况，它们会影响有效地制备和递送过氧羧酸产物的能力首先，酶催化剂/
5底物组分的粘度会过高，而不能与含有过氧源的第二组分有效地混合，这会降低过氧羧酸的生成速率；其次，酶催化剂/底物组分的粘度会过高，而不能以某些方式递送包含酶催化剂/底物组分与过氧源的混合物的产物，如不能通过喷雾方式递送；第三，与在水溶液中含有过氧源的第二组分混合后，酶/底物组分中底物的溶解速率过低，而不能获得令人满意的过氧羧酸生成速率。在需要按特定的比率使用含有水性过氧源的组分与含有酶催化剂/ 底物的组分时，这些问题也会变得明显。就此而论，涉及在进行所需时间的反应前对具有过水解活性的酶催化剂和底物与过氧源分开贮藏的商用多组分系统仍无法用于某些应用。需要解决的问题是提供一种在使用多组分生成系统时通过酶催化法制备过酸的方法，该系统的特征在于具有至少一种第一组分，其包含羧酸酯底物和酶催化剂制剂，该酶催化剂包含具有过水解活性的CE-7糖酯酶，其中羧酸酯底物(1)部分或基本上不溶于含水基质，和/或(2)缓慢溶于含水反应基质和/或(3)具有不利于在某些商业应用(如使用双室喷雾瓶，其设计用于混合两种具有不同粘度和/或溶解度的液体组分)中实现方便混合的粘度；并且该系统的特征还在于具有至少一种第二组分，其包含具有过氧源的水溶液 (如过氧化氢的含水制剂)。发明概述通过提供过酸的酶催化法制备方法和系统，上述问题已得到解决，该方法包括在两组分系统的第一组分中使用至少一种共溶剂，其中所述第一组分为羧酸酯和至少一种酶催化剂的基本上无水的制剂，所述至少一种酶催化剂包含具有过水解活性的CE-7糖酯，其中加入所述至少一种共溶剂可改善第一组分的粘度以便在两组分系统中递送和混合，并允许根据需要调整第一组分的体积，以便按所需的两组分比率与第二组分混合，以及在与含水第二组分(即提供过氧源的含水制剂)混合以形成含水过酸制剂时可提高第一组分的溶解度和/或溶解速率。据发现，加入含log P小于约2的有机溶剂的共溶剂，按可通过常规的或换句话讲适于消费品、工业、和医疗背景的方法进行递送的形式，解决了前述会影响过氧羧酸产物有效制备和递送能力的情况，其中log P定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为log P= log[[溶质][溶质]#]，。优选地，制剂中的共溶剂是惰性的、无反应性的，并可与羧酸酯底物混溶，其中共溶剂不是所述酶催化剂的底物。优选地，共溶剂是一种有机醇，其不含可发生酶催化过水解的酯基。如本文所用，“醇”是含有至少一个羟基部分的分子。优选地，在混合或接触多组分系统的组分后，共溶剂在其终浓度下也是可溶的。然而，据报道，在log P小于约2的有机溶剂中的生物催化通常会对酶的活性产生不利影响(例如，通过使酶组分失活(参见例如C. Laane等人，Biotechnol. Bioeng. 30 81-87 (1987)以及 Cowan, D. Α.禾口 Plant, Α. , Biocatalysis in Organic Phase Systems, Biocatalysis at Extreme Temperatures 第 7 章，Kelly, R. W. W.禾口 Adams, Μ·编辑，Amer. Chem. Soc. Symposium Series, Oxford University Press, New York, NY,第 86-107 页 (1992)) 0因此，通过加入包含醇的共溶剂，将带来出乎意料的积极效果。本发明方法和系统的这些和其他有益效果将在下文中更全面地讨论。在一个实施方案中，提供了一种制备过氧羧酸的方法，包括(a)提供第一组分，所述第一组分包含(i)羧酸酯底物；
(ii)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有糖酯酶家族 7 (CE-7)特征基序的酶，所述特征基序通过CLUSTALW与SEQ ID NO 2比对，并包含；(1)与SEQ ID NO 2的118至120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；(2)与SEQ ID NO 2的179至183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；和(3)与SEQ ID NO 2的298至299对应的氨基酸位置处的HE基序；所述酶包含与SEQ ID NO 2至少30%的氨基酸同一性；以及(iii)至少一种共溶剂，所述共溶剂包含log P小于约2的有机溶剂，其中log P 定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P =[溶质]^l/[溶质]&并且其中所述至少一种共溶剂不是所述酶催化剂的底物；其中所述第一组分为(i)至(iii)的基本上无水的混合物；(b)提供第二组分，所述第二组分包含过氧源的水溶液；以及(c)将所述第一组分和所述第二组分混合以形成含水的反应混合物，其中所述共溶剂使含水反应混合物中的羧酸酯底物溶解，而不会使酶催化剂实质上丧失过水解活性，从而制备过氧羧酸。