方法

专利名称：方法
技术领域：
本发明涉及对植物性食品和饲料产品、尤其是植物油的工业加工。本发明可用于减少或消除由叶绿素和叶绿素衍生物产生的污染。
背景技术：
叶绿素是在整个植物界广泛存在的一种绿色色素。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有相当多的叶绿素。例如，来自含油种子(例如大豆、棕榈种子或油菜籽(卡诺拉油菜)、棉籽)的植物 油和花生油通常含有一些叶绿素。然而，通常不期望植物油中存在高含量的叶绿素色素。这是因为叶绿素使油带上难看的绿色，并且在储存期间可引起油的氧化，从而导致油的变质。已采用各种方法以除去植物油中的叶绿素。在产油过程的多个阶段，包括种子破碎、油萃取、脱胶、碱处理和漂白步骤，都可除去叶绿素。然而，漂白步骤通常对于将叶绿素残留量降至可接受含量是最为有效的。在漂白期间，加热油并使其通过吸附剂以除去叶绿素和影响成品油外观和/或稳定性的其他有色化合物。用于漂白步骤的吸附剂通常为粘土。在可食用油加工行业中，采用上述步骤通常会将加工油中的叶绿素含量降至介于0.02至0.05 111之间。然而，漂白步骤由于漂白粘土的夹带作用会增加加工成本和降低油产量。粘土的使用可能会将许多有用的化合物(例如类胡萝卜素和生育酚)也从油中除去。另外粘土的使用也很昂贵，这尤其是因为用过的粘土(即废料)的处理困难、危险(易于自燃)，因而处理成本高。因而已进行了用其他办法从油中除去叶绿素的尝试，例如使用叶绿素酶。在植物中，叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)被认为参与叶绿素降解，并催化叶绿素中酯键的水解而生成脱植基叶绿素和叶绿醇。W02006009676描述了可降低组合物中叶绿素污染的一种工业方法，例如用叶绿素酶处理植物油。此方法中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色，但是可通过水萃取法或二氧化硅处理除去。叶绿素通常在用于产油的种子中以及从种子提取油的过程中部分降解。一种常见的修饰为卟啉(二氢卟酚)环失去镁离子形成称为脱镁叶绿素的衍生物(参见图I)。卟啉环上高极性镁离子的丢失导致脱镁叶绿素与叶绿素相比在理化性质上显著不同。通常在加工过程中，油中的脱镁叶绿素比叶绿素含量更丰富。脱镁叶绿素呈淡绿色，可通过与用于叶绿素类似的方法从油中除去，例如WO 2006009676中所述通过由具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，一些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，因此适于除去这两种污染物。脱镁叶绿素水解的产物为红色/褐色的脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可由脱植基叶绿素(即叶绿素水解之后)失去镁离子生成(参见图I)。WO2006009676教导了通过与脱植基叶绿素类似的方法(例如通过水萃取法或二氧化硅吸附)除去脱镁叶绿酸。
脱镁叶绿素还可通过含油种子收获和储存期间植物酶的活性或者通过精制油期间的加工条件(即热)进一步降解为焦脱镁叶绿素(参见“Behaviour of ChlorophyllDerivatives in Canola Oil Processing，，，JAOCS, Vol, no. 9 (Sept. 1993) pages837-841 ( “卡诺拉油加工过程中叶绿素衍生物的行为”，《美国油脂化学协会杂志》，第9卷，1993年9月，第837-841页))。一种可能的机制是脱镁叶绿素碳环上甲酯键的酶水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶转化。据报道来自藜(Chenopodium album)的名为脱镁叶绿酸酶的28-29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸上类似的反应，以产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图26)。焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿酸极性低，导致焦脱镁叶绿酸与脱镁叶绿酸相比具有降低了的水溶解度和增加了的油溶解度。根椐加工条件，在加工期间植物油中焦脱镁叶绿素可比脱镁叶绿素和叶绿素含量更为丰富(参见 Table 9in volume 2· 2. ofBailey’ s Industrial Oil and FatProducts (2005), 6th edition,Ed. by Fereidoon Shahidi, John Wiley&Sons (由 Fereidoon Shahidi编辑、约翰威立父子出版公司于2005年出版的《贝雷工业油脂产品》，第6版，第2.2.卷的表9))。这部分地是由于在植物材料的收获和储存期间叶绿素中镁的丢失。如果使用90°C或更高温度下的延长热处理，油中焦脱镁叶绿素的量可能会增加并且可高于脱镁叶绿素的量。也可通过在压榨和萃取之前加热含油种子以及精制过程中油脱胶和碱处理降低叶绿素含量。还观察到油中的磷脂可与镁络合，从而降低叶绿素的量。因而在许多植物油中与焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素为相对微量的污染物。因此仍然需要改进方法以从植物油中除去叶绿素和叶绿素衍生物(诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)。尤其需要一种可提高除去叶绿素和叶绿素衍生物的效率同时降低油中其他所需化合物的损失的方法。

发明内容
在一个方面，本发明提供了一种精制植物油的方法，该方法包括使油与能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶相接触的步骤，其中酶在存在至少O. I重量％磷脂的情况下与油接触。在一些实施例中，按油的总重量计，在存在低于O. 2重量％溶血磷脂(例如低于
O.15重量％、低于O. I重量％或低于O. 05重量％ )的情况下，使酶与油接触。在一个实施例中，酶在油脱胶之前与油接触。在另一个实施例中，酶在油脱胶的步骤期间与油接触。脱胶步骤可包括，例如水化脱胶、酸法脱胶、酶法脱胶和/或全脱胶/中和(例如向油中加酸，然后用碱中和)。在一些特定的实施例中，对于酶在脱胶前与油接触的情况，酶法脱胶步骤可包括使油与磷脂酶(例如磷脂酶Al、磷脂酶A2或磷脂酶C)或酰基转移酶接触。酰基转移酶可包含，例如SEQ ID NO 23的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的序列。在另一个实施例中，该方法包括使油与该酶和在单个步骤中不产生溶血磷脂的磷脂酶(例如磷脂酶C)接触。例如，该酶可在使用磷脂酶C的酶法脱胶步骤期间与油接触，即同时使用该酶和磷脂酶C。在另一些实施例中，该酶在存在至少O. 5重量％、至少I重量％、至少I. 5重量％或至少2重量％磷脂的情况下与油接触。
