酶体系的制作方法

酶体系的制作方法
【专利摘要】酶促织物处理组合物，其包含以下的组合：（i）一种或多种嗜冷酶，以及（ii）一种或多种嗜温酶和/或一种或多种嗜热酶。
【专利说明】酶体系
[0001]本发明涉及酶在洗涤过程中的递送。
[0002]在洗衣(laundering)过程中使用酶混合物是已知的。
[0003]本发明的目的是提供改善的洗涤/去污方法，其涉及用于具有可变的不受控制的温度的洗涤液的酶。
[0004]本发明的第一方面提供了酶促织物处理组合物，其包含以下物质的组合:
[0005]1.一种或多种嗜冷酶(psychrophilic enzyme),以及
[0006]2.一种或多种嗜温酶(mesophilic enzyme)和/或一种或多种嗜热酶(thermophilic enzyme)。
[0007]本发明的第二方面提供了使用根据所述第一方面的酶促织物处理组合物处理织物的方法，其中洗漆液的温度在整个单洗漆循环过程中在低温(Psychrophi I i C )和中温(mesophilic)以及任选的高温(thermophilic)之间变化。
[0008]本文中所用的术语“单洗涤循环”意指单个洗涤过程，其包括一个或多个水洗涤阶段和一个或多个水漂洗阶段。所述循环在最终漂洗之后结束，然后织物准备进行干燥和再使用。所述循环可包括预处理阶段。
[0009]优选地，所述温度在整个单洗涤循环过程中在低温、中温和高温之间变化。
[0010]在洗涤液的温度在至少一部分中不受使用者控制的情况下，本发明高度有利。优选地，所述洗涤液温度很大量地不受控制，并且更优选不受控制到温度完全受环境条件驱动的程度。所述方法可以包括手洗处理或在洗涤机中进行，所述洗涤机优选没有任何水加热。
[0011]采用本发明，变化的以及不受(使用者)控制的洗涤液温度的组合问题均在酶性能的方面得以解决。洗涤液温度常常既是变化的又是不受控制的。所述温度的变化可能发生在单洗涤过程中或整个连续洗涤过程中。例如，在温暖的气候中，对于手洗而言，洗涤水可由通过地下管道供水的水龙头取得，并且洗涤过程可在低温度(5至15°C)下开始然后在较温暖的环境条件下升温至20°C、30°C、4(TC或更高的温度。变化的气候条件是指环境温度至少季节性地变化。采用本发明，这些问题通过提供在不同的温度区域中提供期望的功能的酶的组合而得以解决。甚至采用自动洗涤机，洗涤液的温度也可能在一个洗衣产品的整个使用期间发生变化。
[0012]本文中所用的术语“嗜冷酶”意指在O至25°C的温度下有效的酶。
[0013]本文中所用的术语“嗜温酶”意指在25至50°C的温度下有效的酶。
[0014]本文中所用的术语“嗜热酶”意指在50至90°C的温度下有效的酶。
[0015]本文中所用的术语“有效”意指酶(在给定的温度区域中)能够实现去污的能力或催化能力。
[0016]本文中所用的术语“酶”包括酶变体(例如通过重组技术制备的)。这样的酶变体的实例公开于例如 EP251, 446 (Genencor)、W091/00345 (Novo Nordisk)、EP525, 610 (Solvay)以及 W094/02618 (Gist-Brocades NV)中。
[0017]优选地,去污按缓解(Remission)单位或缓解指数进行度量。有效去污优选通过等于或大于2个缓解单位的缓解来表示。
[0018]本文在酶促织物处理组合物的情况中所用的术语“处理”优选意指清洗且更优选意指去污。
[0019]酶可来自细菌或真菌来源。包括化学修饰或蛋白质工程突变体。
[0020]优选，所述一种或多种嗜冷酶和/或一种或多种嗜温酶和/或一种或多种嗜热酶包含共同类别的酶。这具有在不同温度下解决特定类型污溃的优势。在这种情况下，优选所述共同类别为蛋白酶或脂肪酶或糖基水解酶或裂解酶或氧化还原酶。
[0021]可替换地，本发明可包括混合类别的酶。优选地，这包含嗜冷酶和嗜温酶。该组合的优势在于过程以低温开始的洗涤，其中脂肪酶有效但是此时抑制了蛋白酶攻击所述脂肪酶。
[0022]嗜冷酶
[0023]优选地，所述一种或多种嗜冷酶包含酯酶(酯水解酶)且更优选地包含羧酸酯水解酶，更优选包含例如脂肪酶和/或磷脂酶。
[0024]脂肪酶为高度有利的嗜冷酶，因为脂肪和油基污溃在低温下更难以去除。出于大体相同的原因，磷脂酶对于低温而言也是有利的。
[0025]有利地，可替换地或额外地，所述一种或多种嗜冷酶包含糖基水解酶(糖基化酶)，例如纤维素酶、淀粉酶 (包括α-淀粉酶)、木聚糖酶等。
[0026]嗜冷脂肪酶包括来自以下的脂肪酶:不动杆菌属(Acinetobacter sp.)