专利名称：一种降解除草剂氰氟草酯的细菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染生物修复领域，涉及一种降解除草剂氰氟草酯的细菌及其应用。
背景技术：
氰氟草酯(cyhalofop-butyl)是一种芳氧苯氧羧酸酯类除草剂，由美国陶氏公司(Dow Elanw Co. Ltd) 1987年首先开发,化学名称为(R) _2_[4 (4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]-丙酸丁酯，分子式为C2tlH2tlFNCV氰氟草酯在极低剂量即对杂草呈很高活性和选择性，尤其对稗草、千金子、看麦娘、小康草等有卓越的效果，具有较好的发展前景，在我国的应用日益广泛。但是，随着该类除草剂的长期大量使用，其在环境中的迁移、转化和分解等环境行为正受到日益关注。 氰氟草酯在我国得到广泛应用的同时，其在土壤和水体中的残留导致的环境污染问题也日趋严重，有以下几方面的危害(I)氰氟草酯随生产废水、农业灌溉水和雨水纵向和横向扩散，造成地表水和地下水污染；(2)氰氟草酯及其芳烃代谢产物对哺乳动物和人体健康具有较大的危害；(3) 土壤中氰氟草酯残留对下茬作物产生药害，使下茬作物死亡或减产，导致农业生产损失；(4)氰氟草酯对一些水生生物毒性较高，水体中的氰氟草酯残留会导致土壤和水体生物多样性降低，危及水生生物安全。微生物降解修复技术是近几十年才兴起的一种新型的环境污染修复技术。该技术和物理化学方法相比，具有很多无可比拟的优点，如处理效果好，适合有毒有害有机污染物大面积面源污染的降解修复，修复费用较低(仅为传统化学、物理修复经费的10%左右)，不产生二次污染等。在国内外，生物修复技术已经广泛应用于石油、化工和农药残留有机污染的清除。但到目前为止还未见氰氟草酯残留污染生物修复技术专利的研究和应用报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株降解除草剂氰氟草酯的细菌。本发明的另一目的是提供含有该细菌的菌剂。本发明的又一目的是提供该细菌的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种降解除草剂氰氟草酯的细菌Aquamicrobium lusatiense JW_1,保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为=CCTCC NO M 2012297，保藏日期为2012年7月20日。该菌的主要生物学特性为G_，菌体为短杆状，大小为O. 5-1. 0X1. 0-1. 5 μ m ;菌落表面光滑，有光泽，边缘整齐，隆起，呈淡黄色。氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、柠檬酸利用反应为阳性；甲基红试验、脂酶反应、V. P.反应、M. R反应、吲哚反应为阴性；不能水解淀粉。一种含有所述的菌种保藏号为CCTCC NO M 2012297的降解除草剂氰氟草酯的细菌JW-I的降解菌剂。该菌剂可通过试管斜面种一摇瓶种一种子罐一生产罐一产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)的生产工艺制备得到。所述的菌种保藏号为CCTCC NO M 2012297的降解除草剂氰氟草酯的细菌JW-I在降解水体和/或土壤中的除草剂氰氟草酯残留的应用。所述的含有菌种保藏号为CCTCC NO M 2012297的降解除草剂氰氟草酯的细菌JW-I的菌剂在降解水体和/或土壤中的除草剂氰氟草酯残留的应用。
有益效果本发明提供了一株降解除草剂氰氟草酯的细菌JW-I (CCTCC NO M 2012297)，由该细菌制备的菌剂对氰氟草酯降解效率高达到95%以上，降解速度快，消除农产品中除草剂氰氟草酯残留，可用于降解土壤和水体中除草剂氰氟草酯残留，解决除草剂氰氟草酯对对土壤水体环境的危害问题。
图I菌株JW-I在含氰氟草酯的LB平板上形态。图2菌株JW-I的透射电镜照片。图3菌株JW-I以氰氟草酯为唯一碳源生长及对氰氟草酯的降解情况菌种保藏信息细菌JW-1,分类命名为Aquamicrobium lusatiense JW-1,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，菌种保藏号为=CCTCC NO M 2012297,保藏日期为2012年7月20日。
具体实施例方式实施例I菌种分离纯化和鉴定取3g生产氰氟草酯的农药厂生化污泥于IOOmL含50mg/L氰氟草酯基础盐培养基中，震荡摇匀，30°C、180rpm摇床培养，每隔7d以5%接种量转接至新的含氰氟草酯的基础盐培养基中，按同样的培养富集方式转接5代，氰氟草酯的浓度每次转接提高10mg/L，逐渐提高到100mg/L。富集培养液经紫外检测有降解效果后，对富集液进行稀释，并分别在含100mg/L的氰氟草酯基础盐固体培养基平板上接入0. IOmL稀释富集液涂布，30°C烘箱培养.待平板上出现菌落后，挑取有透明圈的菌落划线3次进行纯化，纯化后取单菌于LB培养基中扩大培养，转接至含氰氟草酯100mg/L的基础盐液体中，30°C、180rpm摇床培养，验证纯菌的降解效果。