专利名称：一种微生物柴油的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物能源领域，尤其涉及一种新型生物柴油一微生物柴油的制备方法，特指以微生物油脂为原料，首先分离纯化出更具价值的功能性多不饱和脂肪酸 (PUFAs)，剩余脂肪酸制备微生物柴油。
背景技术：
微生物油脂(Microbialoils)，亦称单细胞油脂(SCO = Single Cell Oil)。即 微生物在一定条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生大 量的油脂，主要是由不饱和脂肪酸组成的甘油三酯(TAG)，在脂肪酸组成上与植物油如菜籽 油、棕榈油、大豆油等相似，是以C16和C18为主的脂肪酸。在一定的条件下，很多微生物如细 菌、霉菌、酵母菌及藻类等可在菌体内产生大量油脂，有的干菌体含油量高达60%以上。随 着工业生物技术的发展，微生物油脂发酵从原材料到过程都不断取得新进展，美国国家可 再生能源实验室(NREL)的报告特别指出微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济 的重要研究方向。微生物油脂发酵周期短，不受场地、季节、气候变化等的影响，一年四季都 可连续生产，而且产油微生物菌种资源丰富，能利用和转化各种农林废弃木质纤维素原材 料，对农业大国具有特殊的意义。以微生物油脂为原料，甲醇为酯化剂，以氢氧化钠或氢氧化钾为催化剂，经酯交换 反应制得微生物柴油，即脂肪酸甲酯。微生物柴油是生物质能的一种形式，它由可再生的微 生物油脂原料经过合成而得到的长链脂肪酸甲酯，它的性质与石化柴油非常相似，微生物 柴油作为液体燃料，是优质的石化柴油代用品。
发明内容
本发明提供一种微生物柴油的制备方法，以富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂为 原料，首先分离纯化出更具价值的多不饱和脂肪酸(PUFAs)，剩余脂肪酸制备微生物柴油。 使其在生产微生物柴油的同时，生产出更具价值的功能性脂肪酸，以提高微生物柴油的综 合经济效益，使得合成工艺更具经济竞争性。本发明的这种微生物柴油的制备方法以高产脂微生物菌种在一定的培养条件下 通过发酵培养制得富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂，并通过下列方法制取微生物油脂的制取微生物发酵培养完成后，将发酵液离心收集菌丝体，菌丝体沉 淀按每克菌6mL的比例加入4mol/LHCl，振荡混勻，室温放置30min后，沸水浴3min，-20°C 速冷，加入2倍体积氯仿甲醇(1 1)提取液，充分振荡后，5000r/min离心5min，取氯仿 层，加等体积0. 1 % NaCl溶液，混勻，5000r/min离心5min，取氯仿层，旋转蒸发回收氯仿，即 得微生物油脂；混合脂肪酸的制备在微生物油脂中加入37% NaOH-乙醇溶液，置标准磨口圆底 烧瓶，在80°C水浴中回流皂化2h，得皂化液，室温冷却后，加适量水使皂完全溶解，用10% HCl酸化至pH2-3，加正己烷萃取，分层，去下层水层，水洗上层至中性，加无水硫酸钠脱水，减压抽滤，旋转蒸发回收正己烷，即得混合脂肪酸；分离、纯化多不饱和脂肪酸可采用尿素包合法，尿素中加入95%乙醇，在磁力 搅拌器上搅拌，待全部溶解后加入混合脂肪酸搅拌均勻，按照混合脂肪酸尿素乙醇= 1 3. 5 10. 5(w/w/w)混合比例热回流40min，室温冷却，于-5°C冰箱放置20h，减压抽滤， 滤液加入适量正己烷，用10% HCl酸化至pH2-3，加入适量水，充分萃取，分离有机相，用正 己烷多次萃取水相，合并有机相，水洗至中性，用无水硫酸钠脱水，减压抽滤，旋转蒸发回收 有机溶剂，得到富集后的多不饱和脂肪酸(PUFAs)；剩余脂肪酸制备微生物柴油脂肪酸lO-lOOg，加入甲醇2.0_50g，加入浓硫酸 1. 0-3. Owt %作催化剂，酯化反应温度控制在60-100°C，反应2-6h，减压蒸馏回收过量的甲 醇，即得微生物柴油；斜面培养基(PDA)配方马铃薯浸出液20%，琼脂1.8%，葡萄糖2.0%，自然pH; 初筛平板培养基配方马铃薯浸出液20%，琼脂1. 8%，葡萄糖2. 0，自然pH ；种子培养基配 方玉米淀粉4.0%，葡萄糖 2.0%,KH2PO4 0. 1%,MgSO4 0. 01 %，酵母膏 0. 1 %，尿素 0. 1 %， PH6.4-6.7;发酵产脂培养基配方碳源为葡萄糖45-100g/L，氮源为(NH)2SO4 0. 