第6号菌株(Suzuki 等(2001) J.Biosc1.Bioeng.92:144 - 148;不动杆菌属第 016 号菌株(Brueuil和 Kushner，(1975)Can.J.Microbiol.21:423-433;解脂无色杆菌(Achromobacterlipolyticum) (Khan 等，(1967), Biochem.Biophys.Acta.132:68-771967)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)第 LPB4 号菌株(Lee 等(2003)，J.Microbiol.41:22-27、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) (Pemberton 等(1997)FEMS Microbiol.Lett.152:1-10);球形芽抱杆菌(Bacillus sphaericus) MTCC7526 (Joseph.PhD Thesis (2006)Allahabad Agricultural Institute, Allahabdj IN);叶球形微杆菌(Microbacteriumphyllosphaerae) MTCC7530、莫拉氏菌属(Moraxell sp.) (Feller 等(1990)FEMSMicrobiol.Lett.66:239-244;莫拉氏菌 M (Moraxella sp) TA144 (Feller 等(1991)Gene.102:111-115;解脂发光杆菌(Photobacterium lipolyticum) M37 (Ryu 等(2006)App1.Microbiol.Biotechnol.70:321 - 326);假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)Wp27 (Zeng 等(2004) J.Microbiol.Biotechnol.14:952-958);假交替单胞菌属(Giudice等(2006)J.Applied MicrobiologylOl:1039-1048、南极嗜冷菌 M(Pscychrobactersp.)和弧菌 M (Vibrio sp.);南极嗜冷菌属 Wp37 (Zeng 等(2004) J.Microbiol.Biotechnol.14:952-958);鄂霍次克海嗜冷杆菌属(Psychrobacter okhotskensissp.) (Yumoto 等(2003) Int.J.Syst.Evol.Microbiol.53:1985 - 1989);南极嗜冷菌属 Ant300 (Kulakovaa 等(2004)Biochemica.Biophysica.Acta.1696:59-65);不动嗜冷杆菌(Psychrobacter immobilis)菌株 BlO(Arpigny 等(1997)J.Mol.Catal.B Enzy.3:29-35.)、粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens) (Abdouj (2003) J.DairySc1.86:127 - 132、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (Alford 和 Pierce，(1961)J.Food Sc1.26:518-524)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) (Joseph 等(2006)J.Gen.App1.Microbiol.52:315-320)。
[0027]嗜冷酯酶优选包括Jeon等在Mar Biotechnol (2009) 11:307 - 316中描述的酯酶EstATl 和 EstATlI。
[0028]嗜冷糖基水解酶优选包括糖苷酶，例如淀粉酶，例如来自游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)菌株 TAC125、来自河膝毒素交替单胞菌(Alteromonashaloplanktis) A23 (Feller 等(1998)Journal Biological Chemistry Vol273, N0.20第12109-12115页)以及来自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis sp.) 7326的α-淀粉酶；纤维素酶和木聚糖酶，来自例如梭状芽孢杆菌属(Clostridium sp.) PXYLl (G.Akila, T.S.Chandra(2003)FEMS Microbiol.Letters219, 63-67)的。嗜冷木聚糖酶包括大肠杆菌(E.coli)嗤菌粒(Lee 等 2006b)。
[0029]优选的嗜冷蛋白酶包括源自大比目鱼黄杆菌(Flavobacterium balustinum)P104(分离自鲑鱼的内脏，并且已在1995年2月17日保藏于国家生物科学和人类
技术研究所-工业科学技术代理处(National Institute of Bioscience and
Human-Techno1gy, Agency of Industrial Science and Technology),其保藏号为FERM BP-5006,且记载于W0/1996/025489中)以及源自球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis) S155 (Poitier 等，(1995) J.Gen.Microbiol.133:2797-2806)的那些。
[0030]嗜冷裂解酶优选包括果胶裂解酶，例如来自游海假交替单胞菌菌株ANT/505 (Truong 等(20 01)Extremophiles5:35-44)的。