在另一方面，提供了一种表面消毒的方法，其包括实施上述方法，还包括将所述含有过氧羧酸的含水反应混合物施用到表面上以进行消毒或漂白的步骤。在另一方面，提供了一种处理衣物的方法，其包括实施上述方法，还包括将所述含有过氧羧酸的含水反应混合物施用于衣物以进行漂白、脱色、除臭、卫生处理、消毒、或其组合的步骤。本发明的另一方面是一种用于制备过氧羧酸的多组分系统，包括(a)提供第一组分，所述第一组分包含⑴羧酸酯底物；(ii)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有CE-7特征基序的酶，所述特征基序通过CLUSTALW与SEQ ID NO 2比对，并包含；(1)与SEQ ID NO 2的118至120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；(2)与SEQ ID NO 2的179至183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；禾口(3)与SEQ ID NO 2的四8至299对应的氨基酸位置处的HE基序；所述酶包含与SEQ ID NO 2至少30%的氨基酸同一性；以及(iii)至少一种共溶剂，所述共溶剂包含log P小于约2的有机溶剂，其中log P 定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P =[溶质]￠￠/[溶质]P并且其中该共溶剂不是所述酶催化剂的底物；其中所述第一组分为(i)至(iii)的基本上无水的混合物；以及(b)提供第二组分，所述第二组分包含过氧源的水溶液；其中混合所述第一组分和所述第二组分以制备包含过氧羧酸的含水反应混合物， 并且其中所述共溶剂使含水反应混合物中的羧酸酯底物溶解，而不会使酶催化剂实质上丧失过水解活性。用于分离和组合本文所述的第一和第二组分的多组分包装/递送系统的设计通常将取决于各反应组分的物理形式。在一个实施方案中，可使用任何适于液-液体系的递送系统。在另一个实施方案中，本发明的两组分过酸生成系统包括含有本发明的第一组分的第一容器和含有本发明的第二组分的第二容器。举例来说，容器和/或包装系统的典型实例可包括单独的瓶子、单独的瓶子包装成的单个套件、双室分配瓶(如挤压瓶、喷雾瓶等)、刚性或非刚性双室分配包、单独的包、以及可溶性或可降解性双室分配包(参见美国专利 4，678，103,4, 585，150,6, 223，942,5, 954，213,6, 758，411,5, 862，949,5, 398，846、 6，995，125、和 6，391，840，已公布的美国专利申请 2005/0139608 和 2002/0030063，以及PCT 公开W000/61713、W002/22467、和W02005/035705)。在一个实施方案中，递送系统为双室喷雾瓶。在另一个实施方案中，酶催化剂包含选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO :8,SEQ ID NO :10、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO :14,SEQ ID NO :16,SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、和 SEQ ID NO :74 的
氨基酸序列或通过所述氨基酸序列一个或多个氨基酸的置换、删除、和增加得到的具有过水解酶活性的基本上类似的酶。在另一个实施方案中，所述具有过水解酶活性的基本上类似的酶包含与选自SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12,SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :72、 SEQ ID N0:73、和SEQ ID NO :74的一种或多种氨基酸序列至少30%、优选地至少33%、更优选地至少40 %、更优选地至少50 %、甚至更优选地至少60 %、甚至还更优选地至少70 %、 甚至还更优选地至少80 %，甚至还更优选地至少90 %、91 %、92 %、93%、94%、95%、96 %、 97%、98%、或 99%的同一性。在一个方面，用于本发明方法和多组分系统的羧酸酯底物选自(a) 一种或多种具有下列结构的酯[XJmR5其中X为由式Ii6C(O)O表示的酯基；R6为任选地由羟基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7直链、支链或环状烃基部分，其中&任选地包含一个或多个醚键，其中&为C2至C7 ；R5为任选地由羟基取代的Cl至C6直链、支链或环状烃基部分，其中&中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基，并且其中&任选地包含一个或多个醚键；m为1至&中的碳原子数，在25°C下，所述一种或多种酯在水中具有至少5ppm的溶解度；(b) 一种或多种具有下列结构的甘油酯
