专利名称：一种耐有机溶剂高活性脂肪酶产生菌及其所产脂肪酶的基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程与酶工程技术领域，具体涉及一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其耐有机溶剂脂肪酶的基因，以及该耐有机溶剂脂肪酶在有机相中催化拆分手性醇的应用。
背景技术：
脂肪酶(EC3. 1. 1.幻是一种酯键水解酶，它可在油水界面催化长链甘油三酸酯水解形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸，在洗涤、制革、食品、生物化工、造纸、医药、环保等行业被广泛应用。脂肪酶在有机相中可以完成酯化、交换及转酯等反应，并具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性，尤其是它的立体选择催化特性，可以用于化学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等。近年来，国内外学者已经致力于应用脂肪酶在有机体系中实现手性化合物，尤其是药物中间体的立体选择性水解或拆分，如利用微生物脂肪酶可完成酮基布洛芬、反应停、心得安等手性药物的立体选择性水解或拆分。与传统的化学方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反应条件温和、节省能源、专一性强、副反应少、产品纯度高、反应步骤简单、不需手性源、产品成本低等优点。
脂肪酶在有机溶剂中容易变性或使酶活力下降，虽然国内外许多学者已经研究了不同方法来增加酶在有机溶剂中的稳定性，但其还是无法满足工业化的需求。因此寻找天然耐有机溶剂的脂肪酶，使其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性，已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐有机溶剂脂肪酶的产生菌、耐有机溶剂脂肪酶、耐有机溶剂脂肪酶基因以及该脂肪酶在有机相中催化手性醇拆分的应用。为了实现本发明的目的，本发明首先从油污土壤等样品中筛选获得一株有机溶剂脂肪酶产生菌，分类命名为洋葱伯克霍尔德氏菌^zr姑oAferia cepacia RQ_3，保藏日期为 2010年12月5日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏登记号为 CCTCC NO :M 2010330。本发明对洋葱伯克霍尔德氏菌^zr姑Weria cepacia RQ_3的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阴性菌株，菌落呈浅黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润；显微镜观察菌体为杆菌，0. 8 1. OX 1. 6 3. 2_，专性好氧，生长的最适温度为30°C !35°C。其生理生化特性表现在不出现反硝化反应、明胶反应结果为阳性，氧化酶阳性，可分解脂肪，可利用 D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麦芽糖。经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，Sim值为0.535 (24h培养)，结果显示该菌属号Burkholderia i ；16S rDNA序列分析结果表明，该菌株与数据库中多株^zr姑Weriacepacia菌的同源性为99%。综合BIOLOG和16S rDNA分析结果，HMI鉴定％Burkholderia cepacia，^^ 为 Burkholderia cepacia RQ-3。imMMBurkholderia cepacia RQ_3进行了产酶条件优化，优化后产酶量高达 71 U/mL，比优化前21. 9 U/mL提高了 2. 2倍。本发明对该菌产生的胞外酶进行了纯化，经过一步Wienyl-S^harose FF层析，分离纯化得到电泳纯的耐有机溶剂脂肪酶，命名为脂肪酶RQ-3，纯化后脂肪酶的比活性达到 4142.3 U/mgo本发明对脂肪酶RQ-3进行了酶学性质的研究，实验证明该脂肪酶对多种有机溶剂都具有良好的耐受性，有机溶剂体系(十六烷、十四烷、异丙醇、乙醇等)中脂肪酶的稳定性提高，半衰期延长。脂肪酶RQ-3的最适反应pH为9.0，在pH 6. 0 10. 0的范围具有很高的稳定性。其最佳反应温度为40°C，此酶的最佳人工底物为对硝基苯酚豆蔻酯(C14)。本发明分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的编码基因，它具有SEQ ID