[0031]嗜温酶
[0032]优选地，所述一种或多种嗜温酶包括蛋白酶和/或糖苷酶和/或果胶裂解酶。
[0033]优选的嗜温蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶或金属基蛋白酶，优选地，碱性微生物蛋白酶或类胰蛋白酶的蛋白胰(trypsin-like protease)。碱性蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽孢杆菌属(Bacillus)的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo(subtilisin Novo)、枯草杆菌蛋白酶 Carlsberg (subtilisin Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309 (subtilisin309)、枯草杆菌蛋白酶147 (subtilisinl47)和枯草杆菌蛋白酶168(subtilisinl68)0所述类胰蛋白酶(即能够裂解在赖氨酸或精氨酸的C-末端侧处的肽键。)这样的蛋白酶可以来源于猪或牛。还包括源自镰刀菌(Fusarium)的胰蛋白酶。
[0034]市售可得的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、Dyrazym?、Esperase?、Everlase?、Polarzyme? 以及 Kannase?, (Novozymes A/S)，Maxatase?、Maxacal?> Maxapem?> Properase?, Puraf ect?> Purafect 0xP?> FN2? 和 FN3? (GenencorInternational Inc.)。
[0035]优选的嗜温脂肪酶包括来自腐质霉属(Humicola)(也称嗜热真菌属(Thermomyces))的脂肪酶，例如来自梳棉状腐质霉(H.lanuginosa (T.1anuginosus))或来自特异腐质霉(H.1nsolens);假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)、突光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株 SD705 (W095/06720 和 W096/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis);芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis) (Dartois等(1993), Biochemica etBiophysica Acta, 1131, 253-360)、嗜热芽抱杆菌(B.stearothermophiIus) (JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus) (W091/16422)。
[0036]市售可得的嗜温脂肪酶包括Lipolase? 和 Lipolase Ultra?、Lipex?(NovozymesA/S)。
[0037]优选的嗜温磷脂酶(EC3.1.1.4和/或EC3.1.1.32)包括水解磷脂的酶。包括水解一个脂肪酰基(分别在sn-Ι和sn-2位)以形成溶血磷脂的磷脂酶A1和A2 ;和可以水解溶血磷脂中剩余的脂肪酰基的溶血磷脂酶(或磷脂酶B);而且还包括磷脂酶C和磷脂酶D (磷酸二酯酶)，其分别释放二酰基甘油或磷脂酸。
[0038]本文所用的与本发明的酶有关的术语“磷脂酶A”意为涵盖具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶。磷脂酶活性也可以通过还具有其他活性的酶(例如具有磷脂酶活性的脂肪酶)提供。
[0039]所述嗜温磷脂酶可以是任何来源的，例如动物源(例如哺乳动物)、例如来源于胰腺(例如牛或者猪胰腺)、或者蛇毒或蜂毒。优选地，磷脂酶可以是微生物源的，例如源自丝状真菌、酵母或细菌、例如曲霉属或种，例如黑曲霉；网柄菌属(Dictyostelium),例如盘基网柄菌(D.discoideum);毛霉属(Mucor),例如爪睡毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus);脉孢菌属(Neurospora),例如粗糙脉孢菌(N.crassa);根毛霉属(Rhizomucor),例如微小根毛霉(R.pusillus)；根霉菌属(Rhizopus),例如少根根霉(R.arrhizus)、例日本根霉(R.japonicus)、匍枝根霉(R.stolonifer);核盘菌属(Sclerotinia)，例如大豆核盘菌(S.1ibertiana)；毛藓菌属(Trichophyton),例如红色毛藓菌(T.rubrum);维氏核盘菌属(Whetzelinia),例如W.scIerotiorum ;芽孢杆菌属，例如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；梓檬酸杆菌属(Citrobacter),例如弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii);肠杆菌属(Enterobacter),例如产气肠杆菌(E.aerogenes)或阴沟肠杆菌(E.cloacae);爱德华氏菌属(Edwardsiella),迟钝爱德华氏菌(E.tarda);欧文氏菌属(Erwinia),例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia),例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae);变形菌属(Proteus),例如普通变形菌(P.vulgaris);普罗威登斯菌属(Providencia),例如斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii);沙门氏菌属，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium);沙雷氏菌属(Serratia),例如液化沙雷氏菌(S.1iquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens);志贺氏菌属(Shigella),例如弗氏志贺氏菌(S.f Iexneri);链霉菌属，例如紫红链霉菌(S.violeceoruber);或耶尔森氏菌属,例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。因此磷脂酶可以源于例如真菌类,例如核菌(Pyrenomycetes)类，如镰孢属(genus Fusarium),例如大刀镰孢(F.culmorum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、腐皮镰孢(F.solani)的菌株，或尖镰孢(F.0xysporum)的菌株。磷脂酶还可以来自曲霉属内的丝状真菌菌株，例如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉或米曲霉(Aspergillu oryzae)的菌株。
[0040]优选的嗜温磷脂酶是源自腐质霉属的菌株，尤其是疏棉状腐质霉菌株或变体；以及是源自镰刀菌的菌株， 尤其是尖镰孢的菌株。磷脂酶可以是源自尖镰孢DSM2672的。
[0041]优选地，嗜温磷脂酶包括磷脂酶A1 (EC.3.1.1.32)或磷脂酶A2 (EC.3.1.1.4)。
[0042]市售嗜温磷脂酶的实例包括LECITASE? 和 LECITASE?ULTRA, YIELSMAX 或 LIP0PANF (可购自 Novozymes A/S,丹麦)。
[0043]优选的嗜温角质酶(EC3.1.1.74.)是源自曲霉属的菌株，尤其是米曲霉(Aspergillus oryzae);链格孢菌株，特别是甘蓝链格孢菌(Alternaria brassiciola)；镰孢菌属(Fusarium)菌株，特别是爺病镰孢菌(Fusarium solani)、豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)、大刀粉红键抱菌(Fusarium roseum cuImorum)或接骨木粉红键抱菌(Fusarium roseum sambucium);长螺抱属(Helminthosporum)菌株，特别是麦根腐长螺孢菌(Helminthosporum sativum);腐质霉属菌株,特别是特异腐质霉；假单胞菌属菌株，特别是门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina),或恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida);丝核菌属(Rhizoctonia)菌株,特别是立枯丝核菌(Rhizoctonia solani);链霉菌属(Streptomyces)菌株,特别是挤疮病链霉菌(Streptomyces scabies);或细基格孢属(Ulocladium)菌株,特别是群生细基格孢(Ulocladium consortiale)。最优选地,角质酶源自特异腐质霉菌株，特别是特异腐质霉DSM1800菌株。
[0044]市售的角质酶包括N0V0ZYM?51032 (可购自Novozymes A/S,丹麦)。
[0045]优选的嗜温淀粉酶U和/或β)包括例如获自芽孢杆菌属(例如地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)的菌株 NCIB8059、ATCC6634、ATCC6598、ATCCl 1945、ATCC8480、ATCC9945a ;或者芽孢杆菌菌株DSMl2649 (AA560 α -淀粉酶)或芽孢杆菌属DSMl2648 (ΑΑ349 α -淀粉酶))的α -淀粉酶。
[0046]市售可得的嗜温淀粉酶有Duramyl?、Termamy 1?> Termamyl Ultra?、Natalase?、Stainzyme?、FungamyI? 和 BAN?(Novozymes A/S), Rapidase? 和 Purastar?(可购自Genencor International Inc.)。
