用于生产生物燃料和其他可再生材料的低多糖微生物的制作方法

用于生产生物燃料和其他可再生材料的低多糖微生物的制作方法
【专利摘要】野生型生物体的高细胞密度发酵，由于细胞外多糖的产生，能够引起粘度增加。具有由细胞外多糖的形成减少引起的干燥形态的突变微生物，被分离并进行性质研究。已显示，这些修饰的微生物的细胞外多糖组成与野生型微生物的多糖组成不同。除了细胞外多糖的形成减少之外，多种菌株的干燥形态突变体显示出降低的粘度、提高的氧传质和提高的在碳上的脂肪酸发酵得率。PTA-125072012.02.09PTA-125172012.02.09PTA-125162012.02.09PTA-125152012.02.09PTA-125142012.02.09PTA-125132012.02.09PTA-125122012.02.09PTA-125112012.02.09PTA-125102012.02.09PTA-125092012.02.09PTA-125062012.02.09PTA-125082012.02.09
【专利说明】用于生产生物燃料和其他可再生材料的低多糖微生物
[0001] 联合研究协议的参与方名称
[0002] 出于 35U. S. C. § 103(c) (2)的目的，BP Biofuels UK Limited 与 Martek Biosciences Corporation之间在可再生材料领域的联合研究协议在2008年12月18 日生效。同样出于 35U.S.C. §103 (c) (2)的目的，BP Biofuels UK Limited 与 Martek Biosciences Corporation之间在可再生材料领域的联合开发协议在2009年8月7日生 效。同样出于 35U.S.C. §103 (c) (2)的目的，BP Biofuels UK Limited 与 DSM Biobased Products and Services B.V.之间在可再生材料领域的联合开发协议在2012年9月1日 生效。

【技术领域】
[0003] 本申请涉及适合用于脂类生产的微生物、培养基、生物油、生物燃料和/或方法。

【背景技术】
[0004] 温室气体水平和气候变化问题已导致试图利用固定的碳与释放的二氧化碳之间 的天然循环的技术的开发。随着这些技术的进展，已开发了各种将原料转变成生物燃料的 方法。然而，尽管在技术上存在上述进展，对于提高可再生碳源向燃料的转变的经济可行 性，仍存在需求和希望。
[0005] 生物柴油燃料具有可再生、可生物降解、无毒和不含硫和芳香族化合物的明显优 点。但是它的缺点之一是高成本，这大部分是由植物油的成本造成的。因此，生物柴油燃料 生产的经济情况，受到油原料例如脂类的成本的限制。
[0006] 用于生物燃料和其他可再生材料的脂类可以在微生物例如酵母、藻类、真菌或细 菌中生产。在微生物中制造脂类包括在发酵罐或生物反应器中生长能够生产所需脂类的微 生物，分离微生物生物质，将其干燥，以及提取细胞内脂类。然而，生物燃料和其他可再生材 料应用需要高密度发酵，并且由于培养基粘度增加，许多微生物不能达到高水平的细胞密 度发酵，因此不适合用于高细胞密度应用例如生物燃料和其他可再生材料。
[0007] 对于产生的发酵液具有低粘度和高传质系数以支持高细胞密度水平的用于生产 生物燃料和其他可再生材料的微生物，存在着需求。
[0008] 附图简述
[0009] 并入本说明书并构成其一部分的【专利附图】

【附图说明】了本公开的实施方式，并且与描述一 起，用于解释本公开的特点、优点和原理。在所述图中：
[0010] 图1 :示出了随着溶液粘度增加，与2000cp情况相比的单位体积功耗（P/V)的降 低的图。该图示出了低和高氧传递条件两者。
[0011] 图2 :随着溶液的粘度，将氧递送到溶液所需的P/V的图。该图示出了低和高氧传 递条件两者。
[0012] 图3 :溶液粘度随以克每升为单位的多糖浓度变化的图。
[0013] 图4 :来自于野生型（缩写为"WT"）菌株MK29404的酸水解的多糖的离子交换层 析（IEC)的代表性结果。
[0014] 图5 :来自于突变体MK29404Dry-l菌株的酸水解的多糖的离子交换层析（IEC)分 析的代表性结果。
[0015] 图6 :来自于分离到的多糖的孔径排阻层析的代表性结果。
[0016] 实施方式的详细描述
[0017] 从微生物生产油类与从植物生产油类相比具有许多优点，例如短的生活周期，较 少的劳动力要求，对季节和气候的不依赖性和更容易的规模放大。微生物的培养同样不需 要大的土地面积，并且与食物生产不存在竞争。
[0018] 野生型（缩写为"WT"）生物体的高细胞密度发酵，由于由与促进脂类生产相同的 限氮条件所触发的细胞外多糖的产生，能够引起粘度增加。具有指示了多糖形成减少的"干 燥"形态和/或表型的突变体，被分离并进行性质研究。除了多糖形成减少之外，多种菌株 的干燥表型突变体还可以表现出降低的粘度、提高的氧传质、提高的在碳上的发酵得率和 提1?的脂类可提取性。
[0019] 本公开涉及产油微生物和培养这样的微生物以生产在工业和燃料中使用或作为 能量和食物来源的有用化合物的方法，所述化合物包括脂类、脂肪酸酯、脂肪酸、醛、醇、烷 烃、燃料、燃料和前体。可以选择在本申请中公开的微生物或对其进行遗传工程改造，以用 于本文描述的公开内容的方法或其他方面中。
[0020] 1.定义
[0021] 除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有本公开所属技术 领域的专业人员所通常理解的意义。下面的参考文献为技术人员提供了在本公开中使 用的许多术语的一般性定义：Singleton等，《微生物学和分子生物学词典》（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第二版，1994);《剑桥科学技术词典》（The Cambridge Dictionary of Science and Technology) (Walker 主编，1988);《遗传学词 汇》（The Glossary of Genetics)，第五版，R. Rieger 等主编，Springer Verlag (1991); Hale&Marham,《Harper Collin 生物学词典》（The Harper Collins Dictionary of Biology) (1991) ;Sambrook 等，《分子克隆：实验手册》（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第三版，2001，Cold Spring Harbor Press)。
[0022] 当在本文中使用时，除非另有规定，否则下面的术语具有归于他们的意义。
[0023] 当在本文中使用时，术语"具有"、"包含"、"含有"和"包括"是开放和包含性表述。 可替选地，术语"由……构成"是封闭和排他性表述。如果在权利要求书或说明书中在任何 术语的解释中存在任何含义不明之处，起草者的意图是开放和包含性表述。
[0024] 当在本文中使用时，术语"等"为名单中的项和/或成员的任何和所有个体和组合 提供支持，并为项和/或成员的个体和组合的等同物提供支持。
[0025] 对于方法或过程中步骤的次序、数目、顺序、省略和/或重复限制来说，除非明确 提供，否则起草者不打算暗示所述步骤的次序、数目、顺序、省略和/或重复限制属于本发 明的范围。
[0026] 对于范围来说，范围应该被解释为包括上限值与下限值之间的所有点，以例如为 包含在上限值与下限值之间的所有可能的范围，包括没有上边界和/或下边界的范围提供 支持。
[0027] 操作、百分率和程序的基础可以采取任何适合的基础，例如质量基础、体积基础、 摩尔基础等。如果没有指定基础，应该使用质量基础或其他适合的基础。
[0028] 当在本文中使用时，术语"基本上"是指主要是所规定和/或指明的情况。
[0029] 当在本文中使用时，术语"类似地"是指具有共同特征，例如没有显著差异。
[0030] 对于本领域技术人员来说，显然可以在不背离本发明的范围或精神的情况下对所 公开的结构和方法中做出各种修改和改变。特别是，任何实施方式的描述可以与其他实施 方式的描述自由组合，以产生两种或更多种要素和/或限制的组合和/或变化。在考虑了 本文公开的发明的说明书和实践之后，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员来说是 显而易见的。说明书和实施例打算仅仅被当作示例性的，本发明的真正范围和精神由下面 的权利要求书指定。
[0031] 当在本文中使用时，术语"生成"和"生产"是指制成、形成、创造、塑造、产生、使其 存在、制造、生长、合成等。根据某些实施方式，生产包括发酵、细胞培养等。生产可以包括 新的或其他生物体以及现有生物体的成熟。
[0032] 当在本文中使用时，术语"生长"是指尺寸增加，例如通过将材料同化到活生物体 等中。
[0033] 当在本文中使用时，术语"生物的"是指生命体系、生命过程、活的生物体等。生物 的可以是指来自于古菌、细菌和/或真核生物的生物体。生物的也可以是指来自于生物体 的衍生和/或修饰的化合物和/或材料。根据某些实施方式，生物的排除了化石化和/或 古代的材料，例如生命在至少约1，〇〇〇年前终止的材料。
[0034] 当在本文中使用时，术语"油"是指至少略微疏水和/或排斥水的烃类物质和/或 材料。油可以包括矿物油、有机油、合成油、精油等。矿物油是指至少部分源自于地球和/或 地下的石油和/或相关物质，例如化石燃料。"有机油"是指至少部分源自于植物、动物、其 他生物等的材料和/或物质。"合成油"是指至少部分源自于化学反应和/或过程的材料和 /或物质，例如可用于润滑油的材料和/或物质。油可以至少总体可溶于非极性溶剂和其他 烃类中，但是至少总体不溶于水和/或水性溶液中。油可以至少约50%溶于非极性溶剂中， 至少约75 %溶于非极性溶剂中，至少约90 %溶于非极性溶剂中，完全溶于非极性溶剂中， 约50%溶于非极性溶剂中至约100%溶于非极性溶剂中等，所有百分数都在质量基础上。
[0035] 当在本文中使用时，术语"生物油"是指至少部分源自于活的生物体例如动物、植 物、真菌、酵母、藻类、微藻、细菌等的烃类材料和/或物质。根据某些实施方式，生物油可以 适合于用作和/或转变成生物燃料和/或可再生材料。这些可再生材料可用于非人类动物 或人类使用的食品、膳食增补剂、化妆品或药物组合物的制造中。
[0036] 当在本文中使用时，术语"脂类"是指油类、脂肪、蜡、油脂、胆甾醇、甘油酯、甾类、 磷脂、脑苷脂、脂肪酸、脂肪酸相关化合物、衍生的化合物、其他油状物质等。脂类可以在活 细胞中制造，并且可以具有相对高的碳含量和相对高的氢含量以及相对低的氧含量。脂类 通常包括相对高的能量含量，例如在质量基础上。
[0037] 当在本文中使用时，术语"可再生材料"是指至少部分源自于能够被自然生态循环 和/或资源代替的来源和/或过程的物质和/或物品。可再生材料可以包括化学品、化学中 间体、溶剂、单体、寡聚体、聚合物、生物燃料、生物燃料中间体、生物汽油、生物汽油掺混料、 生物柴油、绿色柴油、可再生柴油、生物柴油掺混料、生物馏分、生物油等。在某些实施方式 中，可再生材料可以源自于活的生物体例如植物、藻类、细菌、真菌等。
[0038] 当在本文中使用时，术语"生物燃料"是指至少部分源自于可再生来源的适合用作 燃料和/或燃烧源的组分和/或料流。生物燃料可以可持续生产，和/或当例如与化石燃料 相比时具有减少的和/或没有净碳排放。根据某些实施方式，可再生来源可以排除例如从 地下挖掘或钻探的材料。在某些实施方式中，可再生资源可以包括单细胞生物体、多细胞生 物体、植物、真菌、细菌、藻类、栽培作物、非栽培作物、木材等。生物燃料可以适合用作运输 燃料，例如用于陆上交通工具、海上交通工具、空中交通工具等中。生物燃料可以适合用于 功率产生中，例如产生蒸汽、与适合的传热介质交换能量、产生合成气、产生氢气、发电等。