在另一些实施例中，该酶在低于80°C、优选地低于70°C、优选地55°C至65°C、优选地58°C至62°C (例如约60°C )的温度下与油接触。优选地，该酶在存在I至5重量％水(例如约1%或约2重量％水)的情况下与油接触。在一个实施例中，该酶在pH为6. O至
6.8(例如6. 3至6. 5)时与油接触。优选地，该方法不包括粘土处理步骤。该方法优选地还包括进行脱臭步骤以产生脱臭油和馏出液(例如含水馏出液或含氮馏出液)。通常，该方法与包括粘土处理步骤的方法相比在精制(脱臭或非脱臭)油和/或馏出夜中产生的类胡萝卜素和/或生育酚水平提闻。
在一个实施例中，该酶包括叶绿素酶、脱镁叶绿素酶、焦脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶。例如，该酶可包含SEQ ID NO :1、2、4、6或8至15的任何之一中所定义的多肽序列，或其功能片段或变体。优选地，该酶包含与SEQ ID N0:l、2、4、6或8至15的任何之一在例如至少50个氨基酸残基上具有至少75%的序列同一性的多肽序列。在特别优选的实施例中，该酶包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的序列或者与其具有至少90%序列同一性的序列。在另一方面，本发明提供可通过上述所定义的方法获得的精制植物油。在又一方面，本发明提供可通过上述所定义的方法(即如本文所述包括脱臭步骤的方法)获得的馏出液(例如含水或含氮的馏出液)。在又一方面，本发明提供上述所定义的方法，以提高通过油的脱臭获得的精制油和/或馏出液中类胡萝卜素和/或生育酚的含量。如本文所述，已发现油中叶绿素酶和相关酶的活性取决于油的磷脂含量。因此，在一个实施例中，本发明提供改进的精制油的方法，其中叶绿素酶或者相关酶在存在最低含量磷脂的情况下使用。此外，根据提高的溶血磷脂含量与降低的叶绿素酶活性相关这一事实，在一个实施例中，本发明提供改进的方法，其中该酶在存在低含量溶血磷脂的情况下使用。通过提高该酶的活性，本发明的方法有利地使叶绿素和叶绿素衍生物的除去更加容易，且通常无需粘土处理步骤。这也可能提高油中有效化合物(如生育酚和类胡萝卜素)的含量，这些化合物可在脱臭步骤中回收或存留在成品中。


图I示出涉及本发明中所用叶绿素和衍生物以及酶的各反应。图2示出拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO I)。图3示出普通小麦(Triticum aestivum)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。图4示出编码普通小麦叶绿素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)。图5不出莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQID NO 4)。图6示出编码莱茵衣藻叶绿素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)。图7示出来自拟南芥的脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)的氨基酸序列(SEQID NO 6) ο叶绿体转运肽以粗体示出。图8示出来自拟南芥的编码脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 7)。SEQ ID NO :6 的 PPH 由 SEQ ID NO :7 的残基 173 至 1627 编码。图9 不出毛果杨(Populus trichocarpa)PPH 的多妝序列(SEQ ID NO :8)。图10 示出葡萄(Vitis vinfera)PPH 的多肽序列(SEQ ID NO :9)。图11 不出蓖麻(Ricinus communis)PPH 的多妝序列(SEQ ID NO 10) 图12示出稻(Oryza sativa)(粳稻品种组)PPH的多肽序列(SEQ ID NO 11) 图13 示出玉米(Zea mays) PPH 的多肽序列(SEQ ID NO :12)。图14 不出烟草(Nicotiana tabacum)PPH 的多妝序列(SEQ ID NO 13)
图15示出稻粳稻组PPH的多肽序列(SEQ ID NO 14)。图16不出(a)小立碗藓(Physcomitrella patens)亚种PPH的多妝序列(SEQ IDNO 15)图17示意性地示出小麦(普通小麦)叶绿素酶基因与aprE信号序列的融合。图18示意性地示出包含小麦(普通小麦)叶绿素酶基因的质粒pBN_TRI_CHL。图19示意性地示出莱茵衣藻叶绿素酶基因与aprE信号序列的融合。图20示意性地示出包含莱茵衣藻叶绿素酶基因的质粒pBN_CHL_CHL。图21示出在存在不同表面活性剂(包括大豆卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯和脱水山梨糖醇三油酸酯)的情况下，用叶绿素酶处理的精制油菜籽油的样品，如实例3中所述。图22示出用或未用叶绿素酶和叶绿素添加处理的精制油或者精制油和粗制大豆油的混合物的样品，如实例4中所述。图23示出在存在不同含量卵磷脂和修饰的卵磷脂(由酰基转移酶修饰)的情况下，经叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中脱镁叶绿素含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例5中所述。图24示出在存在不同含量卵磷脂和修饰的卵磷脂(由酰基转移酶修饰)的情况下，经叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中脱镁叶绿酸含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例5中所述。