NO :1所示的核苷酸序列:iatggccaggacgatgcgttccagggtggcggcaggggtagtggcatgcgcgatgagcatcgcgccgttcgcggggacgaccgcggtgatgacgctcgcgacgacgcacgcggcaatggcggccaccgcgcccgccgctggctacgcggcgacgcgttacccgatcatcctcgtgcacgggctctcgggtaccgacaagtaCgCCggCgtgctcgagtattggtacggcatccaggaggacctgcaacagaacggtgcgaccgtctacgtcgcgaacctgtcgggtttccagagcgacgacggcccgaacgggcgcggcgaacagttgctcgcttacgtgaagacggtgctcgcggcgacgggggcgaccaaggtcaatctcgtcggtcacagccagggcggcctctcgtcgcgctatgttgctgccgtcgcgcccgatctcgttgcgtcggtgacgacgatcggcacgccgcatcgcggctccgaattcgccgacttcgtgcaggacgtgctcgcgtacgatccgaccgggctttcgtcatcggtgatcgccgcgttcgtcaatgtgttcgggatcctgacgagcagcagccacaacgccaaccaggacgcgctcgccgcactgcagacgctgaccaccgcacgggccgccacctacaaccagaactatccgagcgcgggcctgggtgcgccgggcagttgccagaccggtgcgccgaccgaaaccgtcggcggcaacacgcacctgctgtattcgtgggccggcacggcgatccagccgacgctctccgtgttcggcgtcacgggcgcgacggacacgagcacccttccgctcgtcgatccggcgaacgtgctcgacctgtcgacgcttgcgctgttcggcaccggcacggtgatgatcaaccgcggctccgggcagaacgacgggctcgtgtcgaaatgcagtgcgctgttcggcaaggtgctgagcacgaactacaagtggaaccacctcgacgagatcaaccagctgctcggcgtgCgCggCgCgt
atgcggaaga tccggtcgcg gtgatccgca cgcatgcgaa ccggctgaag ctggcgggcg tgtaa ^/] 因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过PCR法分离克隆了这一耐有机溶剂脂肪酶基因，DNA全序列分析结果表明，该耐有机溶剂脂肪酶基因全长1095个核苷酸，编码364今UMM,与Burkholderia sp. MC16-3脂肪酶基因同源性为99. 2%，氨基酸序列同源性为99. 2% (氨基酸差异为AlO V ；V13 A ；A200 T)。其氨基酸序列示于SEQ ID NO 2 :Met Ala Arg Thr Met Arg Ser Arg Val Ala Ala Gly Val Val Ala Cys Ala Met Ser lie Ala Pro Phe Ala Gly Thr Thr Ala Val Met Thr Leu Ala Thr Thr His Ala Ala Met Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ala Gly Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro lie lie Leu Val His Gly Leu Ser Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Glu Tyr Trp Tyr Gly lie Gln Glu Asp Leu Gln Gln Asn Gly Ala Thr Val Tyr Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Thr Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly LeuSer SerArgTyrValAlaAla ValAlaProAspLeuValAlaSerValThrThrlie GlyThr ProHisArgGlySerGlu PheAlaAspPheValGlnAspValLeuAlaTyrAsp ProThr GlyLeuSerSerSerVal lieAlaAlaPheValAsnValPheGlylieLeuThr SerSer SerHisAsnAlaAsnGln AspAlaLeuAlaAlaLeuGlnThrLeuThrThrAla ArgAla AlaThrTyrAsnGlnAsn TyrProSerAlaGlyLeuGlyAlaProGlySerCys GlnThr GlyAlaProThrGluThr ValGlyGlyAsnThrHisLeuLeuTyrSerTrpAla GlyThr AlalieGlnProThrLeu SerValPheGlyValThrGlyAlaThrAspThrSer ThrLeu ProLeuValAspProAla AsnValLeuAspLeuSerThrLeuAlaLeuPheGly ThrGly ThrValMetlieAsnArg GlySerGlyGlnAsnAspGlyLeuValSerLysCys SerAla LeuPheGlyLysValLeu SerThrAsnTyrLysTrpAsnHisLeuAspGlulie AsnGln LeuLeuGlyValArgGly AlaTyrAlaGluAspProValAlaVallieArgThr HisAla AsnArgLeu Lys LeuAla Gly Val