[0039] 当在本文中使用时，术语"生物柴油"是指源自于可再生来源的适合直接使用和/ 或掺混到柴油混合料和/或十六烷供应中的组分或料流。适合的生物柴油分子可以包括 脂肪酸酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、脂类、脂肪醇、烷烃、石脑油、馏程材料、石蜡族材 料、芳香族材料、脂族化合物（直链、支链和/或环状）等。生物柴油可用于压缩点火发动 机例如汽车柴油内燃机、卡车重型柴油发动机等中。在可替选方案中，生物柴油也可用于气 体涡轮机、加热器、锅炉等中。根据某些实施方式，生物柴油和/或生物柴油掺混物满足或 符合工业上接受的燃料标准，例如B20、B40、B60、B80、B99. 9、BlOO等。
[0040] 当在本文中使用时，术语"生物馏分"是指适合于直接使用和/或掺混到航空燃料 (喷气机）、润滑基础料、煤油燃料、燃料油等中的组分或料流。生物馏分可以源自于可再生 来源，并且具有任何适合的沸点范围，例如约l〇〇°C至约700°C、约150°C至约350°C等的沸 点范围。在某些实施方式中，生物馏分从最近活着的植物或动物材料，通过各种加工技术来 生产。根据一种实施方式，生物馏分可以在均质充量压缩点火（HCCI)发动机中用于燃料或 能源。HCCI发动机可以包括一种内燃形式，其中将充分混合的燃料和氧化剂（通常为空气） 压缩到自燃点。
[0041] 当在本文中使用时，术语"消耗"是指用掉、利用、吃、耗尽、转化等。根据某些实 施方式，消耗可以包括在细胞代谢（分解代谢和/或合成代谢）、细胞呼吸（好氧和/或厌 氧）、细胞繁殖、细胞生长、发酵、细胞培养等期间的和/或作为其一部分的过程。
[0042] 当在本文中使用时，术语"原料"是指用于供应、进料、提供等到例如生物体、机器、 过程、生产厂等的材料和/或物质。原料可以包括用于转化、合成等的原材料。根据某些实 施方式，原料可以包括适合于被生物体消耗的任何材料、化合物、物质等，例如糖类、己糖、 戊糖、单糖、二糖、三糖、多元醇（糖醇）、有机酸、淀粉、碳水化合物等。根据某些实施方式， 原料可以包括蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘油、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、其 他五碳糖、其他六碳糖、其他十二碳糖、含有糖的植物提取物、其他粗品糖等。原料可以是指 原料中存在的上面列出的一种或多种有机化合物。
[0043] 根据某些实施方式，可以使用一种或多种进料，将原料进料到发酵中。在某些实施 方式中，原料可以存在于在接种之前装入容器的培养基中。在某些实施方式中，除了装入容 器的培养基之外，原料可以通过一个或多个进料料流来添加。
[0044] 根据某些实施方式，原料可以包括木质纤维来源的材料，例如至少部分源自于生 物质和/或木质纤维来源的材料。
[0045] 根据某些实施方式，方法和/或过程可以包括添加辅助和/或协助生物体的其他 材料和/或物质，例如营养物、维生素、矿物质、金属、水等。其他添加剂的使用也在本公开 的范围之内，例如消泡剂、絮凝剂、乳化剂、破乳剂、增粘剂、降粘剂、表面活性剂、盐、其他流 体改性材料等。
[0046] 当在本文中使用时，术语"有机的"是指含碳化合物，例如碳水化合物、糖、酮、醛、 醇、木质素、纤维素、半纤维素、果胶、其他含碳物质等。
[0047] 当在本文中使用时，术语"生物质"是指至少部分源自于活生物体和/或最近活着 的生物体、例如植物和/或木质纤维来源的植物和/或动物材料和/或物质。包含生物质 的材料的非限制性实例包括蛋白质、脂类和多糖。
[0048] 当在本文中使用时，术语"细胞培养"是指碳水化合物的最终电子供体是氧、例如 好氧的代谢。细胞培养过程可以使用任何适合的生物体，例如细菌、真菌（包括酵母）、藻类 等。适合的生物培养过程包括天然存在的生物体和/或遗传修饰的生物体。
[0049] 当在本文中使用时，术语"发酵"是指细胞培养和碳水化合物的最终电子供体不是 氧、例如厌氧的代谢两者。发酵可以包括富含能量的化合物的酶控制的厌氧分解，例如碳水 化合物分解成二氧化碳和醇、有机酸、脂类等。在可替选方案中，发酵是指无机或有机化合 物的生物控制的转化。发酵过程可以使用任何适合的生物体，例如细菌、真菌（包括酵母）、 藻类等。适合的发酵过程包括天然存在的生物体和/或遗传修饰的生物体。
[0050] 生物过程可以包括任何适合的活系统和/或源自于活系统和/或过程的物品。生 物过程可以包括发酵、细胞培养、好氧呼吸、厌氧呼吸、分解代谢反应、合成代谢反应、生物 转化、糖化、液化、水解、解聚、聚合等。
[0051] 当在本文中使用时，术语"生物体"是指相互依赖和从属的要素的至少相对复杂的 结构，所述要素的关系和/或性质可以主要由它们在整体中的功能决定。生物体可以包括 被设计用于执行生命活动的个体，其具有在功能上分开但相互依赖的器官。生物体可以包 括活体，例如能够生长、繁殖等的活体。
[0052] 生物体可以包括任何适合的简单（单）细胞生物、复杂（多）细胞生物等。生物 体可以包括藻类、真菌（包括酵母）、细菌等。生物体可以包括微生物例如细菌或原生动物。 生物体可以包括一种或多种天然存在的生物体、一种或多种遗传修饰的生物体、天然存在 的生物体和遗传修饰的生物体的组合等。具有多种不同生物体的组合的实施方式，在本公 开的范围之内。可以使用任何适合的组合或生物体，例如一种或多种生物体，至少约2种生 物体，至少约5种生物体，约2种生物体至约20种生物体等。
[0053] 在一种实施方式中，生物体可以是真菌界的单细胞成员，例如酵母。可以使用 的产油酵母的实例包括但不限于下列产油酵母：蜂生假丝酵母（Candida apicola)，假 丝酵母属物种（Candida sp·)，弯曲隐球菌（Cryptococcus curvatus)，Cryptococcus terricolus，汉逊德巴利酵母（Debaromyces hansenii),产脂内抱霉（Endomycopsis vernalis), Geotrichum carabidarum, Geotrichum cucujoidarum, Geotrichum histendarum,林生地霉(Geotrichum silvicola), Geotrichum vu I gar e, Hyphopichia burtonii，产油油脂酵母（Lipomyces lipofer)，Lypomyces orentalis，斯达油脂酵母 (Lipomyces starkeyi), Lipomyces tetrasporous, Pichia mexicana,球红冬抱酵母 (Rodosporidium sphaerocarpum)，圆红冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)，澄黄红 酵母（Rhodotorula aurantiaca), Rhodotorula dairenensis, Rhodotorula diffIuens, Rhodotorula glutinus，粘红酵母（Rhodotorula glutinis)，瘦弱红酵母（Rhodotorula gracilis)，牧草红酵母（Rhodotorula graminis)，小红酵母（Rhodotorula minuta)，粘 质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa)，粘质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa)， Rhodotorula terpenoidalis, Rhodotorula toruloides,浅红掷抱酵母（Sporobolomyces alborubescens), Starmerella bombicola, Torulaspora delbruekii,球有抱圆酵母 (Torulaspora pretoriensis), Trichosporon behrend,芸薹丝抱酵母（Trichosporon brassicae), Trichosporon domesticum, Trichosporon laibachii, Trichosporon loubieri, Trichosporon loubieri, Trichosporon montevideense, 3? 芽丝抱酵母 (Trichosporon pullulans),丝抱酵母属物种(Trichosporon sp. ), Wickerhamomyces canadensis,角军月旨耳氏酵母（Yarrowia Iipolytica)和 Zygoascus meyerae。
[0054] 生物体可以在任何适合的条件例如厌氧、好氧、光合、异养等条件下操作、起作用 和/或生活。
[0055] 当在本文中使用时，术语"产油"是指带有油、含有油和/或产生油类、脂类、脂肪 和/或其他油样物质。油类、脂类、脂肪和/或其他油样物质可以在细胞内部或外部生产。 产油可以包括产生至少约20重量％的油、至少约30重量％的油、至少约40重量％的油、至 少约50重量％的油、至少约60重量％的油、至少约70重量％的油、至少约80重量％的油 等的生物体。产油可以指称在培养、脂类积累期间、收获条件下等的微生物。
[0056] 当在本文中使用时，术语"遗传工程"是指生物体的至少一部分遗传密码和/或遗 传密码的表达的有意操作和/或修改。
[0057] 当在本文中使用时，术语"遗传修饰"是指向生物体导入遗传变化的任何方法。非 限制性实例包括基因组突变，一个或多个基因、蛋白质部分、启动子区、非编码区、染色体等 的添加和/或移除。遗传修饰可以是随机或非随机的。遗传修饰可以包含例如突变，并且 可以是插入、缺失、点突变、置换和任何其他突变。遗传修饰还可用于指称非野生型生物体 与野生型生物体的遗传差异。
[0058] 当在本文中使用时，术语"未修饰的生物体"或"未修饰的微生物"是指至少总体 上没有由外力例如人类、机器等进行的干预行动的生物体、培养物、单细胞、生物区系等。当 在本文中使用时，未修饰的微生物通常是特定微生物在引入本申请的遗传修饰之前的存在 形式。在大多数实施方式中，未修饰的微生物是微生物的野生型菌株。然而，本文中所定义 的未修饰的微生物可以是在导入本公开的遗传修饰之前在遗传上改变的生物体。例如，可 以从ATCC获得的包含某个基因的敲除突变的酵母菌株，根据这一定义将被认为是未修饰 的微生物，术语未修饰的微生物还涵盖不具有与多糖生产或发酵液粘度相关的遗传修饰的 生物体。
[0059] 在某些实施方式中，生产生物体包括生物体包含脂肪酸的情况和/或产生例如在 一个或多个囊泡和/或袋内或其上含有脂肪酸的生物体。在可替选方案中，脂肪酸可以相 对不包含在细胞内和/或在细胞外部，例如相对摆脱限制性的膜。生产生物体可以包括细 胞繁殖（更多细胞）以及细胞生长（增加细胞大小和/或内含物，例如通过提高脂肪酸含 量）。繁殖和生长可以至少基本上彼此同时、至少基本上彼此排他、至少部分同时和至少部 分排他等地发生。
[0060] 多糖（也称为"聚糖"）是由通过糖苷键联结在一起的单糖构成的碳水化合物。多 糖是宽泛定义的分子，所述定义包括细胞间多糖、分泌的多糖、细胞外多糖、细胞壁多糖等。 纤维素是构成某些植物细胞壁的多糖的实例。纤维素可以被酶解聚以产生单糖例如木糖和 葡萄糖以及更大的二糖和寡糖。在多糖解聚后每种单糖组分的量，在本文中被定义为单糖 分布情况。某些多糖包含非碳水化合物组成成分，例如乙酸酯、丙酮酸酯、琥珀酸酯和磷酸 酯。