图25示出在存在不同含量卵磷脂和修饰的卵磷脂(由酰基转移酶修饰)的情况下，经叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中焦脱镁叶绿素含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例5中所述。图26示出在存在不同含量卵磷脂和修饰的卵磷脂(由酰基转移酶修饰)的情况下，经叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中焦脱镁叶绿酸含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例5中所述。图27示出在存在酰基转移酶、磷脂酶C或磷脂酶Al的情况下，经普通小麦或莱茵衣藻叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中脱镁叶绿素含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例6中所述。图28示出使用吸光度检测(430nm)的HPLC色谱图，指示与如下物质相关的峰编号1 =脱植基叶绿素b ；2 =脱植基叶绿素a ；3 =新叶黄素；3’ =新叶黄素异构体；4 =新色素；5 =紫黄素；6 =黄体呋喃素；7 =玉米黄二呋喃素；8 =花黄素；8’ =花黄素异构体；
9=玉米黄呋喃素；10 =叶黄素；10’ =叶黄素异构体；10” =叶黄素异构体；11 =脱镁叶绿酸b ;12 =脱镁叶绿酸a ;13 =叶绿素b ;13’ =叶绿素b’ ；14=叶绿素a;14’ =叶绿素a’ ；15 =脱镁叶绿素b ;15’ =脱镁叶绿素b’；16= β -胡萝卜素；17 =脱镁叶绿素a ; 17’=脱镁叶绿素a’ ；18 =焦脱镁叶绿素b ；19 =焦脱镁叶绿素a。图29示出使用粘土漂白的标准精制方法和使用叶绿素酶而未经粘土处理的酶法精制加工的各阶段油中脱镁叶绿素a和焦脱镁叶绿素的含量，如实例8中所述。图30示出使用粘土漂白的标准精制方法和使用叶绿素酶而未经粘土处理的酶法精制加工的各阶段油中脱镁叶绿酸a和焦脱镁叶绿酸的含量，如实例8中所述。图31为根据本发明的一个实施例的精制油方法的图示。图32示出突变型杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，在进行翻译后修饰之后发生突变Asn80Asp(SEQ ID No. 23)。
图33示出叶绿素酶对油中脱镁叶绿素a的降解的影响。图34示出pH和水％对叶绿素酶活性的影响。图35示出脱镁叶绿素的差向异构体形式及其重排。图36示出脱镁叶绿素a差向异构体在不同pH反应4小时后的相对比率。图37示出用叶绿素酶处理油时温度对脱镁叶绿素水解的影响。图38示出温度对焦脱镁叶绿素含量的影响。图39示出温度对叶绿素和脱镁叶绿素以及焦脱镁叶绿素总含量的影响。图40示出不同混合条件对脱镁叶绿素水解的影响。图41示出在用叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素随时间和pH的变化。图42示出在用叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素a异构体比率随时间和pH的变化。图43示出在用叶绿素酶处理的油中焦脱镁叶绿素随时间和pH的变化。图44示出在用叶绿素酶处理的油中焦脱镁叶绿素酶法水解随时间和pH的变化。图45示出pH对叶绿素酶降解脱镁叶绿素的影响。图46示出pH对脱镁叶绿素a和a’差向异构体的量的影响。图47示出pH对焦脱镁叶绿素含量的影响。图48示出pH对脱镁叶绿素与焦脱镁叶绿素总含量的影响。图49示出pH对脱镁叶绿酸含量的影响。图50示出在水化脱胶方法(WDG)和全脱胶方法(TDG)中通过叶绿素处理2小时后，PH对油菜籽油中脱镁叶绿素的影响。图51示出含水量和pH对叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素的影响。图52示出含水量和pH对叶绿素酶处理的油中焦脱镁叶绿素的影响。图53示出含水量和pH对叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素差向异构体的影响。图54示出在采用不同用量叶绿素酶处理的油中，温度、pH调节和反应时间对脱镁叶绿素含量的影响。图55示出在采用不同用量叶绿素酶处理的油中，温度、pH调节和反应时间对焦脱镁叶绿素含量的影响。图56示出在采用不同用量叶绿素酶处理的油中，温度、pH调节和反应时间对脱镁叶绿素a差向异构体含量的影响。
具体实施例方式在一个方面，本发明涉及精制植物油的方法。通常，例如在叶绿素和/或叶绿素衍生物作为污染物存在的情况下，该方法用于从油中除去叶绿素和/或叶绿素衍生物，或者降低油中叶绿素和/或叶绿素衍生物的含量。叶緑素和叶緑素衍牛物所谓“叶绿素衍生物”通常是指包含卟啉(二氢卟酚)环和叶绿醇基团(尾)的化合物，包括不含镁含叶绿醇的衍生物，诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素和(含叶绿醇)叶绿素衍生物通常为绿色，这是因为有卟啉(二氢卟酹)环存在于分子中。镁从卟啉环的丢失意味着脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素颜色上比叶绿素更呈现出偏褐色。因而油中叶绿素和叶绿素衍生物的存在，可使此类油带上难看的绿色、淡绿色或褐色。在一个实施例，可用本方法以除去或降低油中存在的绿色或褐色。因此，本方法可称为漂白或脱色方法。 该方法中所用的酶可水解叶绿素和含叶绿醇的叶绿素衍生物以从二氢卟酚环裂解叶绿醇尾巴。叶绿素和叶绿素衍生物的水解通常得到诸如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的化合物，它们是不含叶绿醇的叶绿素衍生物。这些化合物仍包含有色卟啉环，脱植基叶绿素呈绿色而脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸则呈红棕色。在一些实施例中，也期望除去这些不含叶绿醇的衍生物以及降低油的绿色/红色/褐色。因此，在本发明的一个实施例中，该方法还可包括除去或降低油中不含叶绿醇的叶绿素衍生物含量的步骤。该方法可涉及漂白或脱色以除去油中的绿色和/或红色/褐色。叶绿素或叶绿素衍生物可为a或b形式。因而如本文所用，术语“叶绿素”包括叶绿素a和叶绿素b。类似地,当提及脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸时，兼指a和b形式。棺物油任何植物油都可根据本方法进行处理，以除去由叶绿素和/或叶绿素衍生物引起的不期望的污染。