权利要求
1.制备过氧羧酸的方法，所述方法包括(a)提供第一组分，所述第一组分包含(i)羧酸酯底物；( )具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有糖酯酶家族7 (CE-7)特征基序的酶，所述特征基序通过CLUSTALW与SEQ ID NO 2比对并包含(1)与SEQID NO 2的118-120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；(2)与SEQID NO 2的179-183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；以及(3)与SEQID NO 2的298-299对应的氨基酸位置处的HE基序；所述酶包含与SEQ ID NO 2至少30%的氨基酸同一性；以及(iii)至少一种共溶剂，所述共溶剂包括log P小于约2的有机溶剂，其中log P被定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P =[溶质]￠￠/[溶质]&并且其中所述至少一种共溶剂不是所述酶催化剂的底物；其中所述第一组分是(i)-(iii)的基本上无水的制剂；(b)提供第二组分，所述第二组分包含过氧源的水溶液；以及(c)将所述第一组分与所述第二组分混合以形成含水的反应制剂，其中所述共溶剂使所述含水反应制剂中的所述羧酸酯底物溶解，而不会使所述酶催化剂实质上丧失过水解活性，从而制备过氧羧酸。
2.对表面进行消毒的方法，所述方法包括将在权利要求1的步骤(c)中形成的所述含水反应制剂施用到所述表面上的步骤。
3.处理衣物或纺织物的方法，所述方法包括将在权利要求1的步骤(c)中形成的所述含水反应制剂施用到所述衣物或纺织物上以进行漂白、脱色、除臭、卫生处理、消毒或它们的组合的步骤。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中通过喷雾将所述含水反应制剂施用到所述表面或所述衣物上。
5.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述第一组分与所述第二组分以约1 1至约 1 10的重量比混合。
6.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述共溶剂以约20重量％至约80重量％的量存在于所述第一组分中。
7.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述底物以所述第一组分的约10重量％至约 60重量％的量存在于该组分中。
8.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述第一组分包含约55重量％的羧酸酯底物、 约40重量％的共溶剂、约0. 3重量％的酶催化剂和约2. 5重量％的填料，并且其中所述第二组分包含约95重量％的水、约1. 5重量％的碳酸氢钠和约1重量％的过氧源。
9.根据权利要求8的方法，其中所述第一组分包含约55.5重量％的甘油三乙酸酯、约 41重量％的三丙二醇甲醚、约0.3重量％喷雾干燥的酶粉、以及约2.5重量％的热解法二氧化硅，其中所述酶粉包含那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌过水解酶或者那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌过水解酶的变异衍生物，所述变异衍生物具有一个或多个提高所述过水解活性的点突变，并且其中所述第二组分包含约96重量％的水、约0. 2重量％的过氧化氢稳定剂、以及约3. 2重量％的包含30%过氧化氢的溶液。
10.根据权利要求1或2的方法，其中在混合所述第一组分和所述第二组分以形成含水反应制剂时，所述羧酸酯底物的初始浓度为约IOOmM,所述过氧源的初始浓度为约IOOmM, 并且所述酶催化剂的初始浓度为约0. lmg/mL。
11.根据权利要求1或3的方法，其中在混合所述第一组分和所述第二组分以形成含水反应制剂时，所述羧酸酯底物的初始浓度为约10mM，所述过氧源的初始浓度为约10mM，并且所述酶催化剂的初始浓度为约0. 01mg/mL。
12.根据权利要求7的方法，其中所述羧酸酯底物包含甘油三乙酸酯，所述过氧源包含过氧化氢，并且所述酶催化剂包含选自SEQ ID N0:16和SEQ ID NO :74的氨基酸序列。
13.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述羧酸酯底物在水中具有小于约lOOmg/mL 的溶解度。
14.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述酶还包含在与SEQID NO :2的179-183对应的氨基酸位置处的LXD基序。