[0061] 当在本文中使用时，术语"脂肪酸"是指饱和和/或不饱和的单羧酸，例如在脂肪 和脂肪油中采取甘油酯的形式。甘油酯可以包括酰基甘油酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三 酯等。脂肪酸还指具有直链或支链烃基的羧酸，所述烃基具有约8至约30个碳原子。所述 烃基包含1至约4个不饱和位点，一般为双键或π键。这样的脂肪酸的实例是月桂酸、硬 脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、反油酸、亚麻酸（linoelaidicic acid)、 二十碳稀酸、植烷酸、山嵛酸和肾上腺酸。
[0062] 双键是指由分子中的两个原子共享的两对电子。
[0063] 当在本文中使用时，术语"单元"是指被视为整体的单一量，用于执行一种或多种 特定功能和/或结果的一件装置和/或装置复合体等。
[0064]当在本文中使用时，术语"料流"是指物质和/或材料的流动和/或供应，例如稳 定的连续流。料流的流动可以是连续的、离散的、间歇的、分批的、半分批的、半连续的等。 [0065] 当在本文中使用时，术语"容器"是指物质例如液体、气体、发酵液等的容器和/或 承装物。容器可以包括任何适合的尺寸和/或形状，例如至少约1升、至少约1，〇〇〇升、至 少约100, 000升、至少约1，000, 000升、至少约1，000, 000, 000升、小于约1，000, 000升、约 1升至约1，〇〇〇, 〇〇〇, 000升等。容器可以包括罐、反应器、塔、缸、桶、盆等。容器可以包括 任何适合的辅助设备，例如泵、搅拌器、通气设备、热交换器、盘管、夹套、加压系统（正压和 /或真空）、控制系统等。
[0066] 当在本文中使用时，术语"配置"是指放置就位、定位、准备就绪等。生物体可以被 自由地掺入培养液中（悬浮），和/或固定在容器的至少一部分内的适合的培养基和/或表 面上。生物体可以总体上比培养液密度更大（下沉），总体上比培养液更轻（漂浮），总体 上相对于培养液中性浮力等。
[0067] 当在本文中使用时，术语"适应"是指使适合于特定用途、目的等。
[0068] 当在本文中使用时，术语"满足"是指达到、获得、满足、赶得上等。
[0069] 当在本文中使用时，术语"超过"是指超出、超越等。根据某些实施方式，超过包括 比阈值量和/或数量高至少2%。
[0070] 以克干重每升（发酵培养基或培养液）度量的（生物体的）细胞密度，度量和/ 或指示了生物体的生产率、发酵培养基（培养液）的利用率和/或发酵容器容积的利用率。 提高的细胞密度可以导致特定产物的生产增加和设备的利用率增加（较低的资本成本）。 一般来说，提高的细胞密度是有益的，但过高的细胞密度可以导致更高的混合和泵送成本 (粘度增加）和/或移除热量的困难（较低的传热系数）等。
[0071] 当在本文中使用时，术语"粘度"是指流体的决定对剪切力的内部阻力的物理性 质。粘度可以通过几种方法包括例如粘度计来测量，典型的单位为厘泊（CP)。粘度也可以 使用其他已知装置例如流变计来测量。
[0072] 当在本文中使用时，术语"传质"是指物质从一个位置向另一个位置的净移动。通 常，化学物质在两相之间通过界面转移或通过相扩散。传质的驱动力是浓度差；分子的随机 运动引起物质从高浓度区域向低浓度区域的净转移。对于分离过程来说，热动力学决定分 离程度，而传质决定分离发生的速率。一种重要的传质是氧和其他营养物向发酵液中的传 质。
[0073] 传质速率的量可以通过传质系数（m/s)的计算和应用来定量，所述传质系数是与 传质速率、传质面积和作为驱动力的浓度梯度相关的扩散速率常数。这可用于定量多个相、 不可混溶和可部分混溶的流体混合物之间（或流体与多孔固体之间）的传质。传质的定 量允许设计和制造可以满足特定要求的发酵过程设备，估算在真正的生命情形中发生的情 况。
[0074] 当在本文中使用时，术语"密度"是指材料和/或物质的每单位体积的质量。细胞 密度是指每单位体积的细胞质量，例如每单位体积的活细胞重量。它通常被表示成克干重 每升。细胞密度可以在方法中的任何适合的点测量，例如在开始发酵之后、发酵期间、发酵 完成之后、整个批次结束后等。
[0075] 当在本文中使用时，术语"FAME"是指脂肪酸甲酯。术语FAME也可用于描述用来 测定微生物中的脂肪酸甲酯的量或百分率的测定法。
[0076] 当在本文中使用时，术语"游离脂肪酸当量"是指使用来自于美国油类化学家学 会（American Oil Chemists Society)的试验方法Celb-89测定，并乘以0.953的系数的 FAME。
[0077] 当在本文中使用时，术语"得率"是指与消耗的数量相比产生和/或返回的量和/ 或数量。作为非限制性实例，消耗的数量可以是糖、碳、氧气或任何其他营养物。"得率"也 可以是指与流逝的时间段相比产生和/或返回的量和/或数量。
[0078] 当在本文中使用时，术语"发酵得率"、"脂肪酸得率"或"糖得率"意味着产生的总 估算游离脂肪酸当量（以重量计）除以在发酵过程中消耗的总糖（以重量计）。
[0079] 脂肪酸得率可以在方法中的任何适合的点测量，例如在开始发酵之后、发酵期间、 发酵完成之后、整个批次结束后等。
[0080] 一般来说，较高的脂肪酸含量是理想的，并且可以提供脂肪酸从细胞材料的剩余 物和/或残留物的更容易的提取和/或移除，以及原料和/或设备的提高的利用率和/或 生产率。
[0081] 一般来说，较高的脂肪酸生产率产生更经济的过程，因为更快地制造产物（即循 环时间减少）是合乎需要的。
[0082] 较高的脂肪酸得率一般是优选的，因为它表明碳从糖转变成脂肪酸而不是副产物 和/或细胞物质。
[0083] 用在每克消耗的氧的基础上产生的脂肪酸的克数表示的脂肪酸的氧得率，度量和 /或指示了用于生产脂肪酸的氧的量和/或速率。较高的氧需求可以增加资本成本和/或 运行费用。
[0084] 当在本文中使用时，术语"含量"是指含有的特定材料的量。干质量基础是指基本 上不含水。脂肪酸含量可以在方法中的任何适合的点测量，例如在开始发酵之后、发酵期 间、发酵完成之后、整个批次结束后等。
[0085] 当在本文中使用时，术语"生产率"是指生产和/或制造的量和/或状态，例如每 单位容积的速率。脂肪酸生产率可以在方法中的任何适合的点测量，例如在开始发酵之后、 发酵期间、发酵完成之后、整个批次结束后等。生产率可以在固定的时间测量，例如每天的 中午至中午。在可替选方案中，生产率可以在适合的滚动基础上测量，例如任何24小时的 时间段。用于测量生产率的其他基础在本公开的范围内。
[0086] 2.微牛物
[0087] 一方面，公开了一种适合于可再生材料生产的产油微生物。
[0088] 一些微生物产生显著量的非脂类代谢物例如多糖。已知多糖的生物合成使用细胞 可以获得的显著比例的总代谢能。正如在本文中公开的，产脂类细胞的诱变以及随后对多 糖生产减少或消除的筛选，产生了能够以更高得率生产脂类的新菌株。这些显著且出人意 料的改进可能起因于培养物的提高的传质特性、碳向脂肪酸的更高流量或这两种机制。对 于某些微生物来说，可能通过尚未定性的机制提高脂类得率。
[0089] 在某些实施方式中，公开的微生物包含修饰。在某些实施方式中，所述修饰是在未 修饰的微生物中不存在的遗传修饰。
[0090] 遗传修饰可以通过许多方法导入。在某些实施方式中，遗传修饰通过遗传工程导 入。在其他实施方式中，遗传修饰通过随机突变导入。
[0091] 在特定实施方式中，修饰影响多糖合成。在其他实施方式中，修饰影响一个或多个 编码对多糖合成有贡献的蛋白的基因。在其他实施方式中，修饰影响一个或多个编码控制 多糖合成的蛋白的调控基因。在另外的其他实施方式中，修饰影响一个或多个非编码的调 控区。在其他实施方式中，一个或多个基因被上调或下调以便降低多糖生产。
[0092] 在另外的其他实施方式中，修饰影响多糖运输和/或分泌。在某些实施方式中，修 饰影响一个或多个编码有助于多糖运输和/或分泌的蛋白的基因。在其他实施方式中，修 饰影响一个或多个编码控制多糖运输和/或分泌的蛋白的调控基因。在另外的其他实施方 式中，修饰影响一个或多个非编码的调控区。在其他实施方式中，一个或多个基因被上调或 下调以便减少多糖运输和/或分泌。
[0093] 在其他实施方式中，遗传修饰影响一个或多个控制脂肪酸合成的基因。这些基因 包括脂肪酸代谢途径中的分支点。在其他实施方式中，所述基因被上调或下调以便增加脂 类生产。根据本公开的方法，适合于上调的酶的实例包括丙酮酸脱氢酶，其在将丙酮酸转变 成乙酰CoA中发挥作用。丙酮酸脱氢酶的上调可以增加乙酰CoA的生产，由此增加脂肪酸 合成。乙酰CoA羧化酶催化脂肪酸合成中的起始步骤。因此，这种酶可以被上调以增加脂 肪酸的生产。还可以通过酰基载体蛋白（ACP)的上调来增加脂肪酸生产，所述酰基载体蛋 白在脂肪酸合成期间携带生长中的酰基链。甘油-3-磷酸酰基转移酶催化脂肪酸合成的限 速步骤。这种酶的上调可以增加脂肪酸生产。
[0094] 根据本公开的方法，潜在适合于下调的酶的实例包括柠檬酸合酶，其消耗作为三 羧酸循环（TCA)的一部分的乙酰CoA。柠檬酸合酶的下调可以迫使更多乙酰CoA进入脂肪 酸合成途径。
[0095] 可以使用产生适合的脂类或烃类的任何生物物种，尽管天然产生高水平的适 合脂类或烃类的微生物是优选的。由微生物生产烃类综述在下列文献中：Metzger等， Appl Microbiol Biotechnol (2005)66:486-496,以及"美国能源部水生物种计划回顾： 来自于藻类的生物柴油，'（A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae), NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay，John Benemann 和 Paul Roessler(1998)〇
[0096] 在某些实施方式中，产生脂类的微生物或可以从其提取、回收或获得脂类的 微生物是真菌。可以使用的真菌的实例包括但不限于下列属和种的真菌：被孢霉属 (Mortierella)，Mortierrla vinacea，高山被抱霉（Mortierella alpine)，德巴利腐 霉（Pythium debaryanum)，卷枝毛霉（Mucor circinelloides)，赫曲霉（Aspergillus ochraceus)， 土曲霉(Aspergillus terreus)， Pennicillium iilacinum， Hensenulo， 毛壳菌属（Chaetomium)，枝抱菌属（Cladosporium)，畸枝霉属（Malbranchea)，根霉属 (Rhizopus)和腐霉属（Pythium)。