油可来自任何类型的植物，以及来自植物的任何部分，包括整株植物、叶、茎、花、根、植物原生质体、种子和植物细胞及其相同后代。可以本发明方法处理的产品的来源植物种类包括高等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)以及裸子植物。它包括多种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体和半合子状态。在优选的实施例中，油可包括植物油，包括由含油种子或含油果实加工得到的油(例如，诸如卡诺拉(油菜籽)油的种子油以及诸如棕榈油的果油)。合适的油的例子包括米糠、大豆、卡诺拉油菜(油菜籽)、棕榈、橄榄、棉籽、玉米、棕榈仁、椰子、花生、芝麻或向日葵。本发明的方法可结合加工精油(例如来自果实种子油，例如葡萄籽、杏、琉璃苣等的那些)的方法使用。本发明的方法可结合加工高磷油(例如大豆油)的方法使用。优选地，所述的油为粗制植物油。油中的叶绿素和叶绿素衍牛物叶绿素和/或叶绿素衍生物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)可作为污染物天然存在于油中，或作为不期望的组分存在于加工产品中。叶绿素和/或叶绿素衍生物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)可以任何含量存在于油中。通常，叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素可作为天然污染物存在于油中，浓度按油的总重量计为O. 001至1000mg/kg(0. 001至IOOOppm, I(T7至KT1重量％ )。在另一些实施例中，叶绿素和/或叶绿素衍生物可存在于油中，浓度按油的总重量计为O. I至100、0. 5至50、1至 50、I 至 30 或 I 至 10mg/kg。不含叶绿醇的叶绿素衍生物也可存在于油中。例如,脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸可以任何含量存在于油中。通常，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸在根据本发明方法采用酶处理前或处理后可存在于油中，浓度按油的总重量计为0.001至1000mg/kg(0. 001至lOOOppm，1(Γ7至KT1重量％ )。在另一些实施例中，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸可存在于组合物中，浓度按组合物的总重量计为 O. I 至 100、0· 5 至 50、I 至 50、I 至 30 或 I 至 10mg/kg。 水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶本发明的方法包括使油与能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶接触的步骤。通常，“水解叶绿素或叶绿素衍生物”是指水解叶绿素或(含叶绿醇)叶绿素衍生物中的酯键， 例如从叶绿素或叶绿素衍生物中的二氢卟酚环上裂解叶绿醇基团。因此该酶通常具有酯酶或水解酶活性。优选地该酶在油相中并且任选地在水相中也具有酯酶或水解酶活性。因而该酶可为，例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶。优选地，该酶能够水解叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素中的至少一种、至少两种或全部三种。在一个特别优选的实施例中，该酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性。在另一些实施例中，两种或更多种酶可用于该方法中，每种酶具有不同的底物特异性。例如，该方法可包括选自叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶的两种或三种酶的组合使用。具有可水解叶绿素或叶绿素衍生物的活性的任何多肽可用作本发明方法中的酶。所谓“酶”意指涵盖对叶绿素或叶绿素衍生物具有水解活性的任何多肽，包括例如酶片段等。任何分离的、重组的或合成的或嵌合的(或合成和重组的组合)多肽均可使用。酶(叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶)活性测定可使用任何合适的检测分析技术，例如基于本文所述的检测分析法，检测叶绿素或叶绿素衍生物的水解活性。例如，可使用荧光技术检测水解活性。在一个合适的检测分析中，将要检测其叶绿素或叶绿素衍生物水解活性的多肽在存在底物的情况下温育，并且通过荧光测量法监测产物或底物含量。合适的底物包括例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素。可检测的产物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇。用于检测叶绿素或叶绿素衍生物水解的检测分析方法在以下文献中公开例如Ali Khamessan et al. (1994), Journal of Chemical Technology&Biotechnology,60(I),pages 73-81 (Ali Khamessan等人，1994年,《化学技术与生物技术杂志》,第60卷第I期,第73-81 页)；Klein and Vishniac (1961)，J. Biol. Chem. 236 :2544-2547 (Klein和 Vishniac,1961年，《生物化学杂志》，第236卷，第2544-2547页)；以及Kiani et al. (2006)，Analytical Biochemistry 353 :93-98 (Kiani 等人，2006 年，《分析生物化学》,第 353 卷，第93-98 页)。作为另外一种选择，合适的检测分析可在加入某种酶后基于底物或产物含量的HPLC检测和定量，例如基于如下所述的技术。在一个实施例中，检测分析可按 Hornero-Mendez et al. (2005), Food Research International 38(8-9)1067-1072 (Hornero-Mendez等人，2005年，《国际食品研究》，第38卷，第8_9期，第1067-1072页)中所述进行。在另一个实施例中，可使用以下检测分析法
