专利名称：一种制备二氧化钛凝胶膜的气相沉积方法
技术领域：
本发明涉及一种在载体上固定生物活性物质的方法，特别是一种制备二氧化钛凝胶膜的气相沉积方法。
载体表面生物活性物质固定的常用方法有(1)吸附法物理吸附是一种较为简单的固定化技术，生物活性物质以静电引力吸附在载体表面。物理吸附比较简单，同其它化学方法相比，对生物活性的影响较小，但所固定的分子容易从载体表面脱落，寿命也较短。
(2)共价键合法通过共价键将生物活性物质与载体表面上的基团键合而将它们固定在载体表面。表面上的共价键合较吸附困难，生物物质的活性易受影响，在使用过程中易失去活性。在载体表面共价键合生物分子时，需考虑很多因素，操作步骤也较多，常包括载体基底表面的活化，生物分子的偶联等。
(3)交联法通过双功能团试剂在生物活性物质分子之间、分子与基底之间交联形成网状结构而使其固定于载体表面。这种方法的局限性是膜的形成条件不易确定，须仔细地控制pH、离子强度、温度及反应时间。交联膜的厚度及双功能团试剂的含量对传感器的响应具有重要的影响。
(4)包埋法应用高分子聚合物包埋生物活性物质的固定化技术已被广泛使用，它可将生物分子通过高分子聚合物的三维空间网状结构固定在载体表面。该技术可采用温和的实验条件，大多数生物活性物质可很容易掺入聚合物膜中，膜的孔径和几何形状也可控制。但它也有一定的局限性，如必须控制很多实验因素，聚合物形成过程中产生的自由基与聚合物的空间结构会影响生物分子的活性等。
利用溶胶/凝胶多孔玻璃代替高分子聚合物膜进行生物分子如酶、蛋白质、抗原抗体、DNA以及细胞甚至是生物组织等的固定是近年来发展起来的方法。溶胶/凝胶玻璃材料具有十分诱人的特性制备方法简单，具有孔径可调的多孔结构，能在较低的温度下包埋生物活性分子，从而保持生物分子的自身结构、活性和功能，而且识别对象可通过凝胶玻璃的孔道与其接触，产生识别信号。溶胶/凝胶本身也具有化学惰性、低溶胀性和良好的机械稳定性。
溶胶/凝胶过程包括溶胶的形成(Sol)、溶胶凝胶化为湿凝胶(Gel)和湿凝胶的干燥和老化等几个步骤(1)水解、缩合形成溶胶目前报道的方法大都采用低分子量的硅烷氧基化合物作为前驱体在强酸催化下和水反应形成溶胶。由于硅氧烷和水不互溶，通常加入相应的醇作为共溶剂。水解产物经缩合后得到稳定的溶胶。
(2)凝胶化水解产生的胶体粒子由于其表面负电荷间的排斥作用而稳定存在。但随着水解和聚合的进行，水被消耗，溶剂蒸发，胶粒浓度随之增大，减弱了这种稳定作用从而发生凝胶化。
(3)干燥和老化在凝胶化的最后阶段，随着水和溶剂的挥发，毛细管力使凝胶网络聚集而发生收缩。此时往往会发生凝胶的干裂。有人建议在Sol-Gel过程中加入一些表面活性剂以防止这种现象的发生。
溶胶/凝胶生物传感器制备的常见方法是将生物活性物质分散于溶胶后，滴涂或蘸涂到平面基体载体的表面，而后溶胶在载体表面在适当的温度下胶凝化，从而使生物活性物质固定在载体表面。由于硅溶胶需要在强酸催化的条件下制备，而酸度过高会使生物物质的活性降低甚至失去其活性。在传感器的制作过程中，滴涂在载体表面的硅溶胶在胶凝成膜时易发生开裂，使膜从载体表面脱落而不能有效地进行生物活性物质的固定。为了防止膜的开裂和脱落，通常在水解缩合形成溶胶的过程中预先加入表面活性干燥控制剂以控制溶胶中水分挥发的速度，防止形成的凝胶膜开裂。但表面活性干燥控制剂都是有机化合物，会不同程度地影响生物活性物质的活性，最终影响生物传感器的性能。
2、技术方案为实现上述目的，本发明所述的一种制备二氧化钛凝胶膜的气相沉积方法，是将钛溶胶的胶凝化过程用于生物活性物质在载体表面的包埋，构造新型仿生催化界面(生物功能膜)和生物传感器。具体步骤是(1)将生物活性物质溶解于缓冲溶液中，所选择的缓冲溶液的pH值因生物分子的种类而异，标准是使生物物质的活性最大。
(2)在载体表面上滴涂一定浓度的上述混合溶液，并将其悬于钛烷氧基化合物液面的上方，然后将此体系密闭。
(3)将以上密闭体系置于15-35℃的恒温中，恒温4-8小时。
(4)在密闭体系中，液面上的钛烷氧基化合物蒸汽与载体表面上的溶液接触，发生缓慢的水解反应生成二氧化钛溶胶，胶凝化后将生物活性物质包埋并固定于载体表面，在载体上获得二氧化钛凝胶膜并可制成生物传感器。
本发明中，影响所获得的生物功能膜和生物传感器性能的主要因素有四个方面(1)缓冲溶液的pH值只有在一定的酸度下，生物物质才具有最佳活性。如果缓冲溶液的酸度偏离这一数值，将生物分子溶解于其中就会伤害它的活性，从而影响生物功能膜和生物传感器的性能。
(2)生物活性物质的浓度载体表面溶胶胶凝化以后，包埋生物活性物质的容量是有限的。如果浓度过高，就会有一部分生物物质不能被凝胶膜包埋进去；生物物质的浓度太低，膜的容量达不到饱和，最终影响生物功能膜及生物传感器的性能。