[0097] 在某种实施方式中，公开的产油的修饰微生物是酵母。产油酵母中的基因突变 的实例可以在文献中找到（参见Bordes等，J. Microbiol. Methods，6月27日（2007))。 在某些实施方式中，所述酵母属于红酵母属（Rhodotorula)、Pseudozyma或锁掷酵母属 (SpOTidiobolus)。可以使用的产油酵母的实例包括但不限于下列产油酵母：蜂生假丝 酵母（Candida apicola)，假丝酵母属物种（Candida sp.)，弯曲隐球菌（Cryptococcus curvatus) ,Cryptococcus terricolus，汉逊德巴利酵母（Debaromyces hansenii)，产月旨内 抱霉（Endomycopsis vernalis)，Geotrichum carabidarum，Geotrichum cucujoidarum， Geotrichum histendarum，林生地霉(Geotrichum silvicola), Geotrichum vulgare， Hyphopichia burtonii，产油油月旨酵母（Lipomyces lipofer), Lypomyces orentalis，斯 达油月旨酵母（Lipomyces starkeyi), Lipomyces tetrasporous，Pichia mexicana，球红冬 抱酵母（Rodosporidium sphaerocarpum)，圆红冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)， 禮黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca)， Rhodotorula dairenensis, Rhodotorula diffluens，Rhodotorula glutinus，粘红酵母（Rhodotorula glutinis)，痩弱红酵母 (Rhodotorula gracilis)，牧草红酵母（Rhodotorula graminis)，小红酵母（Rhodotorula minuta)，粘质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa)，粘质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa)，Rhodotorula terpenoidalis, Rhodotorula toruloides，浅红掷抱酵母 (Sporobolomyces alborubescens)， Starmerella bombicola， Torulaspora delbruekii， 球有抱圆酵母（Torulaspora pretoriensis)，Trichosporon behrend，芸薹丝抱酵母 (Trichosporon brassicae)， Trichosporon domesticum， Trichosporon laibachii， Trichosporon loubieri，Trichosporon loubieri，Trichosporon montevideense， 范芽丝抱酵母（Trichosporon pullulans)，丝抱酵母属物种（Trichosporon sp.)， Wickerhamomyces canadensis，角军月旨耳氏酵母(Yarrowia Iipolytica)和 Zygoascus meyerae。
[0098] 在其他实施方式中，所述酵母属于近玫色锁掷酵母（Sporidiobolus paraiOseus)。在特定实施方式中，所公开的微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12508的 微生物（菌株MK29404(Dirl-13J);保藏单位：美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美 国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2月9日；微生物分类命名：近玫色锁掷酵母 (Sporidiobolus pararoseus))。在另一种特定实施方式中，所述微生物是对应于ATCC保 藏号PTA-12509的微生物（菌株MK29404(Dirl-182J);保藏单位：美国典型菌种保藏中心 (ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2月9日；微生物分类命名：近 玫色锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus))。在另一种特定实施方式中，所述微生物是对 应于ATCC保藏号PTA-12510的微生物（菌株MK29404(Dryl-173N);保藏单位：美国典型菌 种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2月9日；微生物 分类命名：近玫色锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus))。在另一种特定实施方式中，所 述微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12511的微生物（菌株MK29404(Dry55);保藏单位：美 国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2月9日； 微生物分类命名：近玫色锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus))。在另一种特定实施方式 中，所述微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12512的微生物（菌株MK29404(Dry41);保藏单 位：美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2 月9日；微生物分类命名：近玫色锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus))。在另一种特定 实施方式中，所述微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12513的微生物（菌株MK29404 (Dryl); 保藏单位：美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期： 2012年2月9日；微生物分类命名：近玫色锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus))。在 另一种特定实施方式中，所述微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12515的微生物（菌株 MK29404(Dryl-147D);保藏单位：美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马 纳萨斯；保藏日期：2012年2月9日；微生物分类命名：近玫色锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus))。在另一种特定实施方式中，所述微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12516 的微生物（菌株MK29404(Dryl-72D);保藏单位：美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美 国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2月9日；微生物分类命名：近玫色锁掷酵母 (Sporidiobolus pararoseus))。
[0099] 在其他实施方式中，所述酵母属于Rhodotorula ingeniosa。在特定实施方式中， 公开的微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12506的微生物（菌株MK29794(KDryl6-l);保藏 单位：美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年 2月9日；微生物分类命名：红酵母物种（Rhodotorula sp.))。在另一种特定实施方式中， 公开的微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12507的微生物（菌株MK29794(KDry7);保藏单 位：美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2 月9日；微生物分类命名：红酵母物种（Rhodotorula sp.))。在另一种特定实施方式中，公 开的微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12514的微生物（菌株MK29794(K200Dryl);保藏单 位：美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2 月9日；微生物分类命名：红酵母物种（Rhodotorula sp.))。在另一种特定实施方式中，公 开的微生物是对应于ATCC保藏号PTA-12517的微生物（菌株MK29794(33Dryl);保藏单位： 美国典型菌种保藏中心（ATCC)，地址：美国弗吉尼亚州马纳萨斯；保藏日期：2012年2月9 日；微生物分类命名：红酵母物种（Rhodotorula sp.))。
[0100] 在某些实施方式中，修饰的酵母具有干燥形态，而未修饰的酵母不具有干燥形态。 在其他实施方式中，未修饰的酵母具有野生型酵母菌株的形态。
[0101] 3.培养备件
[0102] 根据某些实施方式，产油微生物在例如生产期间在培养物中生长。在某些实施方 式中，修饰的微生物的培养包含与未修饰的微生物的培养基本上相似的条件。
[0103] 可以出于进行遗传操作和出于随后烃类（例如脂类、脂肪酸、醛、醇和烷烃）的生 产两种目的来培养微生物。前一种类型的培养在小规模上，并且至少开始时在初始微生物 可以生长的条件下进行。例如，如果初始微生物是光合自养生物，则起始培养在光存在下进 行。如果微生物被进化或工程化以不依赖光生长，则可以改变培养条件。出于烃类生产目 的的培养通常在大规模上进行。在某些实施方式中，在培养期间存在固定碳源。在培养期 间，也可以将培养物在不同时间暴露于光，包括例如没有、一些或所有时间。
[0104] 对于能够在固定碳源上生长的生物体来说，固定碳源可以是例如葡萄糖、果糖、蔗 糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡萄糖胺、甘油、红藻糖苷和/或葡萄糖醛酸。一 种或多种碳源可以以至少约50 μ M、至少约100 μ M、至少约500 μ M、至少约5mM、至少约50mM 和至少约500mM浓度的一种或多种外源提供的固定碳源来供应。一些微生物在不存在光的 情况下可以通过利用固定碳源例如葡萄糖或乙酸盐来生长。这样的生长被称为异养生长。
[0105] 也可以操控其他培养参数。非限制性实例包括操纵培养基的pH、微量元素和其他 培养基组成成分的身份和浓度。培养基可以是水性的，例如含有显著部分的水。
[0106] 修改发酵条件是尝试提高所需脂类或其他生物产品的得率的一种方式。然而，这 种策略具有有限的价值，因为促进脂类生产的条件（高碳氮比）也促进多糖生产。
[0107] 可以调整过程条件来降低多糖产率以减少生产成本。例如，在某些实施方式中，在 存在有限浓度的一种或多种营养物例如碳和/或氮、磷或硫，同时提供过量的固定碳能量 例如葡萄糖的情况下培养微生物。与在提供过量氮的培养中的微生物脂类得率相比，限氮 倾向于提高微生物的脂类得率。可以将微生物在有限量的营养物存在下培养一部分总培养 时间段或整个时间段。在特定实施方式中，在总培养时间段中，营养物浓度在限制浓度和非 限制浓度之间循环至少两次。
[0108] 为了提高脂类得率，可以在产油微生物的原料中使用乙酸。乙酸直接进料到起始 脂肪酸合成的代谢点（即乙酰CoA)中；因此在培养中提供乙酸能够增加脂肪酸生产。通常， 将微生物在足够量的乙酸存在下培养以提高微生物脂类得率和/或微生物脂肪酸得率，特 别是高于不存在乙酸情况下的微生物脂类（例如脂肪酸）得率。
[0109] 在另一种实施方式中，通过将微生物在脂类途径酶（例如脂肪酸合成酶）的一种 或多种辅因子的存在下进行培养，来提高脂类得率。一般来说，辅因子的浓度足以使脂类 (例如脂肪酸）得率提高到超过不存在辅因子情况下的微生物脂类得率。在特定实施方式 中，通过在培养中包含含有编码辅因子的外源基因的微生物，向培养提供辅因子。或者，可 以通过包含含有编码参与辅因子合成的蛋白的外源基因的微生物，向培养提供辅因子。在 某些实施方式中，适合的辅因子包括酯类途径酶所需的任何维生素，例如：生物素，泛酸。在 其他实施方式中，可以将编码辅因子或参与这样的辅因子的合成的基因导入到微生物（例 如微藻、酵母等）中。
[0110] 4.多糖