向pH 7.0的170 μ I mM HEPES中添加溶解于丙酮的20 μ I O. 3mM叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。将酶溶解于PH 7. O的50mM HEPES中。将10 μ I酶溶液添加到190 μ I底物溶液中引发反应，并在40°C下温育不同时间。通过添加350 μ I丙酮终止反应。离心(在18，OOOg下离心2min)后，通过HPLC分析上清液，并确定(i)叶绿素和脱植基叶绿素(ii)脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸或者(iii)焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸的量。一单位酶活性定义为例如采用本文所述的检测分析方法，在40°C下每分钟水解一微摩尔底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)的酶的量。在一些优选的实施例中，本方法中所用的酶按例如通过本文所述检测分析方法确定的每克纯化酶的活性单位计，具有至少1000U/g、至少5000U/g、至少10000U/g或者至少50000U/g的叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性。叶緑素酶

在一个实施例中，该酶至少能够水解叶绿素。任何能催化叶绿素酯键水解以生成脱植基叶绿素和叶绿醇的多肽都可用于该方法。例如，叶绿素酶(chlorophyllase)、叶绿素酶(chlase)或叶绿素脱植基叶绿素水解酶或具有相似活性的多肽(例如，叶绿素-脱植基叶绿素水解酶I或叶绿素酶I (chlase I),或者叶绿素-脱植基叶绿素水解酶2或叶绿素酶2(chlase2)，分别参见例如NCBI P59677-1和P59678)可用于该方法。在一个实施例中，该酶在酶命名分类(E. C. 3. I. I. 14)下分类为叶绿素酶。任何分离出的、重组的或合成的或嵌合的(合成和重组的组合)多肽(例如酶或催化性抗体)均可使用，参见例如Marchler-Bauer (2003) Nucleic Acids Res. 31 :383-387 (Marchler-Bauer,2003年，《核酸研究》，第31卷，第383-387页)。在一个方面，叶绿素酶可为如WO 0229022或WO 2006009676中所述的酶。例如，拟南芥叶绿素酶可按例如NCBI条目NM_123753中所述使用。因而叶绿素酶可为包含SEQ ID NO :1序列的多肽(参见图2)。在另一个实施例中，叶绿素酶来自藻类，例如来自三角褐指藻(Phaeodactylum trtcornutum)。在另一个实施例中，叶绿素酶来自小麦，例如来自小麦属(Triticum sp.)，尤其是来自普通小麦。例如，叶绿素酶可为包含SEQ ID NO :2序列的多肽(参见图3)，或可由SEQID NO :3核苷酸序列编码(参见图4)。在另一个实施例中，叶绿素酶来自衣藻属(Chlamydomonas sp.),尤其是来自莱茵衣藻。例如，叶绿素酶可为包含SEQ ID NO 4序列的多肽(参见图5)，或可由SEQ ID NO 5核苷酸序列编码(参见图6)。脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶在一个实施例中，该酶能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。例如，该酶可为脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)，例如在Schelbert et al.，The PlantCell 21 :767-785(2009) (Schelbert 等人，《植物细胞》，第 21 期，第 767-785 页，2009 年)中所述的酶。除脱镁叶绿素之外，PPH和相关酶也能够水解焦脱镁叶绿素。然而，PPH对叶绿素是惰性的。如在Schelbert等人的文献中所述，PPH直系同源基因通常存在于真核光合作用生物体。PPH代表在系统发生上区别于叶绿素酶定义的α/β水解酶亚族，这两个族在序列同源性和底物上是不同的。在本发明的具体实施例中，该酶可为来自任何物种的任何已知PPH或它们的功能性变体或片段，或可衍生自任何已知的PPH酶。例如，在一个实施例，该酶为来自拟南芥的PPH，例如包含SEQ ID NO :6氨基酸序列的多肽(参见图7)，或由SEQ ID NO :7核苷酸序列编码的多肽(参见图8，NCBI登录号NP_196884，GenBank ID No. 15240707)，或者它们的功能性变体或片段。在另一些实施例中，该酶可为来自以下任何一种物种的PPH:拟南芥、毛果杨、葡萄、稻、玉米、烟草、团藻(Ostreococcus Iucimarinus)、青绿藻(Ostreococcus taurii)、小立碗藓、三角褐指藻、莱茵衣藻或微单胞菌属(Micromonas sp. )RCC299。例如,该酶可为包含氨基酸序列的多肽，或由核苷酸序列编码的多肽(在表I中所示的以下数据库条目之一中定义)，或者它们的功能性片段或变体表I 生场体登录号Genbank ID
拟南芥NPJ 9688415240707
毛果杨XP—002314066224106163
葡萄CA040741157350650
稻(粳稻)NPJKM057593115467988
玉米ACF87407194706646
烟草CA099125156763846
团藻XPj001415589145340970
青绿藻CAL50341116000661
小立碗藓XPj001761725168018382
三角褐指藻XP—002181821219122997
莱菌衣藻XPj001702982159490010
微单胞菌属 RCC299AC062405226516410例如，该酶可为在SEQ ID N0:8至15任何一个中所定义的多肽(图9至16)，或者它们的功能性片段或变体。变体和片段水解叶绿素或叶绿素衍生物的已知序列的功能性变体和片段也可用于本发明。所谓“功能性”是指所述片段或变体保留着对叶绿素或叶绿素衍生物的可检测水解活性。通常此类变体和片段显示出与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列具有同源性，例如与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶氨基酸序列，如与SEQ ID NO 1或 SEQ ID NO :1、2、4、6 或8 至 15 的任何一者，如序列的至少约 10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多个残基的区域，或整个长度具有至少约50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性。序列同一性的百分比可以用序列比较算法分析或通过肉眼检查确定。在一个方面，序列比较算法是BLAST算法，例如BLAST 2. 2. 2版算法。