(3)温度当滴涂有生物物质溶液的载体悬于四异丙氧基钛液面之上时，会有两个过程同时发生，一是四异丙氧基钛蒸汽在载体表面沉积，另一个是载体表面溶液中水分的挥发。如果温度太高，四异丙氧基钛的蒸汽压太大，水解的速度太快，此时形成的就不是溶胶，而是二氧化钛的颗粒沉淀；如果温度太低，四异丙氧基钛的蒸汽压太小，水分挥发的速度就会比蒸汽沉积的速度快，载体表面以致没有足够的水与四异丙氧基钛的蒸汽发生水解反应来生成想要的溶胶。
(4)时间足够的时间能使水解反应充分，同时也能保证溶胶完全胶凝化。太短的时间会是反应不充分，胶凝化不完全；太长的时间，在溶胶完全胶凝化以后就毫无意义了。
3、有益效果本发明与现有技术相比，其显著优点是可控制钛烷氧基化合物的水解速度，避免其与水直接混合而强烈水解产生沉淀，在溶胶制备的过程中不需加入酸和表面活性剂，能够随意控制酸度环境，便于最大限度地保持生物活性物质的活性。而且，所制得的膜不开裂，不会从载体表面脱落，由于凝胶膜内的多孔结构和氢键的相互作用，使被包埋的生物活性物质也不易泄漏。这种技术将溶胶的制备和成膜的过程合二为一，溶胶/胶凝成膜的同时将生物活性物质包埋而被固定于载体表面。该方法不仅简化了溶胶/胶凝成膜和生物传感器的制备步骤，制得的生物传感器也因二氧化钛凝胶膜良好的生物兼容性、凝胶膜形成的温和条件、生物活性物质不易泄漏、其活性不会受到伤害、膜不易开裂等优点而保持较高的活性、较长的寿命和好的稳定性。
四、最佳实施方式实施例1选择直径4mm的盘状平面玻碳电极作载体材料，生物活性物质以辣根过氧化酶(HRP)为例作包埋固定的对象(1)先将电极表面用金相砂纸打磨，然后分别用1.0、0.3、0.05μm的γ-氧化铝浆在麂皮上抛光，接着用二次水冲洗干净，电极表面依次用1∶1硝酸、丙酮、二次水超声清洗，得到新鲜干净的电极表面，于室温干燥。
(2)将5毫克HRP溶解在1毫升0.02M pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，取10微升HRP溶液，滴涂在经(1)步骤处理的电极表面，然后将此电极悬于四异丙氧基钛液面的上方，将体系密闭后于25℃的恒温箱中，恒温6小时。
(3)在密闭体系中，四异丙氧基钛蒸汽与电极表面的酶溶液接触，发生缓慢的水解反应生成二氧化钛溶胶。溶胶在胶凝成膜的过程中将HRP包埋凝胶膜内，从而被固定在电极表面，制成HRP生物功能膜和H2O2生物传感器。
实施例2以生物活性物质葡萄糖氧化酶(GOx)作包埋固定的对象(1)将电极表面用实施例1中第一步骤处理。
(2)将2毫克GOx溶解在1毫升0.02M pH7.3的磷酸盐缓冲溶液中，取10微升GOx溶液滴涂在经(1)步骤处理的电极表面，然后将此电极表面悬于四甲氧基钛液面的上方，将体系密闭后于20℃的水浴中恒温5小时。
(3)同样，电极表面的酶溶液与四甲氧基钛蒸汽接触，发生缓慢的水解反应生成二氧化钛溶胶。溶胶在胶凝成膜的过程中将GOx包埋凝胶膜内，从而被固定在电极表面，制成GOx生物功能膜和葡萄糖生物传感器。
权利要求
1.一种制备二氧化钛凝胶膜的气相沉积方法，其特征在于该制备步骤是(1)将生物活性物质溶解于缓冲溶液中；(2)在载体的表面滴涂上述混合溶液，并使之悬于钛烷氧基化合物液面的上方，然后将此体系密闭；(3)将以上密闭体系置于15-35℃的恒温中，恒温4-8小时；(4)在密闭体系中，液面上的钛烷氧基化合物蒸汽与载体表面上的溶液接触，发生缓慢的水解反应生成二氧化钛溶胶，胶凝化后将生物活性物质包埋并固定于载体表面，在载体上获得二氧化钛凝胶膜并可制成生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种制备二氧化钛凝胶膜的气相沉积方法，其特征在于所述的钛烷氧基化合物是四异丙氧基钛或四甲氧基钛。
全文摘要
本发明公开了一种制备二氧化钛凝胶膜的气相沉积方法,其制备步骤是:将生物活性物质溶解于缓冲溶液中;在载体表面上滴涂上述溶液,并将其悬于钛烷氧基化合物液面的上方,将此体系置于15～35℃的恒温中密闭4～8小时;钛烷氧基化合物蒸汽与载体表面上的溶液接触,生成二氧化钛溶液,胶凝后将生物活性物质包埋并固定于载体表面,在载体上获得二氧化钛凝胶膜并可制成生物传感器。本发明优点是可控制钛烷氧基化合物的水解速度,避免其与水直接混合而强烈水解产生沉淀;在溶胶制备的过程中不需加入酸和表面活性剂,能够随意控制酸度环境,便于最大限度地保持生物活性物质的活性。而且,所制得的膜不开裂,不会从载体表面脱落。
文档编号C04B35/624GK1381609SQ01138059
公开日2002年11月27日 申请日期2001年12月30日 优先权日2001年12月30日
发明者鞠熀先, 喻玖宏 申请人:南京大学