[0047]优选的嗜温纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀霉属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶,例如，由特异腐质霉、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum)所产生的真菌纤维素酶。
[0048]尤其优选的嗜温纤维素酶为具有护色(color care)益处的碱性或中性纤维素酶。市售可得的纤维素酶包括 CelluzymeTM、CarezymeTM、EndolaseTM、RenozymeTM (Novozymes A/S)、Clazinase? 和 Puradax HA?(Genencor International Inc.),以及 KAC-500 (B) ?(KaoCorporation)。
[0049]优选的嗜温果胶酸裂解酶包括源自以下或由以下克隆得到的果胶酸裂解酶:细菌属例如欧文氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属和黄单胞菌属、以及枯草芽孢杆菌(Nasser 等，(1993) FEBS Letts.335:319-326)和芽孢杆菌属 YA-14 (Kim 等，(1994) Biosc1.Biotech.Biochem.58:947-949)；短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus) (Dave 和 Vaughn,(1971)，J.Bacteriol.108:166-174)、多粘芽抱杆菌(B.Polymyxa) (Nagel 和 Vaughn,(1961)，Arch.Biochem.Biophys.93:344-352)、嗜热芽抱杆菌(B.stearothermophilus)(Karbassi 和 Vaughn, (1980), Can.J.Microbiol.26:377-384)、芽抱杆菌属(Hasegawa 和Nagel, (1966)，J.Food Sc1.31:838-845)和芽孢杆菌 RK9 (Kelly 和 Fogarty，(1978), Can.J.Microbiol.24:1164-1172)。可以使用非二价阳离子依赖型的和/或热稳定的果胶裂解酶。
[0050]市售可得碱性嗜温果胶酸裂解酶的实例包括可购自Novozymes A/S，丹麦的BIOPREP? SC0URZYME?Lo
[0051]优选的嗜温甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)包括源自以下的甘露聚糖酶:曲霉属丝状真菌属(filamentous fungus genus Aspergillus)菌株，优选黑曲霉(Aspergillusniger)或棘抱曲霉(Aspergillus aculeatus)或里氏木霉(Trichoderma reesei);或芽孢杆菌微生物FERM P-8856，其产生β -甘露聚糖酶和β -甘露糖苷酶；或嗜碱芽孢杆菌AM-OOl ;或解淀粉芽孢杆菌。所述甘露聚糖酶可包含源自Bacillus agaradhaeren、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、芽孢杆菌属、和特异腐质霉的碱性5和26族的甘露聚糖酶。[0052]市售可得甘露聚糖酶的实例包括可购自Novozymes A/S,丹麦的Mannaway?。
[0053]优选的嗜温过氧化物酶/氧化酶包括源自鬼伞属(Coprinus)，例如灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体。市售可得的过氧化物酶包括Guardzyme?和Novozym?(Novozymes A/S)。
[0054]嗜热酶
[0055]嗜热蛋白酶包括源自嗜i芽孢杆菌属菌株HS08 (African Journal ofBiotechnology Vol.5(24),第2433-2438页，2006年12月18日)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.Stearothermophilius) 1503; Thermos caldophilus GK24;水生栖热菌(Τ.Aquaticus)Τ351;水生栖热菌YTlAq.1和Aq.1I的蛋白酶。
[0056]嗜热脂肪酶包括源自嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus thermocatenulatus) BTLl的那些以及优选源自 BTL2 (Schimdt-Dannert 等,Biochim.Biophys.Acta(1994) 1214,第43-5 页和 Biochim.Biophys.Acta (1996) 1301，第 105 - 114 页)的那些。