5g/L, KH2PO4 1. Og/L, K2HPO4 1. Og/L, MgSO4 1. 0g/L，柠檬酸三钠 2. 0g/L，pH 6. 0o所述高产脂微生物菌种特指丝状真菌Mortierella isabellina和Blakesleea trispora。所述微生物油脂的制取可采用索氏抽提法、有机溶剂法或低温压榨法，对微生物 油脂的制取方法不受其限制。所述分离纯化多不饱和脂肪酸可采用低温冷冻结晶法、分子蒸馏法、银离子络合 法，对分离纯化方法不受其限制。所述制备微生物柴油的催化剂可以是浓盐酸、磷酸、十二烷基苯磺酸、草酸、冰乙 酸、固体酸或生物酶。本发明提供的这种微生物柴油的制备方法的优点在于针对微生物油脂具有相当 数量的多不饱和脂肪酸，先分离纯化出功能性多不饱和脂肪酸，剩余脂肪酸作为制备微生 物柴油的原料，使其在生产微生物柴油的同时，生产出更具价值的功能性脂肪酸，提高了微 生物柴油的综合经济效益，使得整个合成工艺更具经济竞争性。同时，利用微生物油脂生产 微生物柴油具有生产原料易得、不受天气温度、季节的影响，可以工业化生产。
附图为本发明一种微生物柴油的制备方法的工艺流程图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例1 发酵培养微生物油脂(1)菌株活化将实验室保藏的菌种Mortierella isabellina接种于斜面培养基 上，在28°C培养5d，形成深黄色分生孢子，活化；然后再利用PDA平板培养基划线，于28°C 培养5d，形成深黄色分生孢子，待用。(2)种子培养用无菌铲铲下1块PDA平板培养基活化后的菌苔，转接于种子培养基中，于 28°C，180r/min 培养 2d。(3)摇瓶发酵将种子液以10%的接种量，接种于发酵产脂培养基中，于28°C，180r/min 培养 8d。所述斜面培养基(PDA)配方马铃薯浸出液20%，琼脂1.8%，葡萄糖2.0%，自然 pH。所述初筛平板培养基配方马铃薯浸出液20 %，琼脂1. 8 %，葡萄糖2. 0 %，自然 pH。种子培养基配方玉米淀粉4.0%，葡萄糖2.0%，KH2PO4 0. 1%, MgSO4 0.01%，酵母膏 0. 1%，尿素 0. 1 %, pH6. 4-6. 7。所述发酵产脂培养基配方碳源为葡萄糖45-100g/L，氮源为(NH)2S040. 5g/L， KH2PO4 1. Og/L，K2HPO4 1. Og/L, MgSO4 1. Og/L，柠檬酸三钠 2. Og/L，pH 6. 0o实施例2 制取微生物油脂(一)酸热法微生物发酵完成后，将发酵液离心收集菌丝体，菌丝体沉淀按每克菌6mL 的比例加入4mol/LHCl，振荡混勻，室温放置30min后，沸水浴3min，-20°C速冷，加入2倍 体积氯仿甲醇(1 1)提取液，充分振荡后，5000r/min离心5min，取氯仿层，加等体积 0. 1 % NaCl溶液，混勻，5000r/min离心5min，取氯仿层，旋转蒸发回收氯仿，即得微生物油脂。实施例3 制取微生物油脂(二)索氏抽提法微生物发酵完成后，将发酵液离心收集菌丝体，将菌丝体真空干燥脱 水，研成粉末后装入索氏抽提器，石油醚加热回流提取6-8h，旋转蒸发回收石油醚，即得微 生物油脂。实施例4 制取微生物油脂(三)有机溶剂法微生物发酵完成后，将发酵液离心收集菌丝体，菌丝体沉淀按每克菌 3mL的比例加人氯仿甲醇(1 2)提取液，充分振荡2min，再加入ImL氯仿，振荡混勻，力口 入1. 5mLH20,振荡混勻后5000r/min离心5min，取氯仿层，加等体积0. 1 % NaCl溶液，混勻， 5000r/min离心5min，取氯仿层，旋转蒸发回收氯仿，即得微生物油脂。实施例5 制备混合脂肪酸将微生物油脂中加入37% NaOH-乙醇溶液，置标准磨口圆底烧瓶，在80°C水浴中 回流皂化2h，得皂化液，室温冷却后，加适量水使皂完全溶解，用10% HCl酸化至pH2-3，加 正己烷萃取，分层，去下层水层，水洗上层至中性，加无水硫酸钠脱水，减压抽滤，旋转蒸发 回收正己烷，即得混合脂肪酸。实施例6 分离纯化多不饱和脂肪酸(PUFAs)尿素中加入95%乙醇，在磁力搅拌器上搅拌，待全部溶解后加入混合脂肪酸搅拌 均勻。按照混合脂肪酸尿素乙醇=1 3.5 10. 5 (w/w/w)混合比例热回流40min，室 温冷却，于-5°C冰箱放置20h，减压抽滤，滤液加入适量正己烷，用10% HCl酸化至pH2-3， 加入适量水，充分萃取，分离有机相，用正己烷多次萃取水相，合并有机相，水洗至中性，用 无水硫酸钠脱水，减压抽滤，旋转蒸发回收有机溶剂，得富集后的多不饱和脂肪酸(PUFAs)。实施例7 制备微生物柴油取分离纯化后的剩余脂肪酸100g，加入甲醇30g，加入浓硫酸2. Owt %，反应温度 65°C，反应6h，旋转蒸发回收过量的甲醇，即得微生物柴油。