其他适用于本方法的具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的酶可以通过确定存在于例如已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列中的保守序列基序的存在性而鉴定。例如，存在于PPH酶中的保守序列基序包括以下序列LPGFGVG (SEQ ID NO 16)、DFLGQG (SEQ ID NO 17)、GNSLGG (SEQ ID NO 18), LVKGVTLLNATPFff (SEQ ID NO : 19)、HPAA(SEQ ID NO :20)、EDPW(SEQ ID NO 21)和SPAGHCPH(SEQ ID NO :22)。在一些实施例中，适用于本发明的酶可包含一个或多个这些序列。GNSLGG(SEQ ID NO : 18)基序包含活性位点丝氨酸残基。具有合适活性的多肽序列可以通过搜索基因组数据库，例如微生物组宏基因组数据库(美国能源部联合基因组研究所(JGI-DOEjUSA))中这些基序的存在来鉴定。酶的分离和制备适用于本发明的酶可以从它们的天然来源分离，或可以例如使用重组DNA技术制备。编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列可以分离或构建并且用于产生相应的多肽。例如，可使用来自产生该多肽的生物体的染色体DNA或信使RNA，来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该多肽的氨基酸序列已知，则可合成出经标记的寡核苷酸探针，并用它从由该生物制备的基因组库鉴定编码多肽的克隆(polypeptide-encodingclones)。或者，可使用含有与另一已知的多肽的基因同源的序列的标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况中，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。或者，可如下鉴定编码多肽的克隆将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将经转化的细菌接种到含有被该多肽抑制的酶的琼脂上，从而让表达该多肽的克隆得以鉴定出来。在又一个另选方案中，编码该多肽的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如 Beucage S. L. el al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869 (BeucageS.L.等人，1981年，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1869页)所描述的亚磷酰胺方法，或Matthes et al (1984) EMBO J. 3，p 801-805 (Matthes 等人，1984 年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第801-805页)所述的方法。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接并克隆进适当的载体中。核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如US 4，683，202或Saiki R K等人(Science (1988) 239，pp487-491)(《科学》，1988年，第239卷，第487-491页)所描述。本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。该核苷酸序列可以来自基因组或者来自合成或者来自重组，无论代表正义链还是反义链都可以是双链或单链。通常，编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列使用重组DNA技术制备。然而，在本发明的可供选择的实施例中，可以使用本领域熟知的化学方法来合成该核苷酸序列的全部或部分(参见Caruthers MH et al (1980)Nuc Acids Res Symp Ser215_23 (Caruthers MH等人，1980年，《核酸研究论文集系列》,第215-223 页)和 Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 (Horn T 等人，1980年，《核酸研究论文集系列》，第225-232页))。酶序列的修饰一旦分离了酶编码核苷酸序列，或者鉴定了推定的酶编码核苷酸序列，可能需要修饰选定的核苷酸序列，例如可能需要将该序列突变以制备本发明的酶。可用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点旁侧的核苷酸序列。合适的方法在Morinaga等人(Biotechnology (1984) 2, p646_649 (《生物技术》，1984年，第2卷，第646-649页))中有所公开。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在Nelson 和 Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151 (《分析生物化学》，1989年，第180卷，第147-151页))中有描述。可以例如使用市售的试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或者来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒,来随机引入突变,而不是如上所述进 行定点诱变。EP 0583265提到了优化基于PCR的诱变的方法，也可将它们与诱变DNA类似物(mutagenic DNA analogue)(如EP 0866796中描述的那些)组合使用。易错PCR技术适用于产生水解叶绿素和/或叶绿素衍生物的具有优选特性的酶变体。W00206457提到了脂肪酶的分子进化。第三种获得新序列的方法是，用多种限制性内切核酸酶或者诸如Dnase I的酶将不相同的核苷酸序列片段化，然后重新组装出编码功能蛋白的完全核苷酸序列。