本发明还提供耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在有机相酶催化手性醇反应中的应用。所述的有机相酶催化反应可以为拆分1-苯乙醇反应。所述的耐有机溶剂脂肪酶在有机溶剂正己烷体系中，催化底物1-苯乙醇和乙烯乙酸酯进行酯交换反应，转化率达45 50%，^^^值 >99% ο本发明的有益效果在于菌株^zr姑Weria cepacia RQ_3的耐有机溶剂脂肪酶 RQ-3产率较高，发酵36 h脂肪酶活力达到71 U/mL;耐有机溶剂脂肪酶RQ-3易纯化、比活高，经过一步疏水层析后比活达到4142. 3U/mg;该脂肪酶作用pH范围广、温度稳定性良好， 在疏水性和亲水性有机溶剂中都有较好的耐受性，表明其在双相和有机相催化尤其是手性拆分方面有很好的应用前景。
图1显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1，Marker ；泳道 2，粗酶液；泳道3，纯酶液(经疏水层析后得到的纯酶液)；
图2显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的最适反应pH ；
图3显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的pH稳定性(在各pH条件下放置Ih后的剩余酶活); 图4显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的最适反应温度；
图5显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的温度稳定性(在各温度条件下放置Ih后的剩余酶
活)；
图6显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的底物特异性，其中p-Nitrophenyl acetate (C2)为对硝基苯酚乙酸酯，p-Nitrophenyl butyrate (C4)为对硝基苯酚丁酸酯，p-Nitrophenyl caprate (C8)为对硝基苯酚辛酸酯，p-Nitrophenyl decanoate (ClO)为对硝基苯酚癸酸酉旨，p-Nitrophenyl myristate (C14)为对石肖基苯酷豆蓮酸酉旨，p-Nitrophenyl palmitate (C16)为对硝基苯酚棕榈酸酯，p-Nitrophenyl stearate (C18)为对硝基苯酚硬脂酸酯 (C18)。
具体实施例方式实施例一本实验说明产耐有机溶剂脂肪酶天然菌株的筛选程序。初筛采用如下方法以植物油为唯一碳源，不同浓度环己烷、甲苯、DMSO等有机溶剂为筛选压力从油污土壤等样品中筛选获得耐有机溶剂极端微生物。采用吐温80平板培养基，具体配方为酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L,NaCl 10g/L，吐温80 10mL/L, CaCl2 1 g/ L，琼脂20 g/L。将所筛选到的耐有机溶剂微生物接种于吐温80平板，根据沉淀圈与菌落大小的比值，初步筛选脂肪酶产量高的菌株。此方法筛选到具有脂肪酶产量高的耐有机溶剂极端微生物5株。为了进一步检测所分泌脂肪酶的溶剂耐受性，对5株菌的脂肪酶产生能力和所产脂肪酶的耐有机溶剂性质进行全面的检测。将所筛选到的高活力菌株接种到产酶发酵培养基，具体配方为糊精 5 g/L，蛋白胨 15 g/L, K2HP04 3H20 1. 8g/L，MgS04 7H20 0.7 g/L, 橄榄油5mL/L，pH 8. 0。培养温度为30°C，培养时间为36 h，摇床转速为180 rmp。发酵结束后，8000 rmp 4°C离心lOmin，取上清为粗酶液。取粗酶液1. 5 mL分别加入0. 5mL的十六烷、壬烷、正辛烷、异辛烷、正庚烷、正己烷、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMS0)，于30°C、150 rpm震荡处理M h，以pNPP为底物检测脂肪酶剩余酶活； 选取具有最高剩余活力的菌株作为耐有机溶剂脂肪酶产生菌株。脂肪酶活力检测方法(以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物)为A溶液50mM的 Na2HPO4 12H20-NaH2P04 2H20 缓冲液(pH 7. 0)，其中含有 0. 6%(m/v)Triton X-100 和 0. 1% (m/v)的阿拉伯树胶；B溶液称取3 mg的对硝基苯酚棕榈酸酯(p-Nitrophenylpalmitate， pNPP)，溶解在1 mL的异丙醇中；A溶液与B溶液按体积比9:1制成浓度为16. 5 mM的对硝基苯酚棕榈酸酯底物溶液。反应体系中先加入10 ？ L稀释适当倍数的酶液，以灭活的酶液为空白对照，再加入MO ？ L底物溶液，在酶标仪中进行反应，反应温度为40°C，反应时间为10 min，在410 nm波长下检测反应结束时生成的对硝基苯酚(pNP)的量。每1个单位 (U)脂肪酶酶活定义为，在相应条件下，每分钟催化产生1 ？ mol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。通过酶活性检测以及有机溶剂稳定性检测，其中一株具有优良耐受性的脂肪酶产生菌株所产脂肪酶活力达到21. 9U/mL，该菌株编号RQ-3。实施例二