[0057]嗜糖基水解酶包括源自嗜热链状芽孢杆菌Donk，菌株BS_1 (JournalBiochemistry, Vol67, 1:65-75)以及源自芽抱杆菌属 ANT-6(ProcessBiochemistry(May2003)Vol38, 10:1397-1403)的 α-淀粉酶。嗜益裂解酶包括源自意大利嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter italicus sp.) nov.菌株 Ab9 (Kozianowski等，(1997)Extremophiles Voll, 4:171-182)的果胶裂解酶。
[0058]一旦根据本发明选定各个合适的酶，对于本领域技术人员而言分离能够生产该酶的合适微生物以及实施本领域中已知的用于制备在例如粉末或液体组合物中以及/或者在某些洗涤条件下等具有所需稳定性/性能的酶的优化步骤是相对容易的。
[0059]织物处理组合物可以包括洗衣/织物清洁/护理组合物并且可以包含一种或多种表面活性剂和/或任选的其它成分。
[0060]本发明的这种组合物可以是干燥固体形式，例如粉末化、颗粒、或者片状粉末或者液体或者凝胶形式。其也可以是固体清洁剂棒的形式。所述组合物可以是浓缩物，其在使用前被稀释、再水合和/或溶解在溶剂(包括水)中。所述组合物也可以是即用(使用中的)组合物。
[0061 ] 本发明适合用于工业或家用织物洗涤组合物、织物调理组合物以及用于洗涤织物和调理织物的组合物(所谓的通过洗涤调理剂组合物)中。本发明也可以被应用于工业或家用非洗涤剂基织物护理组合物，例如直接施用例如滚抹(roll-on)或喷涂组合物，所述组合物可以用作例如在“主”洗之前预处理织物的局部。
[0062]酶可以以组合物的0-5重量％、优选2-4重量％且最优选2.5-3.5重量％(其中重量％意指组合物总重量的百分比)存在。
[0063]洗涤液中(本发明的酶的总范围的)总蛋白质浓度优选为0.01至10.0mg/L并更优选为2至5mg/L。
[0064]组合物的总蛋白质浓度和重量％将分别包含各个水平的嗜冷酶/嗜温酶以及任选的嗜热酶；并且在该组合之内，所述水平可以低于例如各个酶单独使用时所用水平的一半。这是可能的，因为实现了在一个温度下，高峰值可能似乎在那个温度范围中提供了很大的有效性的同时，而在其中温度不受控制的洗涤过程中在该范围之外存在极小或者没有活性。采用本发明，其是在实现有效性的实际洗涤的整个不受控制的温度范围内具有有效性的酶和这种低于(例如一半的)各自水平的组合，这意味着可以提供温度敏感的酶促性能组合物且同时将该组合物的成本维持在合理水平(因为总的酶含量没有更高且甚至可能较低)。
[0065]酶可以是唯一的织物处理剂，或者也可以并入其它去污剂。
[0066]可以包括的其它洗涤剂成分包括表面活性剂、助洗剂(builder)、螯合剂、水溶助剂、防腐剂、络合剂、聚合物、稳定剂、香料、荧光增白剂，或者其它成分例如织物调理剂(包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂(消泡剂)、防腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污溃再沉积剂、抗微生物剂、污点抑制剂(tarnish inhibitor),以及其一种或两种的组合,前提是这些成分与所述酶相容。
[0067]织物洗涤组合物可以包含织物洗涤剂材料，其选自非皂阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、皂、两性 表面活性剂和两性离子表面活性剂和其混合物。表面活性剂在组合物中的存在水平可以为0.1重量％至60重量％。
[0068]存在于组合物中的任何酶可以采用常规的稳定剂进行稳定，例如多元醇(例如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)。
_9] 本发明的非限制性实施方案的实施例
[0070]现将参照以下附图对本发明的各种非限制性实施方案作更具体的描述，其中:
[0071]附图1-3分别对应于表l_3a、b,并显示了酶AHA和Stainzyme单独使用以及两者一起使用在各种条件下的有效性数据。
[0072]克隆、制备以及纯化(来自游海假交替单胞菌菌株TAB23的)嗜冷淀粉酶的示例性方法:
[0073]克隆来自公众可获得的基因序列数据库的嗜冷酶的方法
[0074]在本发明的实施方案中，从经同行评议的文献中确定α淀粉酶(以下称为AHA)具有期望的嗜低温特性(Feller, G.等，1992; J.Biol.Chem.267 (8)，5217-5221)。从公众可获得的数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/2467084)(图1)获取包含所述淀粉酶的基因序列(GenBank登录号:X58627.1)，并将其经由电脑模拟(in siIico)进行修饰以使其能够以利于重组蛋白的表达的方式并入大肠杆菌相容性质粒载体PUC19。图2示出了用于在大肠杆菌中制备蛋白质的经修饰的序列，图3为一旦并入pUC19载体时的AHA的序列。作为Eurogentec Ltd (Southampton, UK)的服务,采用他们自身专有的方法化学合成了图2中所示的序列并将其插入到pUC19质粒(图3中所示的)。