或者，可以使用一条或多条不相同的核苷酸序列，并在完全核苷酸序列的重新组装过程中引入突变。DNA改组和家族改组技术适用于产生具有优选特性的酶变体。进行“改组”的合适方法可在EP0752008、EP1138763、EP1103606中找到。也可将改组与其他形式的DNA诱变进行组合，如 US 6，180，406 和 WO 01/34835 中所描述。因此，有可能在体内或体外对核苷酸序列作出多个定点突变或随机突变，并且随后通过各种方法筛选所编码的多肽的改进的功能性。例如，采用计算机和exo介导的(insilico and exo mediated)重组方法(参见 W000/58517、US 6，344，328、US 6,361,974)，可进行分子进化，其中所产生的变体保留很低的与已知酶或蛋白质的同源性。由此获得的此类变体可以与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶具有显著的结构相似性，但是具有非常低的氨基酸序列同源性。另外，作为一个非限制性例子，可将多核苷酸序列的突变或自然变体与野生型或其他突变或自然变体进行重组，以产生新的变体。也可以针对所编码的多肽的功能性改善对这种新的变体进行筛选。上述的和类似的分子进化方法的应用，使得可以在事先不知道蛋白质结构或功能的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明酶的变体，并使得可以生产非可预测但有利的突变或变体。在本领域中有许多将分子进化应用于优化或改变酶活性的例子，这些例子包括(但不限于)如下中的一种或多种优化在宿主细胞中或体外的表达和/或活性，增加酶活性，改变底物和/或产物特异性，增加或减少酶或结构稳定性，改变优选环境条件，如温度、pH、底物下的酶活性/特异性。本领域技术人员会明白，使用分子进化工具，可对酶进行改变以改进其功能性。合适地，编码用于本发明的酶(例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶)的核苷酸序列可以编码变体酶，即当与亲本酶比较时，变体酶可以包含至少一个氨基酸置换、缺失或插入。变体酶保留至少1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80 %、90 %、95 %、97 %或99 %的与亲本酶的同一性。合适的亲本酶可以包括具有叶绿素和/或叶绿素衍生物的水解活性的任何酶。多肽序列本发明还涵盖能编码供在本发明的方法和/或用途的任一者中使用的焦脱镁叶绿素酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的用途。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”同义。氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或可以合成制备或可以使用重组DNA技术制备。合适地，氨基酸序列可通过标准的技术从本文教导的分离多肽获得。一种从分离多肽确定氨基酸序列的合适方法如下。可将纯化了的多肽进行冷冻干 燥,并可将100 μ g的冷冻干燥材料溶于50 μ I的8Μ尿素和O. 4Μ碳酸氢铵(pH 8. 4)混合物中。可将溶解的蛋白质变性，并在覆盖氮气和加入5μ I的45mM 二硫苏糖醇后在50°C下还原15分钟。冷却到室温后，可加入5μ I的IOOmM碘代乙酰胺，以让半胱氨酸残基在氮气下在暗处室温下衍生化15分钟。可向以上反应混合物加入135 μ I水和溶于5 μ I水的5μ g内切蛋白酶Lys_C,然后可在氮气、37°C下进行消化24小时。所得的多肽可以在VYDAC C 18柱(O. 46X 15cm ;
10μ m ;美国加利福尼亚州分离集团(TheSeparation Group, California, USA))上使用溶剂A :溶于水的O. 1% TFA和溶剂B :溶于乙腈的O. 1% TFA通过反相HPLC分离。可将选定的肽在Develosil C18上用相同的溶剂体系再进行色谱分离后，进行N末端测序。可根据厂商说明书(美国加利福尼亚州应用生物系统公司(Applied Biosystems, California,USA))使用Applied Biosystems 476A测序仪,采用脉冲液体快速循环进行测序。序列比较在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应能提供和/或编码保留着功能活性和/或增强酶活性的多肽。在本说明书的语境中，同源序列意指包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列有至少75、85或90%同一性、优选至少95或98%同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。在本说明书的语境中，同源序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少75、85或90%同一性、优选至少95或98%同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购获得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的％同源性。可以对连续序列计算％同源性，即一个序列与其他序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸直接与其他序列中相应的氨基酸比较，每次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gapcosts) ”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位打分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。 最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是Vector NTI Advance 11 (Invitrogen Corp.)。其他可进行序列比较的软件的例子包括(但不限于)BLAST软件包(参见Ausubel et al 1999 ShortProtocols in Molecular Biology, 4th Ed-Chapter 18 (Ausubel 等人，《精编分子生物学方案》，第 4 版,第 18 章))和 FASTA (Altschul et al 1990J. Mol. Biol. 403-410 (Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第403-410页))。