[0111] 另一方面，本申请中公开的产油微生物产生多糖。在某些实施方式中，修饰的微生 物产生多糖。在其他实施方式中，未修饰的微生物产生多糖。在另外的其他实施方式中，修 饰的微生物和未修饰的微生物两者产生多糖。
[0112] 多糖在合成时可能保留在细胞之内（细胞内）、配置在细胞壁内和/或分泌到细胞 外部（细胞外）。具有低的细胞外多糖水平的微生物，可以根据在琼脂平板上菌落形态的目 测观察来鉴定。产生较高水平的细胞外多糖的菌落在外观上是湿润的，并且非常软。如果 将平板倒置（上侧朝下放置），菌落将滴落在平板的另一侧上。这种形态是产生大量细胞外 多糖的细胞特征性的。低水平细胞外多糖突变体，可以通过看起来不湿润的形态，在本文中 表述为"干燥"形态来鉴定。这些低多糖菌落不软，而是僵硬和粉末状的。
[0113] 在一种实施方式中，修饰的微生物具有干燥形态。在某些实施方式中，修饰的微生 物具有干燥形态，而未修饰的微生物不具有干燥形态。在某些实施方式中，未修饰的微生物 具有野生型微生物的形态。
[0114] -种充分定性的细胞外多糖是黄原胶多糖（Shu和Yang, Biotechnol Bioeng. Mar 5 ;35 (5) : 454-68 (1990))。在黄原胶途径中，大多数研究努力试图提高黄原胶多糖的生产以 用于工业应用。然而，当分泌的多糖的水平升高时观察到几个伴随发酵的问题，并且发酵变 得成本更高。
[0115] 本文公开了新的以较低水平产生多糖的微生物。所公开的微生物的多糖生产可以 在任何水平上降低，包括在基因、蛋白质、蛋白质折叠或修饰、合成途径或细胞/细胞外水 平上。本发明不限于任何特定的多糖降低机制。
[0116] 在修饰和未修饰的微生物两者都产生细胞外多糖的某些实施方式中，修饰的微生 物与未修饰的微生物相比产生更少的细胞外多糖。在某些实施方式中，未修饰的微生物通 常包括所述微生物的野生型菌株。在某些实施方式中，所述微生物产生比未修饰的微生物 少至少4倍的多糖。在其他实施方式中，所述微生物产生比未修饰的微生物少至少1. 5、 2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0、9· 0、10、15、20、30、40 或 50 倍的细胞外多糖。在某些 实施方式中，由于与多糖相关的基因中的突变，在修饰的微生物中多糖的生产较低。
[0117] 细胞外多糖可以存在于本公开的微生物产生或得自于它们的发酵液中。发酵液可 以包括尤其是碳源、营养物、生物体、生物分泌物、水、副产物、废产物等。细胞外多糖通常由 于细胞输出（例如分泌）或例如在细胞死亡期间的细胞膜破裂而存在于细胞外部。如果存 在于细胞外部，多糖一般也被称为"胞外多糖"。修饰的微生物、未修饰的微生物或两者可能 产生包含多糖的发酵液。本文中还公开了产生多糖的未修饰的微生物，但修饰的微生物不 产生多糖。
[0118] 细胞外多糖可以使用本领域普通技术人员可以容易地计算的几种不同度量来定 量。在一种实施方式中，细胞外多糖被定量为由微生物产生的每单位体积发酵液的多糖质 量。由本公开的微生物产生的每单位体积发酵液的多糖质量，可以被本领域普通技术人员 容易地计算。可用于定量细胞外多糖的其他非限制性度量包括：总可溶性多糖的绝对水平 (克/体积）；总水解可溶性多糖的各个糖的绝对水平（克/体积）；可溶性多糖与总生物 质之比；可溶性生物质与贫生物质之比：可溶性多糖与脂类之比；多糖与可提取脂类之比； 每个细胞的多糖的量；粘度的绝对水平；和/或粘度与使用任何上述值的可溶性多糖之比。 这些度量的确定完全在本领域的普通技术之内。
[0119] 在某些实施方式中，修饰的微生物产生每升发酵液低于约22. 8克的细胞外多糖。 在其他实施方式中，修饰的微生物产生每升发酵液低于约6克的细胞外多糖。在其他实施 方式中，修饰的微生物产生每升发酵液低于约3克的细胞外多糖。在其他实施方式中，修饰 的微生物产生每升发酵液低于约1克的细胞外多糖。在其他实施方式中，微生物产生每升 发酵液低于约〇. 5、0. 25、0. 1、0. 05、0. 01克或更少的细胞外多糖。
[0120] 在修饰和未修饰的微生物两者都产生包含细胞外多糖的发酵液的某些实施方式 中，修饰的微生物产生的发酵液包含比等体积的未修饰微生物的发酵液更少的多糖。在一 种实施方式中，修饰的微生物与未修饰的微生物相比，每升发酵液产生少至少约2倍的细 胞外多糖。在其他实施方式中，修饰的微生物与未修饰的微生物相比，每升发酵液产生少至 少约4倍的多糖。在其他实施方式中，修饰的微生物与未修饰的微生物相比，每升发酵液 产生少至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100或1000倍的细胞外多糖。在其他实施方 式中，修饰的微生物与未修饰的微生物相比，每升发酵液产生少至少2、5、10、20、30、40、50、 75、90或99%的多糖。
[0121] 也可以通过计算由所描述的微生物产生的发酵液中脂类与多糖之比来定量细胞 外多糖。这种计算可以由本领域普通技术人员容易地获得。
[0122] 在某些实施方式中，本发明的修饰的微生物产生的发酵液具有高于约2的脂类与 细胞外多糖的比率。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有约10的脂类与 细胞外多糖的比率。在另外的其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有高于约10 的脂类与细胞外多糖的比率。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有约50的 脂类与细胞外多糖的比率。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有约70的脂 类与细胞外多糖的比率。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有约100、200、 300、400、500或1000或更高的脂类与细胞外多糖的比率。
[0123] 可以通过计算由本公开的微生物产生的发酵液的每单位总生物质的多糖质量来 定量细胞外多糖。这种计算可以由本领域普通技术人员容易地获得。
[0124] 在某些实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液包含每克总培养液生物质约0. 20 克细胞外多糖（参见表4)。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液包含每克总培 养液生物质至少约〇. 04克多糖。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液包含每 100克总培养液生物质约0. 1、〇. 5、1. 0或10. 0克的细胞外多糖。
[0125] 在修饰和未修饰的微生物两者都产生包含细胞外多糖的发酵液的某些实施方式 中，修饰的微生物产生的发酵液与未修饰微生物的发酵液相比包含每克总培养液生物质更 少的细胞外多糖克数（参见表4)。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液与未修 饰微生物的发酵液相比包含每克总培养液生物质少约2倍的细胞外多糖克数。在又一些 其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液与未修饰微生物的发酵液相比包含每克总培 养液生物质少约5倍的细胞外多糖克数。在其他实施方式中，修饰的微生物与未修饰微生 物的发酵液相比，产生每克总培养液生物质少至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100或 1000倍的细胞外多糖。在其他实施方式中，修饰的微生物与未修饰微生物的发酵液相比，产 生每克总培养液生物质少至少2、5、10、20、30、40、50、75、90或99%的细胞外多糖。
[0126] 本文描述的新的修饰的微生物产生特定发酵液。这种发酵液包含特定比率的某些 生物组分。在某种实施方式中，由修饰的微生物产生的发酵液具有高于约2的脂类与细胞 外多糖的比率。在另一种实施方式中，由修饰的微生物产生的发酵液具有约10的脂类与细 胞外多糖的比率。在另一种实施方式中，由修饰的微生物产生的发酵液具有高于约10的 脂类与细胞外多糖的比率。在其他实施方式中，由修饰的微生物产生的发酵液具有约100、 200、300、400、500或1000或更高的脂类与细胞外多糖的比率。
[0127] 多糖结构一般包含通过糖苷键联结在一起的单糖。在许多所描述的实施方式中， 未修饰和修饰的微生物两者都产生多糖。本文中公开的是以比未修饰的微生物更低的水平 产生多糖的新的修饰的微生物。在这些修饰和未修饰的微生物两者都产生细胞外多糖的实 施方式中，两种微生物的多糖可能具有相同结构，并且修饰的微生物与未修饰的微生物相 比可能产生更少量的所述相同多糖结构。然而，还设想了产生与未修饰的微生物不同的细 胞外多糖结构的修饰的微生物。在这些实施方式中，由于多糖结构与未修饰的微生物不同， 因此新的修饰的微生物以较低水平产生细胞外多糖。例如，修饰的微生物与未修饰的微生 物相比，可能产生具有较低分子量的细胞外多糖，导致每单位体积发酵液的多糖质量降低。
[0128] 在某些实施方式中公开的修饰的微生物产生与未修饰的微生物不同的细胞外多 糖。与未修饰的生物体相比，由修饰的微生物产生的细胞外多糖的结构被改变。在许多这 些特定实施方式中，由修饰的微生物产生的细胞外多糖具有与未修饰的微生物产生的多糖 不同的分子量。在一种实施方式中，修饰的微生物产生的细胞外多糖与由未修饰的微生物 产生的细胞外多糖相比，具有较低分子量（参见图6)。
[0129] 多糖结构可以通过几种方法来分析，所述方法包括例如：HPLC、孔径排阻层 析（SEC)、离子交换层析（IEC)、沉降分析、梯度离心和超滤（参见例如Prosky L等， J. Assoc. Off. Analytical Chem. 71:1017-1023 (1988) ;Deniaud 等，Int. J. Biol. Macromol.，33:9-18(2003))。这些方法可以包括微生物提取物的尺寸分级。通常使用SEC 技术和超滤方法。SEC的基本原理进一步描述在例如Hoagland等，J. Agricultural Food Chem. ,41(8):1274-1281(1993)中。用于分级特定范围的适合的柱可以被容易地选择并有 效地用于分离级份，例如 Sephacryl S 100HR、Sephacryl S 200HR、Sephacryl S 300HR、 Sephacryl S 400HR和Sephacryl S 500HR或它们的等同物。Sepharose介质或它们的等 同物例如Sepharose 6B、4B、2B，可以以类似的方式使用。
[0130] 多糖或多糖与蛋白的复合物的纯化，可以与其他层析技术包括亲和层析、IEC、疏 水相互作用层析等组合来实现。
[0131] 样品的超滤可以使用具有适合的分子质量截留值的分子膜来进行。本领域技术人 员可以广泛地获得用于实现分级的具体的膜和程序。
[0132] 多糖也可以使用凝胶电泳来检测（参见例如Goubet等，Anal Biochem. 321:174-82(2003) ;Goubet 等，Anal Biochem. 300:53-68(2002))。如果需要，可 以使用其他测定法来检测特定多糖，例如用于检测碳水化合物的苯酚：硫酸测定法（参见 Cuesta G.等，J Microbiol Methods. 2003 年 1 月；52(1) :69-73;以及 Braz 等，Med. Biol. Res. 32(5) :545-50(1999) ;Panin 等，Clin. Chem. November ;32:2073-6 (1986))。