[0075]制备嗜冷α -淀粉酶AHA的方法[0076]将IOng含AHA-编码DNA的pUC19质粒转化入化学活性的大肠杆菌菌株HB101，平铺到含100 μ g/ml羧节青霉素(carbenicillin)的LB琼脂上,于37°C下培育过夜。然后将单个菌落用于接种(2L摇瓶中)含100 μ g/ml羧苄青霉素的体积为0.5L的LB培养基。将瓶在定轨摇床上于18°C以120rpm孵化24-36小时，此时将细胞从培养基中分离出来(离心，10，OOOg, 15分钟，4°C )。将含重组AM的培养基在4°C储存直到需要时。
[0077]淀粉酶的组成性生产采用通过Roche Diagnostics以试剂盒(产品目录编号11876473316)形式供应的试剂在96-孔微量滴定板中如下进行证实:将10 μ I的待评价的各试样(或其稀释物)加入到所述微量滴定板的孔中(一式两份)。加入75 μ I试剂1，接着加入15 μ I试剂2。测试空白包含所述添加物，含AHA的生长培养基用未经使用的LB代替。将板在指定温度(通常为20°C)下孵化30分钟，然后在吸光度检测设定为405nm处的FluoStar Optima酶标仪上评价硝基苯酹的释放(由于淀粉酶活性)。
[0078]纯化重组AHA的方法
[0079]将一次的1-2L含AHA的LB生长培养基首先用无菌蒸馏水以1:2的比例进行稀释，然后将其使用以下方式浓缩到300ml至500ml之间:使用采用标称截留分子量为30，000道尔顿的再生纤维素过滤器装置的切向错流过滤。然后将(含AHA的)浓缩LB通过以下方式进行纯化:通过离子交换色谱(使用100ml的Macro-Prep High Q离子交换载体-BioRad),接着通过采用1.5cm x60cm S200色谱柱(GE Healthcare)进行凝胶过滤。使用上述淀粉酶测试确定含AHA的级分，并通过SDS-PAGE分析使用考马斯法蛋白污溃(Imperial stain -ThermoPierce)评价蛋白质在预期的49000道尔顿的存在(及其纯度)。
[0080]酶鉬合A、 B、C、D、E 如下。
[0081]在各组合A-D中，所述组合包含一种或多种嗜冷酶以及嗜温酶和/或嗜热酶。
[0082]在以下鉬合物中测试酶有效件
[0083]示例说明提高α-淀粉酶组合物溶液在宽的温度范围中的催化活性的方法，其中所述温度范围包括低温、中温和高温(如本文中所限定的术语)。
[0084]采用由Roche Diagnostics以试剂盒(产品目录编号11876473316)形式供应的试剂确定AHA、Stainzyme以及AHA和Stainzyme —起在20°C至50°C的温度之间的α -淀粉酶活性。
[0085]各酶的储备溶液(lmg/ml的 AHA, 0.5mg/ml 的 Stainzyme)在缓冲液 A (IOOmMHepes, IOOmM NaCl, ImM CaCl, ρΗ7.0)中制备。将所述酶储备溶液在缓冲液A中以1:125的比例进一步稀释并将其混合入冰上的如下各反应混合物中:
[0086]1)2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.3ml经稀释的Stainzyme
[0087]2) 2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.3ml经稀释的AHA
[0088]3) 2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.3ml缓冲液A(阴性对照)
[0089]4) 2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.15ml经稀释的Stainzyme、
0.15ml经稀释的AHA
[0090]将100 μ I的等分试样立即转移至0.2ml薄壁96-孔PCR板(每种反应混合物2整列孔，针对每个评价的温度给出两个重复的读数)并在能够运行温度梯度的PCR仪器(Techne TC-500)中如此培养:
[0091]设置所述仪器使得运行20°C与50°C之间的温度梯度。将等分到96-孔PCR板中的样品在上述条件下孵化正好30分钟，此时将PCR板迅速冷却到4°C。在该冷却步骤期间，将50 μ I的IM tris.base (未经缓冲的)加入到各孔以使反应停止(防止进一步释放硝基苯酚反应产物)。在充分混合之后，将100 μ I的各反应混合物转移到干净的平底微量滴定板中并使用Fluostar Optima酶标仪评价405nm处的吸光度。将各测试温度下的空白值从含酶混合物所获得的结果中扣除。结果示于图1中。
[0092]在所述试验的变型中，各酶的储备溶液(lmg/ml的AHA, 0.5mg/ml的Stainzyme)在缓冲液A (IOOmM Hepes, IOOmM NaCl, ImM CaCl, ρΗ7.0)中制备。将所述酶储备溶液用缓冲液A以1:250的比例进一步稀释并将其混合入冰上的如下各反应混合物中:
[0093]1)2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.15ml缓冲液A、0.15ml经稀释的 Stainzyme