BLAST和FASTA均可供进行离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999,第7-58至7-60页)。然而,对于一些应用，使用VectorNTI Advance ll程序是优选的。称为BLAST 2 Sequences的新型工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2) :247-50(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第174卷第2期，第247-250页)和FEMS Microbiol Lett1999 177(1) :187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第177卷第I期，第187-188 页))。尽管最终的同源性百分数)也可以同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BL0SUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于某些应用，优选使用VectorNTI Advance 11程序包的默认值。作为另外一种选择，百分比同一性可用Vector NTI Advance 11(英杰公司(Invitrogen Corp.))中的多比对功能计算，该功能基于类似于CLUSTAL(HigginsDG&Sharp PM (1988)，Gene 73 (I)，237-244 (Higgins DG 和 Sharp PM，1988 年，《基因》，第 73卷第I期，第237-244页))的算法。一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。如果确定序列同一性时使用空位罚分，则可优选地使用程序的默认参数于成对比对。例如，以下参数是BLAST 2成对比对的当前默认参数
权利要求
1.精制植物油的方法，所述方法包括使所述油接触酶的步骤，所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物，其中所述酶在存在至少O. I重量％磷脂的情况下与所述油接触。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述酶在存在少于O.2重量％溶血磷脂的情况下与所述油接触。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，其中所述酶在所述油脱胶步骤之前或期间与所述油接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括(a)使所述酶与所述油接触，然后，(b)使用磷脂酶或酰基转移酶使所述油脱胶。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括使所述油与所述酶和磷脂酶C在单个步骤中接触。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶在存在至少I重量％磷脂的情况下与所述油接触。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶在低于70°C的温度下与所述油接触。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶在存在I至5重量％水的情况下与所述油接触。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中所述脱胶步骤包括水化脱胶。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述脱胶步骤包括向所述油中加入酸，然后用碱中和。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法不包括粘土处理的步骤。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法还包括进行脱臭步骤以产生脱臭油和馏出液。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述方法与包括粘土处理步骤的方法相比在所述精制油和/或馏出液中产生的类胡萝卜素和/或生育酚水平提高。
14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶包括叶绿素酶、脱镁叶绿素酶、焦脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶。
15.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶包含SEQIDNO :1、2、4、6或8至15中的任ー个中所定义的多肽序列，或其功能片段或变体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述酶包含与SEQID NO :1、2、4、6或8至15中的任ー个在至少50个氨基酸残基上具有至少75%序列同一性的多肽序列。
17.可通过前述任一项权利要求所定义的方法获得的精制植物油。
18.可通过权利要求12或权利要求13所定义的方法获得的馏出液。
19.权利要求11至16中的任ー项所定义的方法用于提高通过油的脱臭获得的精制油和/或馏出液中的类胡萝卜素和/或生育酚水平的用途。
20.根据权利要求7所述的方法，其中所述酶在58°C至62°C的温度下与所述油接触。
21.根据权利要求8所述的方法，其中所述酶在存在约I重量％水的情况下与所述油接触。
22.根据权利要求I至16或20中任一项所述的方法，其中所述酶在pH6. 3至6. 5下与所述油接触。
全文摘要
在一个方面，本文提供一种精制植物油的方法，所述方法包括使所述油与酶接触的步骤，所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物，其中所述酶在存在至少0.1重量％磷脂的情况下与所述油接触。
文档编号C11B3/04GK102844418SQ201180012612
公开日2012年12月26日 申请日期2011年2月23日 优先权日2010年3月12日
发明者R.米科森, T.乔根森, J.B.索伊 申请人:杜邦营养生物科学有限公司