权利要求
一种微生物柴油的制备方法，以高产脂微生物菌种在一定的培养条件下通过发酵培养制得富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂，并以富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂为原料，首先分离纯化出更具价值的多不饱和脂肪酸(PUFAs)，剩余脂肪酸制备微生物柴油，其特征在于通过下列方法制取微生物油脂的制取微生物发酵培养完成后，将发酵液离心收集菌丝体，菌丝体沉淀按每克菌6mL的比例加入4mol/LHCl，振荡混匀，室温放置30min后，沸水浴3min，-20℃速冷，加入2倍体积氯仿∶甲醇(1∶1)提取液，充分振荡后，5000r/min离心5min，取氯仿层，加等体积0.1％NaCl溶液，混匀，5000r/min离心5min，取氯仿层，旋转蒸发回收氯仿，即得微生物油脂；混合脂肪酸的制备在微生物油脂中加入37％NaOH-乙醇溶液，置标准磨口圆底烧瓶，在80℃水浴中回流皂化2h，得皂化液，室温冷却后，加适量水使皂完全溶解，用10％HCl酸化至pH2-3，加正己烷萃取，分层，去下层水层，水洗上层至中性，加无水硫酸钠脱水，减压抽滤，旋转蒸发回收正己烷，即得混合脂肪酸；分离、纯化多不饱和脂肪酸可采用尿素包合法，尿素中加入95％乙醇，在磁力搅拌器上搅拌，待全部溶解后加入混合脂肪酸搅拌均匀，按照混合脂肪酸尿素∶乙醇＝1∶3.5∶10.5(w/w/w)混合比例热回流40min，室温冷却，于-5℃冰箱放置20h，减压抽滤，滤液加入适量正己烷，用10％HCl酸化至pH2-3，加入适量水，充分萃取，分离有机相，用正己烷多次萃取水相，合并有机相，水洗至中性，用无水硫酸钠脱水，减压抽滤，旋转蒸发回收有机溶剂，得到富集后的多不饱和脂肪酸(PUFAs)；剩余脂肪酸制备微生物柴油脂肪酸10-100g，加入甲醇2.0-50g，加入浓硫酸1.0-3.0wt％作催化剂，酯化反应温度控制在60-100℃，反应2-6h，减压蒸馏回收过量的甲醇，即得微生物柴油；斜面培养基(PDA)配方马铃薯浸出液20％，琼脂1.8％，葡萄糖2.0％，自然pH；初筛平板培养基配方马铃薯浸出液20％，琼脂1.8％，葡萄糖2.0，自然pH；种子培养基配方玉米淀粉4.0％，葡萄糖2.0％，KH2PO4 0.1％，MgSO4 0.01％，酵母膏0.1％，尿素0.1％，pH6.4-6.7；发酵产脂培养基配方碳源为葡萄糖45-100g/L，氮源为(NH)2S040.5g/L，KH2PO41.0g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO41.0g/L，柠檬酸三钠2.0g/L，pH 6.0。
2.根据权利要求1所述的一种微生物柴油的制备方法，其特征在于所述高产脂微生 物菌种特指丝状真菌 Mortierella isabellina 禾口 Blakesleeatrispora。
3.根据权利要求1所述的一种微生物柴油的制备方法，其特征在于所述微生物油脂 的制取可采用索氏抽提法、有机溶剂法或低温压榨法。
4.根据权利要求1所述的一种微生物柴油的制备方法，其特征在于所述分离纯化多 不饱和脂肪酸可采用低温冷冻结晶法、分子蒸馏法、银离子络合法。
5.根据权利要求1所述的一种微生物柴油的制备方法，其特征在于所述制备微生物 柴油的催化剂可以是浓盐酸、磷酸、十二烷基苯磺酸、草酸、冰乙酸、固体酸或生物酶。
全文摘要
本发明公开了一种微生物柴油的制备方法。该方法以富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂为原料，首先分离纯化出更具价值的多不饱和脂肪酸(PUFAs)，剩余脂肪酸制备微生物柴油，它包括微生物油脂的制取、混合脂肪酸的制备、分离、纯化多不饱和脂肪酸及剩余脂肪酸制备微生物柴油。本方法在生产微生物柴油的同时，生产出更具价值的功能性脂肪酸，以提高微生物柴油的综合经济效益，使得合成工艺更具经济竞争性。
文档编号C11C3/04GK101805670SQ201010142808
公开日2010年8月18日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者任吉海, 徐振业, 杜传林, 杨建斌, 滕家良 申请人:上海中器环保科技有限公司