[0133] 不同的胞外多糖组成、结构和/或生产率，可能是修饰的微生物的遗传修饰的直 接或间接结果。该变化可以由任何生物过程造成，并且不限于任何生物机制或途径。该变 化可能影响微生物的遗传学，或转录、翻译、翻译后修饰、蛋白质折叠、单糖组装或参与多糖 合成的任何其他生物过程。在某些实施方式中，产生多糖的机制可能是未知的。在其他实 施方式中，由修饰的微生物产生的多糖可能是以前未表征的多糖。
[0134] 另一方面，所公开的修饰的微生物产生的细胞外多糖，包含与由未修饰的微生物 产生的多糖的单糖组分不同的单糖组分（比较图4和图5)。根据某些实施方式，修饰的微生 物产生的细胞外多糖与由未修饰的微生物产生的多糖相比，包含不同的单糖分布情况（比 较表5和6)。
[0135] 通过解聚表征多糖的单糖组分，可以通过在例如Finlayson和Du Bois, Clin Chim Acta. Mar 1;84 (1-2) :203-6(1978)中描述的方法和技术。在某些实施方式中，由修饰的微 生物产生的多糖与由未修饰的微生物产生的多糖相比，包含较高数目的特定单糖。在一种 实施方式中，所述特定单糖是岩藻糖。在另一种实施方式中，所述特定单糖是阿拉伯糖。在 又一种实施方式中，所述特定单糖是半乳糖。其他实施方式描述了由修饰的微生物产生的 多糖，其与由未修饰的微生物产生的多糖相比包含以更高数目存在的多种特定单糖。
[0136] 在某些实施方式中，由修饰的微生物产生的细胞外多糖与由未修饰的微生物产生 的多糖相比，包含较低数目的特定单糖。在一种实施方式中，所述特定单糖是葡萄糖。在另 一种实施方式中，所述特定单糖是木糖。在又一种实施方式中，所述特定单糖是果糖。其他 实施方式描述了由修饰的微生物产生的细胞外多糖，其与由未修饰的微生物产生的细胞外 多糖相比包含以更低数目存在的多种特定单糖。
[0137] 在某些实施方式中，由本公开的微生物产生的多糖是高分子量多糖。在一种实施 方式中，高分子量多糖具有至少约300千道尔顿（kDa)的分子量，如图6中所示。在其他实 施方式中，高分子量多糖具有至少约50、100、200、400、500、600、700、800、900、1000或更多 kDa的分子量。多糖是否被当作高分子量多糖，将取决于产油微生物的物种和发酵液。
[0138] 在修饰和未修饰的微生物两者都产生高分子量细胞外多糖的某些实施方式中，由 修饰的微生物产生的高分子量多糖的产量低于由未修饰的微生物产生的高分子量多糖的 产量。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液与未修饰的微生物的发酵液相比，具 有较低的高分子量细胞外多糖的相对丰度。
[0139] 5.发酵液粘度
[0140] 以前已在细菌和藻类发酵中表征了细胞外多糖对粘度的影响（de Swaff等， Appl Microbiol Biotechnol. Oct ;57 (3):395-400(2001) ;Becker 等，Appl Microbiol Biotechnol. Aug ;50 (2) :145-52. (1998))。微生物产生细胞外多糖引起发酵液的生物质的 粘度提高。由多糖产生造成的高粘度使例如生物燃料应用所要求的高细胞密度发酵的开发 变得复杂。为了达到这些高细胞密度水平，要求低粘度和由此获得的高传质系数。由于细 胞外多糖的产生，许多微生物不能产生这些要求的低粘度和高传质系数，因此不适合用于 生物燃料应用。
[0141] 公开了修饰的微生物，其在高营养物发酵期间产生具有低粘度测量值的发酵液， 允许这些微生物达到用于高密度应用的较高生物质水平。一方面，所公开的产油微生物产 生发酵液。在某些实施方式中，当在培养中生长时，修饰的微生物产生的发酵液与未修饰的 微生物产生的发酵液相比，具有较低的粘度（表1)。
[0142] 粘度可以通过许多方式中的任一种来测量。通常使用粘度计，例如标准的 Brookfield 粘度计或毛细管 Cannon - Fenske 常规粘度计（Schott, Mainz, Germany)或 Vismetron粘度计（由Shibaura System Co, Ltd.制造）。用于测量发酵液粘度的任何方 法或装置都可以使用。
[0143] 在某些实施方式中，含有修饰的产油微生物的发酵液具有与由未修饰的微生物产 生的发酵液的细胞密度基本上相近的细胞密度。
[0144] 发酵液应该包含产生足够脂肪酸的最少量生物质。在某些实施方式中，修饰和未 修饰的微生物各自的发酵液包含至少约50克细胞干重每升的生物质。在其他实施方式中， 每种微生物的发酵液的生物质为至少约5、10、15、20、25、30、35、40或45克每升。在其他 实施方式中，每种微生物的发酵液的生物质为至少约60、70、80、90、100、125、150、175、200、 300、400或500或更多克每升的细胞干重。
[0145] 一方面，本公开的微生物产生具有最小生物质和最大粘度两者的发酵液。在某些 实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有至少约50克细胞干重每升的生物质和低于 约1，100厘泊（cP)的粘度（参见表1)。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具 有至少约50克细胞干重每升的生物质和低于约700cP的粘度。在其他实施方式中，修饰的 微生物产生的发酵液具有至少约50克细胞干重每升的生物质和低于约IOOcP的粘度。在 其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有至少约50克细胞干重每升的生物质和 低于约30cP的粘度。在另外的其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有至少约 50克细胞干重每升的生物质和低于约2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5、6、7、8、9、10、15、20或 25cP的粘度。在又一些其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有至少约50克细胞 干重每升的生物质和低于约 35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、 800、900、1000、1500、2000、2500 或 3000cP 或更高的粘度。
[0146] 另一方面，所公开的修饰的微生物产生的发酵液具有比由未修饰的微生物产生的 发酵液的粘度更低的粘度。在某些实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有至少约50 克细胞干重每升的生物质和比由未修饰的微生物产生的基本上相似的发酵液的粘度低至 少约10倍的粘度。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有至少约50克细胞 干重每升的生物质和比由未修饰的微生物产生的发酵液的粘度低至少约100倍的粘度。在 其他实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液具有至少约50克细胞干重每升的生物质和 比由未修饰的微生物产生的发酵液的粘度低至少约500倍的粘度。在其他实施方式中，修 饰的微生物产生的发酵液具有至少约50克细胞干重每升的生物质和比由未修饰的微生物 产生的发酵液的粘度低至少约 2、3、4、5、6、7、8、9、15、20、30、40、50、60、70、80、90、150、200、 300、400、600或1000或更多倍的粘度。
[0147] 6.揽拌功率和营养物可利用件
[0148] 粘度是工业规模上好氧发酵系统的工程设计的重要贡献因素。工业规模发酵罐设 计中的主要因素是提供氧向溶液中的足够的传质并维持至少最低溶解氧浓度。发酵液中的 一些微生物需要补充氧，以维持足够用于细胞存活和繁殖的溶解氧水平。
[0149] 在某些实施方式中，修饰的微生物产生的发酵液能够维持最低溶解氧（缩写为 "D0"）水平而不需补充氧。溶解氧水平可以通过几种方法中的任一种来测量。一种测量发 酵液中的氧饱和程度的方法是使用氧探头。探头发送指示了发酵液中的氧的量相对于校准 的最大氧信号的百分率的信号。在某些实施方式中，最低溶解氧水平为约20% (参见表1， 第6列，标为"％ D0"）。在其他实施方式中，最低溶解氧水平为约10、15、25、30%或更高。 不同的微生物物种可能需要各种不同的溶解氧水平用于细胞生存和繁殖。
[0150] 培养液的高粘度增加了混合所需的能量输入，并且也可能降低最大氧传递速率。 例如，这已在生产黄原胶的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris)培养中得到证实 (Shu 和 Yang，Biotechnol Bioeng. Mar 5 ;35 (5) :454-68 (1990))。高粘度发酵液限制传质， 导致需要更大的搅拌和通气功率输入为发酵液中的细胞提供足够的氧和其他营养物（图1 和2)。为了随着粘度提高维持相同的氧传质，需要提高投送的马力（例如单位体积功耗）， 这通常通过搅拌和空气压缩机工作的组合来实现。对增加的搅拌功率的要求相当大地提高 了发酵成本。
[0151] 氧传质系数是计算发酵液中的氧的可利用性的一种方式。氧传质系数可以由本 领域普通技术人员来计算，并且通常从溶解氧张力对时间的图来计算（de Swaff等，Appl Microbiol BiotechnoL Oct ;57(3) :395-400(2001))。还可以获得描述溶液粘度（μ)、氧 传质速率（kLa)、表面空气速度（Us)和投送功率（P/V)之间的关系的经验相关联。例如，最 常用的经验相关性如下：
[0152] kLa = A* (P/V) ~B* (Us) ~C* ( μ ) ~D
[0153] 表示每种参数与氧传质系数（kLa)之间的经验相关性的常数A、B、C和D的适合的 值，可以由本领域普通技术人员容易地选择和/或计算。
[0154] 在某些实施方式中，修饰的微生物具有比未修饰的微生物的氧传质系数更高的氧 传质系数。在其他实施方式中，修饰的微生物当在培养中生长时不需要补充氧，但是未修饰 的微生物当在培养中生长时需要补充氧。因此，降低溶液粘度也降低投送氧和其他营养物 所需的单位体积功耗。
[0155] 多糖浓度同样是溶液粘度的重要贡献因素。可以在溶液中的多糖浓度与观察到的 溶液粘度之间做出经验相关性。
[0156] -方面，所公开的微生物需要较少量的功率来搅拌单位体积的发酵液。搅拌一定 体积发酵液所需的功率的量（通常用马力每1000加仑或千瓦每立方米为单位测量），可以 由本领域普通技术人员来计算。在某些实施方式中，所述单位体积是1000加仑。这种降低 的功率要求提供了更廉价的发酵过程。
[0157] 在一种实施方式中，可以将修饰的微生物在发酵液中培养，其需要低于8. 0马力 每1000加仑用于搅拌（图2)。在另一种实施方式中，可以将修饰的微生物在发酵液中培养， 其需要低于5. 0马力每1000加仑用于搅拌.在又一些其他实施方式中，可以将修饰的微生 物在发酵液中培养，其需要低于4. 0、3. 0、2. 0、1. 0或更少的马力每1000加仑用于搅拌。
[0158] 在另一种实施方式中，修饰的微生物与未修饰的微生物相比需要更少的每单位体 积搅拌功率。在某些实施方式中，修饰的微生物与未修饰的微生物相比，需要少至少约9倍 的每1000加仑的搅拌功率。在其他实施方式中，修饰的微生物与未修饰的微生物相比，需 要少至少约5、10、15、20、25、50、100、1000或更多倍的每单位体积的搅拌功率。
[0159] 7.脂肪酸得率