[0094]2)2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.15ml缓冲液A、0.15ml经稀释的AHA
[0095]3) 2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.3ml缓冲液A(阴性对照)
[0096]4) 2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.15ml经稀释的Stainzyme、
0.15ml经稀释的AHA
[0097]将100 μ I的等分试样立即转移至0.2ml薄壁96-孔PCR板(每种反应混合物2整列孔，针对每个评价的温度给出两个重复的读数)并在能够运行温度梯度的PCR仪器(Techne TC-500)中如此培养:
[0098]设置所述仪器使得运行20°C与50°C之间的温度梯度。将等分到96-孔PCR板中的试样，在上述条件下孵化正好30分钟，此时将PCR板迅速冷却到4°C。在该冷却步骤期间，将50 μ I的IM tris.base (未经缓冲的)加入到各孔以使反应停止(防止进一步释放硝基苯酚反应产物)。在充分混合之后，将100 μ I的各反应混合物转移到干净的平底微量滴定板中并使用Fluostar Optima酶标仪评价405nm处的吸光度。将各测试温度下的空白值从含酶混合物所获得的结果中扣除。结果示于图2中。
[0099]在所述试验的另一个变型中，各酶的储备溶液(lmg/ml的AHA, 0.5mg/ml的Stainzyme)在缓冲液 A (1OOmM Hepes, IOOmM NaCl, ImM CaCl, ρΗ7.0)中制备。将所述酶储备溶液用缓冲液A以1:415的比例进一步稀释并将其混合进入冰上的如下各反应混合物中:
[0100]1)2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.3ml经稀释的Stainzyme
[0101]2) 2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.3ml经稀释的AHA
[0102]3) 2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.3ml缓冲液A(阴性对照) [0103]4) 2.25ml淀粉酶检测试剂1、0.45ml检测试剂2、0.15ml经稀释的Stainzyme、
0.15ml经稀释的AHA
[0104]将100 μ I的等分试样立即转移至0.2ml薄壁96-孔PCR板(每种反应混合物2整列孔，针对每个评价的温度给出两个重复的读数)并在能够运行温度梯度的PCR仪器(Techne TC-500)中如此培养:
[0105]设置所述仪器使得运行20°C与50°C之间的温度梯度。将等分到96-孔PCR板中的试样，在上述条件下孵化正好30分钟，此时将PCR板迅速冷却到4°C。在该冷却步骤期间，将50 μl的IM tris.base (未经缓冲的)加入到各孔以使反应停止(防止进一步释放硝基苯酚反应产物)。在充分混合之后，将100 μ I的各反应混合物转移到干净的平底微量滴定板中并使用Fluostar Optima酶标仪评价405nm处的吸光度。将各测试温度下的空白值从含酶混合物所获得的结果中扣除。结果示于图3中。
[0106]表1a和lb:AHA、Stainzyme以及两种酶一起的活性数据,其中将各酶的储备溶液以1:125的比例稀释以用于测试中(数据值为使用设定到405nm处的Fluostar Optima酶标仪在用测试底物在20°C与50°C之间的温度梯度孵化30分钟后获得的吸光度读数)。以图表形式不于图5中。
[0107]表1a 温度 22.533.8 CC )
[0108]
【权利要求】
1.一种酶促织物处理组合物，其包含以下的组合: i.一种或多种嗜冷酶，以及 ii.一种或多种嗜温酶和/或一种或多种嗜热酶。
2.根据前述权利要求中任一项的酶促织物处理组合物，其中所述嗜冷酶、嗜温酶以及优选嗜热酶均包含共同类别的酶。
3.根据权利要求2的酶促织物处理组合物，其中所述共同类别为蛋白酶或脂肪酶或糖基水解酶或裂解酶。
4.根据前述权利要求中任一项的酶促织物处理组合物，其中所述一种或多种嗜冷酶包含酯酶。
5.根据权利要求4的酶促织物处理组合物，其中所述一种或多种嗜冷酶包含脂肪酶。
6.使用根据前述权利要求中任一项的酶促织物处理组合物处理织物的方法，其中洗涤液的温度在整个单洗涤循环过程中在低温和中温之间变化。
7.根据权利要求6的方法，其中所述温度在整个单洗涤循环过程中在低温、中温和高温之间变化。
8.根据权利要求6或7的处理织物的方法，其中所述方法包括手洗处理和/或用洗涤机处理。
9.根据权利要求4-8中任一项的处理织物的方法，其中洗涤液的温度在至少一部分中不受使用者控制。
【文档编号】C11D11/00GK103748205SQ201280040074
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年8月16日 优先权日:2011年8月18日
【发明者】N·J·帕瑞, S·威尔森 申请人:荷兰联合利华有限公司