本实验说明耐有机溶剂脂肪酶产生菌RQ-3的生物学性质、鉴定及其产酶条件研究。菌株RQ-3的生物学性质该菌株为革兰氏阴性菌株，菌落呈浅黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润；菌体为杆菌，0. 8 1. OX 1. 6 3. 2mm，专性好氧，生长的最适温度为30°C 350C。其生理生化特性表现在不出现反硝化反应、明胶反应结果为阳性，氧化酶阳性，可分解脂肪，可利用D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麦芽糖。菌株RQ-3的菌种鉴定经BI0L0G自动细菌鉴定仪鉴定，Sim值为0. 535 (24h培养)，鉴定结果显示该菌属于ifcr姑Weria属；后经16S rDNA序列分析，表明该菌株与数据库中多株^zr姑οAferia cepacia菌的同源性为99%。综合BI0L0G和16S rDNA分析结果， 1 1 ^ Burkholderia cepacia, ^^ % Burkholderia cepacia RQ-30Burkholderia cepacia RQ_3产酶条件研究采用单因素替换法研究发酵培养基的碳源(葡萄糖、蔗糖、玉米粉、甘油、糊精)、氮源(蛋白胨、酵母膏、大豆粉、尿素、硝酸钠、 硫酸铵)、诱导剂(花生油、橄榄油、大豆油、玉米油)、表面活性剂(Tween 80、SDS、Triton X-100、阿拉伯树胶)、初始pH，接种量，发酵温度，装液量等对^zr姑Weria cepacia RQ-3产脂肪酶的影响，得出优化后的培养基组分为蔗糖5 g/L，大豆粉10 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 7g/L，K2HPO4 ·3Η20 1.8 g/L, Tween 80 5 mL/L，橄榄油 7.5 mL/L，发酵初始 pH 8. 0 ；优化后的培养条件为接种量^)(V/V)，发酵温度30 ？ C，摇床转速180 rpm，装液量40 mL/250 mL。在此优化条件下，发酵36 h后，酶活力达到71 U/mL，与初始培养基及培养条件下酶活 21.9U/mL相比，提高了 2. 2倍。实施例三
本实验说明耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的纯化程序。Burkholderia cepacia RQ-3在产酶培养基中培养36 h后，发酵液在8，000 rpm，4°C离心10 min，取上清为粗酶液；将以上处理得到的酶液，采用Phenyl-S印harose FF 层析柱进行纯化，以0. 02 M PBS (pH 8. 0)+20%乙醇和0. 02 M PBS (pH 8. 0)+50%乙醇溶液进行洗脱，收集脂肪酶活力峰。通过SDS-PAGE电泳图(图1)，发现一步纯化后的耐有机溶剂脂肪酶(命名为脂肪酶RQ-3)已达电泳纯，该脂肪酶亚基分子量约为33 kDa。纯化倍数为 15. 5倍，回收率为50%，纯化后的脂肪酶比活达到4142. 3 U/mg，汇总见表1。 表1耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的纯化步骤及结果
权利要求
1.一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其特征在于该菌为洋葱伯克霍尔德氏菌，命名为 Burkholderia cepacia RQ_3，保藏日期为2010年12月5日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏登记号为CCTCC NO =M 2010330。
2.根据权利要求1所述的耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其特征在于所产耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。
3.根据权利要求1所述的耐有机溶剂产生菌，其特征在于所产耐有机溶剂脂肪酶RQ-3 氨基酸序列为SEQ ID NO: 2，其由SEQ ID NO: 1中所述的核苷酸序列编码。
4.根据权利要求1所述的耐有机溶剂脂肪酶产生菌产生的耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在手性醇拆分体系中的应用。
5.根据权利要求5所述的耐有机溶剂脂肪酶产生菌产生的耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在手性醇拆分体系中的应用，其特征在于所述耐有机溶剂脂肪酶在有机溶剂体系中，可完成手性醇苯乙醇的手性拆分。
全文摘要
本发明属于微生物工程与酶工程技术领域，具体涉及了一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌BurkholderiacepaciaRQ-3，其耐有机溶剂脂肪酶的基因，以及该耐有机溶剂脂肪酶在有机相中催化拆分手性醇的应用。该菌株为革兰氏阴性菌株，其保藏登记号为CCTCC No.M2010330，其耐有机溶剂脂肪酶产量高，具有较宽的pH适应范围，温度稳定性较好，对多种有机溶剂有较好的耐受性，其在手性醇拆分中具有良好的应用前景。
文档编号C12N1/20GK102174432SQ201110007349
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者何冰芳, 吴斌, 姚长进, 柏中中, 王瑞强 申请人:南京工业大学