[0160] 本文所公开的所有微生物，包括修饰和未修饰的两者，可以在发酵期间产生脂肪 酸。在许多微生物中，脂肪酸合成受到多糖生产的负面影响。促进脂类生产的条件（高的 碳氮比）也促进多糖生产。在这些微生物中，由于部分碳源被用于多糖生产而不是所需的 脂肪酸或脂类，因此可能发生脂肪酸发酵得率的降低。当发酵液的粘度随着多糖量的增加 而升高时，也存在传质的降低，这可以降低脂肪酸合成的效率。脂肪酸提取过程也受到多糖 生产的负面影响。在多糖存在下，通过过滤或离心收获细胞是困难的。在多糖存在下，细胞 破碎是低效的。多糖可以有助于稳定乳液的形成。在水性系统中，高水平的多糖也可以阻 止油类提取和回收。
[0161] 微生物生产率的一种度量是脂肪酸发酵得率。通过将遗传修饰导入到本公开的未 修饰的微生物中，产生新的修饰的微生物，其一般将脂肪酸对糖（碳底物）的发酵得率提高 约20-25重量％。所描述的微生物的脂肪酸得率可以由本领域普通技术人员容易地计算。 通常测定脂肪酸甲酯或FAME。
[0162] 脂肪酸甲酯（FAME)可以通过脂肪或脂肪酸与甲醇之间的碱催化的反应来产生， 以生产燃料或测定由微生物产生的脂肪酸分布情况。细胞脂类中存在的脂肪酸的类型和 比例或脂肪酸分布情况是重要的表型性状，并且可用于鉴定微生物。例如，使用气相色谱 ("GC"）的分析可以确定FAME的长度、键、环和分支。将脂肪酸作为脂肪酸甲酯来分析的 主要原因包括：在它们的游离的未衍生形式中，由于这些高极性化合物倾向于形成氢键，弓丨 起吸附问题，因此可能难以分析脂肪酸。降低它们的极性可以使它们更适于分析。为了辨 别由不饱和脂肪酸表现出的非常细微的差异，可以首先将极性羧基官能团中和。这随后允 许使用柱化学，通过沸点洗脱，并且也根据不饱和程度、不饱和位置以及甚至不饱和的顺式 相比于反式构型，来进行分离。
[0163] 脂肪酸向脂肪酸甲酯的酯化，可以使用烷基化衍生试剂来进行。甲基酯提供出色 的稳定性，并提供用于GC分析的快速和定量的样品。酯化反应包括酸的羧基与醇的羟基的 缩合。转酯作用可以包括使用任何适合的醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等。酯化可以在催 化剂（例如三氯化硼）存在下进行。催化剂将羧基的氧原子质子化，使酸具有高得多的反 应性。然后醇与质子化的酸合并，以产生酯并失去水。催化剂随着水被除去。所使用的醇 确定了得到的酯的烷基链长度（甲醇的使用将导致甲酯的形成，而乙醇的使用产生乙酯）。
[0164] 在大多数实施方式中，所公开的修饰的微生物的脂肪酸发酵得率高于未修饰的微 生物的脂肪酸发酵得率。在某些实施方式中，修饰的微生物表现出至少约14%的脂肪酸发 酵得率。在其他实施方式中，修饰的微生物具有至少约5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35%或更高的脂肪酸发酵得率（表1)。
[0165] 在某些实施方式中，修饰的微生物产生的脂肪酸发酵得率比未修饰的微生物产生 的脂肪酸的发酵得率高至少约10%。在其他实施方式中，修饰的微生物产生的脂肪酸得率 比未修饰的微生物产生的脂肪酸的得率高至少约20%。在又一些其他实施方式中，修饰的 微生物产生的脂肪酸得率比未修饰的微生物产生的脂肪酸的得率高约10%至约30%。在 其他实施方式中，修饰的微生物产生的脂肪酸得率比未修饰的微生物产生的脂肪酸的得率 高至少约 30、40、50、100、200、500、1000%或更高。
[0166] 8.牛物燃料牛产
[0167] 本公开还包括微生物脂类的生产以及使用那些脂类中包含的脂肪酸生产生物燃 料和/或生物燃料前体。本公开提供了以非常低的成本生产适用于生物柴油生产和/或营 养应用的脂类的微生物。
[0168] 根据某些实施方式，本公开可以包括生产生物油类的方法。所述方法可以包括产 生或生长本文所公开的微生物。所述微生物可以包含和/或在内部具有含脂肪酸的脂类和 /或一定量的含脂肪酸脂类。在可替选方案中，生物体可以分泌和/或排出生物油。
[0169] 所述方法还可以包含任何适合的其他行动，例如通过细胞裂解、施加压力、溶剂萃 取、蒸馏、离心、其他机械处理、其他热处理、其他化学处理等提取和/或取出含脂肪酸的脂 类。在可替选方式中，生产性微生物可以不需其他处理从微生物分泌和/或排出含脂肪酸 的脂类。
[0170] 脂肪酸可以具有任何适合的，例如总体适合于生物燃料生产的分布情况和/或特 征。根据某些实施方式，脂肪酸可以在质量基础上包含适合的量和/或百分比的具有4个 或更多双键的脂肪酸。在可替选方案中，脂肪酸可以包含适合的量和/或百分比的具有3 个或更多双键、具有2个或更多双键、具有1个或更多双键的脂肪酸等。
[0171] 另一方面，公开了生产生物燃料前体的方法。在某些实施方式中，所述方法包括培 养所描述的微生物并收集由所述微生物产生的发酵液。生物燃料前体可以使用本文中描述 的任何微生物来生产。在某些实施方式中，生物燃料前体是生物油。生物燃料前体可以如 本文中所述或通过任何其他适合的技术来提取。如果需要，可以将提取的脂类和/或生物 油类进一步化学处理成生物燃料前体。在某些实施方式中，所述方法还包括从微生物提取 脂肪酸并对脂肪酸进行反应以生产生物燃料。
[0172] 还公开了用于生产生物燃料的方法。在某些实施方式中，所述方法包括供应碳源 并在所描述的微生物内将所述碳源转变成脂肪酸。某些所描述的微生物，在提取脂类、油 类、生物燃料或生物燃料前体之前，应该被培养到特定细胞密度。在某些实施方式中，所公 开的方法包括将微生物在粘度低于约IlOOcP的发酵液中培养到至少约50克细胞干重每升 的细胞密度。在一种实施方式中，所述方法的生物燃料或生物燃料前体使用本文中公开的 任何修饰的微生物来生产。在一种实施方式中，所述微生物是产生细胞外多糖的酵母。在 其他实施方式中，所公开的方法包括将所述微生物在粘度低于约1500、1000、750、500、100、 50、30、10、5cP或更低的发酵液中，培养到每升至少约10、20、30、40、60、70、80、90、100、 200、300、400、500、1000或更多克的细胞密度。
[0173] 还描述了通过所描述的方法生产的生物燃料。所述生物燃料可能源自于通过本公 开的方法或微生物生产的任何生物燃料前体或生物油类或脂类。可以使用任何适合的方法 例如酯化、转酯、加氢、裂化等将生物燃料前体或生物油进一步加工成生物燃料。在可替选 方案中，生物油可以适合于直接用作生物燃料。酯化是指制造和/或形成酯，例如通过将酸 与醇反应以形成酯。转酯是指将一种酯改变成一种或多种不同的酯，例如通过醇与甘油三 酯的反应以形成脂肪酸酯和甘油。加氢和/或加氢处理是指将氢加成到分子以例如饱和和 /或还原材料的反应。
[0174] 另一方面，公开了通过在内燃机中燃烧生物燃料为交通工具供能的方法。所述生 物燃料可以通过任何所描述的方法或由任何所描述的微生物生产。
[0175] 另一方面，公开了适合用于压缩发动机中的生物燃料。所述生物燃料可以通过任 何所描述的方法或由任何所公开的微生物生产。
[0176] 越来越多的兴趣被导向在燃料中使用生物来源的烃类组分，例如生物柴油、可再 生柴油和喷气机燃料，这是由于可以代替源自于化石燃料的起始材料的可再生生物起始材 料是可获得的，并且其使用是合乎需要的。对于从生物材料生产烃类组分的方法存在着迫 切需求。本公开通过提供适合于生产生物柴油、可再生柴油和喷气机燃料的方法和微生物， 使用由所描述的方法产生的脂类作为生物材料来生产生物柴油、可再生柴油和喷气机燃 料，满足了这种需求。
[0177] 在提取后，可以对从本文描述的微生物生物质回收的脂类和/或烃类组分进行化 学处理，以制造在柴油交通工具和喷气式发动机中使用的燃料。一个实例是是可以通过在 富含油的生物质中包含的甘油三酯的转酯作用来生产生物柴油。可以对脂类组合物进行转 酯，以生产可用作生物柴油的长链脂肪酸酯。因此，在本公开的另一方面，提供了用于生产 生物柴油的方法。在某种实施方式中，用于生产生物柴油的方法包括下列步骤：(a)使用本 文公开的方法培养含有脂类的微生物；(b)裂解含有脂类的微生物以产生裂解物；(C)从裂 解的微生物分离脂类；以及（d)对脂类组合物进行转酯，由此生产生物柴油。转酯可以包括 使用任何适合的醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等。
[0178] 用于生长微生物、裂解微生物以产生裂解物、在包含有机溶剂的介质中处理裂解 物以形成非均质混合物以及将处理过的裂解物分离成脂类组合物的方法已在上面描述，并 且也可用于生产生物柴油的方法中。
[0179] 生物柴油的常用国际标准是EN 14214(2008年11月）。德国使用DIN EN 14214， UK要求符合BS EN 14214。ASTM D6751 (2008年11月）是在美国和加拿大参考的最常用 的生物柴油标准。确定产品是否符合这些标准的基本工业试验，通常包括气相色谱、HPLC 等。满足质量标准的生物柴油是极为无毒的，具有大于50mL/kg的毒性评分。得到的生物 燃料可以满足和/或超出国际标准EN 14214: 2008 (汽车燃料，用于柴油发动机的脂肪酸 甲酯（FAME))和/或ASTM D6751-09(用于中间馏分燃料的生物柴油燃料掺混料（B100)的 标准规格（Standard Specification for Biodiesel Fuel Blend Stock (B100) for Middle Distillate Fuels))。EN 14214:2008和ASTM D6751-09两者的全部内容以其整体通过参 考并入本文，作为本说明书的一部分。
[0180] 9.可再牛材料牛产
[0181] 出于各种目的，需要从诸如植物（包括含油种子）、微生物和动物的来源生产可再 生材料，包括生物油类。例如，希望增加在生物油类中存在的许多有益营养物的饮食摄入。 特别有益的营养物包括脂肪酸例如ω-3和ω-6脂肪酸及它们的酯。由于人类和许多其他 动物不能直接合成ω-3和ω-6必需脂肪酸，因此它们必须在饮食中获得。必需脂肪酸的 传统饮食来源包括植物油、海洋动物油、鱼油和含油种子。此外，已发现由某些微生物产生 的油类富含必需脂肪酸。为了降低与用于饮食、制药和化妆品用途的有益脂肪酸的生产相 关的成本，对于生产含有这些脂肪酸的生物油的低成本且有效的方法，存在着需求。
[0182] 在某些实施方式中，产油微生物产生可再生材料。本文中公开的可再生材料可用 于非人类动物或人类使用的食品、增补剂、化妆品或药物组合物的制造。可再生材料可以被 制造成下列非限制性实例：食品，药物组合物，化妆品和工业组合物。在某些实施方式中，可 再生材料是生物燃料或生物燃料前体。
[0183] 食品是用于动物或人类消费的任何食物，包括固体和液体组合物两者。食品可以 是动物或人类食物的添加剂，并包括医疗食品。食物包括但不限于普通食物；液体产品，包 括牛奶、饮料、治疗性饮料和营养饮料；功能食品；增补剂；营养品；婴儿配方，包括用于早 产婴儿的配方；用于妊娠或哺乳妇女的食品；用于成人的食品；老年食品；以及动物食品。 在某些实施方式中，本文中公开的微生物、可再生材料或其他生物产品可以直接用作或作 为添加剂包含在下列一种或多种食品中：油，起酥油，涂抹酱，其他脂肪成分，饮料，调味汁， 乳制品或豆制品（例如牛奶、酸奶、奶酪和冰激凌），烤焙食品，营养品例如作为营养增补剂 (采取胶囊或片剂形式），维生素增补剂，饮食增补剂，粉末饮料，成品或半成品粉末食品， 及其组合。
[0184] 在某些实施方式中，可再生材料是生物油。在某些实施方式中，可再生材料是饱和 脂肪酸。饱和脂肪酸的非限制性实例包括油酸、亚油酸或棕榈酸。
[0185] 本文描述的修饰的产油微生物与未修饰的对应微生物相比，在产生可再生材料中 可以具有高生产率。微生物可再生材料生产率公开在待决的美国专利申请13/046, 065 (公 布号20120034190,2011年3月11日提交）中，其全部内容通过参考并入本文。在其他实 施方式中，本申请公开了生产可再生材料的方法。生产可再生材料的方法公开在待决的美 国专利申请13/046,065(公布号20120034190,2011年3月11日提交）中，其全部内容通 过参考并入本文。在本公开中引用的每个参考文献通过参考并入本文，如同以其全部内容 陈述。 实施例