15.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化剂包含选自SEQID NO 14和SEQ ID NO 73的氨基酸序列。
16.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述共溶剂包括三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、 丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1，3-丙二醇、或它们的任何组合。
17.根据权利要求16的方法，其中所述共溶剂包括三丙二醇甲醚。
18.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述过氧羧酸为C3-Cltl过氧羧酸。
19.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述过氧羧酸包括过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过β -羟基丁酸、或它们的任何组合。
20.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化剂以微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶的形式提供。
21.权利要求20的方法，其中所述酶催化剂被固定在可溶或不溶解的支持体之中或之上。
22.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化剂没有过氧化氢酶活性。
23.用于制备过氧羧酸的多组分系统，所述多组分系统包括(a)提供第一组分，所述第一组分包含(i)羧酸酯底物；( )具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有CE-7特征基序的酶，所述特征基序通过CLUSTALW与SEQ ID NO 2比对并包含(1)与SEQID NO 2的118-120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；(2)与SEQID NO 2的179-183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；以及(3)与SEQID NO 2的298-299对应的氨基酸位置处的HE基序；所述酶包含与SEQ ID NO 2至少30%的氨基酸同一性；以及(iii)至少一种共溶剂，所述共溶剂包括log P小于约2的有机溶剂，其中log P被定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P =[溶质]￠￠/[溶质]&并且其中所述共溶剂不是所述酶催化剂的底物；其中所述第一组分是(i)-(iii)的基本上无水的制剂；以及(b)提供第二组分，所述第二组分包含过氧源的水溶液；其中混合所述第一组分和所述第二组分以制备包含过氧羧酸的含水反应制剂，并且其中所述共溶剂使所述含水反应制剂中的所述羧酸酯底物溶解，而不会使所述酶催化剂实质上丧失过水解活性。
24.根据权利要求23的系统，所述系统还包括用于储存所述第一组分的第一隔室和用于储存所述第二组分的第二隔室。
25.根据权利要求M的系统，所述系统还包括混合隔室，其用于接纳来自所述第一隔室的所述第一组分中的至少一些和来自所述第二隔室的所述第二组分中的至少一些，从而允许形成包含所述第一组分中的至少一些和所述第二组分中的至少一些的混合物。
26.根据权利要求25的系统，其中所述第一组分中的所述至少一些与所述第二组分中的所述至少一些以约1 1至约1 10的重量比混合。
27.根据权利要求沈的系统，所述系统还包括用于从所述混合隔室分配所述含水反应制剂的喷嘴。
28.根据权利要求27的系统，所述系统还包括喷嘴，所述喷嘴用于接纳来自所述第一隔室的所述第一组分中的至少一些和来自所述第二隔室的所述第二组分中的至少一些，并用于同时分配所述第一组分中的至少一些和所述第二组分中的至少一些。
29.根据权利要求23的系统，其中用喷嘴将所述第一组分和所述第二组分递送到表面上，从而允许所述第一组分与所述第二组分在所述表面上混合。
全文摘要
本文公开了双组分酶法过酸生成系统以及此类系统的使用方法，其中所述第一组分包含由至少一种具有过水解活性的酶催化剂、羧酸酯底物和共溶剂组成的制剂，并且其中所述第二组分包含在过氧源的水溶液。所述两种组分混合可生成可用作如消毒剂或漂白剂的含水过酸制剂。具体地讲，有机共溶剂用于控制含底物组分的粘度，并提高所述底物在含水反应制剂中的溶解度，而不会使所述酶催化剂实质上丧失过水解活性。
文档编号C11D3/00GK102239256SQ200980148575
公开日2011年11月9日 申请日期2009年10月1日 优先权日2008年10月3日
发明者D·G·迪皮特罗, E·C·罕, R·A·雷诺, R·迪科西莫, W·R·卡希尔 申请人:纳幕尔杜邦公司