[0186] 提供了下面的实施例以说明但不限制所要求保护的发明。
[0187] 实施例1 :菌株诱夺
[0188] 被选择用于诱变工作的菌株是酵母物种近玫色锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus)的菌株 MK29404,以及酵母物种 Rhodotorula ingeniosa 的菌株 MK29794。如 表1中所示，MK29404和MK29794在发酵约70-100小时后产生高粘度培养液。MK28428在 可比的发酵时间后具有较低粘度（表1)。
[0189] 通过标准的UV光、X-射线辐照和化学诱变将遗传修饰导入到这些菌株中。为了 确定对于不同诱变剂的适合的暴露水平，对每个菌株和每种诱变剂制作了杀菌曲线。将UV 光、X-射线辐照和化学诱变剂（亚硝基胍）用于每个菌株。
[0190] 简单来说，将细胞铺板在琼脂培养基平板上，并暴露于350-475微居的UV辐射剂 量范围。通过将细胞铺板在琼脂培养基平板上，并将它们暴露于X-射线辐照30min或1小 时，来进行X-射线诱变。通过将MK29404细胞与不同水平的亚硝基胍混合1小时，来进行 化学诱变。20和40 μ g/ml的水平被用于随后突变体的产生。
[0191] 将诱变的细胞在含有浓度为全强度培养基的1/16的标准生物燃料生长培养基 (BFGM)的琼脂板上生长。决定使用全强度培养基的1/16的BFGM浓度。这种浓度允许显著 的脂肪积累，但是防止菌落过度生长并合并在一起。
[0192] 实施例2 :干燥菌株形杰的诜择
[0193] MK29404和MK29794的突变菌株的初筛是目测检查。根据琼脂平板上菌落的目测 观察来鉴定具有低的多糖水平的突变体菌落。野生型菌落在外观上是"湿润"和"粘稠"的， 并且非常软。如果将琼脂平板倒置，菌落将"滴落"在平板的另一侧上。这种形态是产生大 量细胞外多糖的细胞特征性的。通过"干燥的"菌落形态鉴定低多糖的突变体。这些菌落 在视觉上不湿润或粘稠，而是僵硬和粉状的。选择"干燥的"菌落用于进一步研究。
[0194] 实施例3 :所诜菌株的发酵
[0195] 将具有"干燥"形态的菌落保存用于更详细的分析，并且其通常被称为"干燥"突变 体。对突变体和野生型（WT)的多个菌株MK29404、MK28428和MK29794菌株进行发酵，其中 WT菌株代表示例性的未修饰的微生物。除非在本说明书中另有指明，否则发酵流程一般遵 从或按照来自于通过参考并入本文的美国专利号6, 607, 900的程序来进行。
[0196] 每个菌株在 100 升 New Brunswick Scientific (Edison, New Jersey, U. S. A.) BioFlo 6000发酵罐中，使用碳（葡萄糖）和氮（氢氧化铵）分批补料方法进行培养。发酵 用6升培养物接种。对于接种物繁殖来说，使用14升VirTis(SP Scientific Gardiner, New York，U. S. A.)发酵罐。接种物培养基包括分成4个分开的组制备的10升培养基。组A包 括 98 克 MSG*1H20,202 克 Na2S04,5 克 KC1，22. 5 克 MgS04*7H20,23. 1 克（NH4)2SO4,14. 7 克 KH2PO4,0· 9 克 CaCl2*2H20,17. 7 毫克 MnCl2*4H20,18. 1 毫克 ZnS04*7H20,0· 2 毫克 C〇C12*6H20， 0· 2 毫克 Na2Mo04*2H20,11. 8 毫克 CuS04*5H20, 11. 8 毫克 NiS04*6H20 和 2 毫升 Dow(Midland， Michigan，U. S. A.) 1520US (消泡剂）。将组A在接种物发酵罐中以约9. 5升的体积在121 °C 下压热灭菌。组B包括20毫升储用溶液，1升所述储用溶液含有2. 94克FeS04*7H20和1克 柠檬酸。将组B储用溶液在121°C下压热灭菌。组C包括37. 6毫克硫胺素-HC1，1.9毫克 维生素 B12和1. 9毫克泛酸半钙盐，溶解在10毫升中并过滤除菌。组D包括含有400克葡 萄糖粉的1，〇〇〇毫升蒸馏水。在将发酵罐冷却至29. 5°C后，向发酵罐加入组B、C和D。使 用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的PH调整到5. 5,并且在接种之前将溶解氧设定到100%。
[0197] 将接种物发酵罐用18毫升标准摇瓶培养物接种，并在29. 5 °C、pH5. 5、350转每分 钟的搅拌和8升每分钟的空气下培养27小时的时间段，此时将6升接种物培养液转移至 100升发酵罐。100升发酵罐包含80升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的 方式制备。
[0198] 发酵培养基包括7个分批培养基组。组A包括1，089. 6克Na2SO4, 57. 6克K2SO4, 44.8克KC1，181.6克MgS04*7H 20和90.4克KH2PO4。将组A在100升发酵罐中，以约35 升的体积在122°C蒸汽灭菌60分钟。组B在约500毫升体积中包括90. 4克（NH4)2SO4和 10. 4克MSGWH2Ot5组C在约200毫升体积中包括15. 2克CaCl2*2H20。组D在约2升蒸馏 水中包括1，200克粉末葡萄糖。组E在约1升体积中包括248毫克MnCl 2*4H20, 248毫克 ZnS04*7H20, 3. 2 毫克 C〇C12*6H20, 3. 2 毫克 Na2Mo04*2H20,165. 6 毫克 CuS04*5H20 和 165. 6 毫 克NiS04*6H20。组F在约280毫升体积中包括824毫克FeS0 4*7H20和280. 3毫克柠檬酸。组 G在约67. 4毫升蒸馏水的体积中包括780毫克硫胺素-HCl，12. 8毫克维生素 B12和266. 4 毫克泛酸半钙盐，过滤除菌。在发酵罐达到29. 5°C的运行温度后，将组B、C、D、E、F和G合 并并加入到发酵罐中。在接种之前，发酵罐的体积约为38升。
[0199] 将发酵罐用6升来自于上述发酵的培养液接种。使用5. 4升4N氢氧化铵溶液将 发酵的pH控制在5. 5的pH。在整个发酵期间，使用从180转每分钟至480转每分钟的搅拌 和60升每分钟至100升每分钟的空气流，将溶解氧控制在5%至20%之间。在整个发酵期 间，补料38. 4升的850克细胞干重每升95%右旋糖溶液以维持低于50克细胞干重每升的 浓度。
[0200] 实施例4 :粘度测量
[0201] 在固定的发酵时间段、通常为50-100小时后测定每个菌株的粘度。培养物粘度使 用标准的Brookfield粘度计（Middleboro, MA)测定。培养基组分在所使用的浓度下不显著 影响粘度。
[0202] 干燥菌株显示出急剧改进的粘度测量值和提高的碳利用率。概述了未修饰的野生 型（WT)和干燥菌株MK 29404、MK28428和MK 29794的粘度测量值的数据在表1中。质量计 算在非回收利用体积（"RV"）中进行。MK29404野生型的平均粘度为1701cP，而MK29404Dryl 突变体的平均粘度为8. 5cP，粘度降低200倍。其他MK 29404干燥突变体具有类似的粘度 降低。MK 29794野生型菌株具有约700cP的粘度，而干燥突变体大多数<50cP。因此，MK 29404和29794的干燥突变体与它们的WT (野生型或未修饰的）对应物相比显示出显著的 粘度降低。MK28428菌株显示出低粘度，但是由于MK 29404和MK 29794干燥突变体表现出 更好的生产率度量例如脂肪酸对糖的得率，因此未选择MK 28428菌株用于后续实验。

【权利要求】
1. 一种适用于可再生材料生产的产油微生物，其中所述微生物包含在未修饰的微生物 中不存在的遗传修饰，并且其中当在培养中生长时，修饰的微生物产生的发酵液与由所述 未修饰的微生物产生的发酵液相比具有较低粘度。
2. 权利要求1的产油微生物，其中所述修饰的微生物产生的发酵液具有至少约50克细 胞干重每升的生物质和低于约1，100厘泊（cP)的粘度。
3. 权利要求1或2的产油微生物，其中所述修饰的微生物产生的发酵液具有至少约50 克细胞干重每升的生物质和低于约30cP的粘度。
4. 权利要求1-3任一项的产油微生物，其中所述修饰的微生物具有干燥形态，而所述 未修饰的微生物不具有干燥形态。
5. 权利要求1-4任一项的产油微生物，所述微生物是对应于下列一种或多种的微生 物：ATCC 保藏号 PTA-12508 (菌株 MK29404 (Dryl-13J))，ATCC 保藏号 PTA-12509 (菌株 MK29404 (Dryl-182J))，ATCC 保藏号 PTA-12510 (菌株 MK29404 (Dryl-173N))，ATCC 保藏 号 PTA-12511(菌株 MK29404(Dry55))，ATCC 保藏号 PTA-12512(菌株 MK29404(Dry41))， ATCC 保藏号 PTA-12513(菌株 MK29404(Dryl))，ATCC 保藏号 PTA-12515(菌株 MK29404 (Dryl-147D))或 ATCC 保藏号 PTA-12516 (菌株 MK29404 (Dryl-72D))。
6. 权利要求1-4任一项的产油微生物，所述微生物是对应于下列一种或多种的微 生物：ATCC 保藏号 PTA-12506 (菌株 MK29794 (KDryl6-l))，ATCC 保藏号 PTA-12507 (菌 株 MK29794 (KDry7))，ATCC 保藏号 PTA-12514 (菌株 MK29794 (K200Dry 1))或 ATCC 保藏号 PTA-12517 (菌株 MK29794 (33Dryl))。
7. 权利要求1-6任一项的产油微生物，其中所述修饰的微生物产生的发酵液具有至少 约50克细胞干重每升的生物质和比由所述未修饰的微生物产生的基本上相似的发酵液的 粘度低至少约10倍的粘度。
8. 权利要求1-7任一项的产油微生物，其中所述修饰的微生物和所述未修饰的微生物 产生包含细胞外多糖的发酵液。
9. 权利要求1-8任一项的产油微生物，其中所述修饰的微生物与所述未修饰的微生物 相比，每升发酵液产生少至少约2倍的细胞外多糖。
10. 权利要求1-9任一项的产油微生物，其中所述修饰的微生物的干重的至少约25% 为脂肪酸。
11. 权利要求1-10任一项的产油微生物，其中所述修饰的微生物可以在发酵液中培 养，其需要低于8. 0马力每1000加仑用于搅拌。
12. -种发酵液，其由权利要求1-11任一项的修饰的微生物产生。
13. 权利要求12的发酵液，其中所述发酵液具有大于约2的脂类与细胞外多糖的比率。
14. 一种生产生物燃料前体的方法，所述方法包括培养权利要求1-11任一项的微生 物，并收集由所述微生物产生的发酵液。
15. -种生产生物燃料的方法，所述方法包括： (a) 供应碳源； (b) 在权利要求1-11任一项的微生物内将所述碳源转变成脂肪酸； (c) 将所述微生物在粘度低于约llOOcP的发酵液中培养到至少约50克细胞干重每升 的细胞密度； (d) 从所述微生物提取脂肪酸；以及 (e) 对所述脂肪酸进行反应以生产生物燃料。
16. 权利要求15的方法，所述微生物是产细胞外多糖的酵母。
17. -种生物燃料，其通过权利要求15的方法来生产。
18. -种通过在内燃机中燃烧权利要求15的生物燃料为交通工具供能的方法。
【文档编号】C11B1/02GK104364358SQ201380019205
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年4月9日 优先权日:2012年4月9日
【发明者】柯克·阿普特, 雅各布·博登, 保罗·W·贝伦斯, 大卫·戴恩, 约瑟夫·W·普法伊费尔, 约恩·汉森 申请人:Bp生物燃料英国有限公司