经过富集分离纯化，从生产氰氟草酯的农药厂生化污泥中分离获得I株氰氟草酯降解菌，命名为JW-I，该菌能在含氰氟草酯100mg/L的基础盐液体培养基中降解氰氟草酯，降解率约为99. 5%。同时，菌株JW-I可在含氰氟草酯的LB平板上因将水溶性低的氰氟草酯降解为水溶性高的降解产物而形成透明圈(图I)。以菌株JW-I的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA通用引物(27f和1452r)进行PCR扩增，得到长度约为1400bp的16S rRNA基因序列。在RDP数据库(https://rdp.cme. msu. edu/)中进行 Blast,结果表明菌株 JW-I 与 Aquamicrobium lusatiense 属菌株的同源性最近，同源性大于99%。菌株JW-I在LB固体培养基上生长Id后，菌落表面光滑，有光泽，边缘整齐，隆起，呈淡黄色，经过负染，在透射电子显微镜下该菌呈杆状，单极生鞭毛，无荚膜，不形成芽孢(图2)。G_，菌体为短杆状，大小为O. 5-1. OX I. 0-1. 5 μ m。氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、柠檬酸利用反应为阳性；甲基红试验、脂酶反应、V. P.反应、M. R反应、吲哚反应为阴性；不能水解淀粉、尿素和TW80。菌株JW-I的形态和生理生化特征和Bergey’ smanual of systematic bacteriology 上对 Aquamicrobium lusatiense 的描述是一致的。结合形态、生理生化特征和16S rRNA同源性分析,将菌株JW-I鉴定为Aquamicrobiumlusatiense。本实施例中所涉及的培养基配方如下LB培养基蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 10. Og/L，去离子水加至lOOOmL。固体LB培养基加入I. 5%的琼脂粉。基础盐培养基(MM)=NH4NO3 I. Og/L, K2HPO4 I. 5g/L, KH2PO4 O. 5g/L, NaCl O. 5g/L,MgSO4O. 2g/L，去离子水加至 lOOOmL，pH=7. 0。
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固体基础盐培养基加入I. 5%的琼脂粉。富集选择培养基在IOOmL基础培养基中加入一定量的氰氟草酯原药作为唯一碳源进行选择培养。富集基质采用江苏扬州某生产氰氟草酯的农药厂生化污泥。氰氟草酯原药购自江苏扬州某农药厂(纯度为99%)，按所需浓度添加到培养基中。甲醇(色谱纯)购自西格玛奥德里奇公司。其它化学试剂为分析纯，购自上海化学试剂有限公司。实施例2氰氟草酯降解菌剂的制备I.将菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)试管种接种于肉汤蛋白胨培养基摇瓶中，200rpm振荡培养至对数期；2.将上述培养好的菌种按种子罐培养基的10%接种量(v/v)接入500升种子罐，种子罐装液量为400升，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方(质量百分比)葡萄糖 I. 0%, NH4NO3 0. 8%, K2HPO4 0. 3%, MgSO4 0. 05%, FeSO4 0. 01%, NaCl 0. 5%, CaCO3 0. 3%, W-母膏 0. 5%, pH 值 7. 2-7. 5 ；3.将种子液按生产罐培养基的10wt%接种量接入5吨的生产罐培养，装液量为4吨，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气比为I :0. 5，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30°C，整个工艺流程培养时间为36小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。实施例3氰氟草酯降解菌剂对氰氟草酯残留的降解效果在基础盐培养基中加入终浓度为100mg/L的氰氟草酯，1%的接种量接入实施例2制备的菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)菌液，设接种灭活的菌株JW-1 (CCTCC NO M2012297)为对照。每隔Id定时取样检测菌株的生长情况和氰氟草酯的降解情况，结果见图
3。菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)在5d内对氰氟草酯的降解率达到99. 2%。同时，在氰氟草酯的降解过程中，培养液的菌体量也随着氰氟草酯的降解而增加，5d内菌株量从接种时 I. 5X IO6Cfumr1 增加到约 I. IXlO7Cfu mL_1 ;表明菌株 Jff-I (CCTCC NO M 2012297)在基本完全降解氰氟草酯的同时，能够利用氰氟草酯作为碳源生长。实施例4菌株JW-I对土壤中氰氟草酯残留的降解效果
Jff-I (CCTCC NO M 2012297)对土壤中除草剂氰氟草酯残留降解效果测定在IOOOg 土壤中加入氰氟草酯，使土壤中含药浓度为10mg/kg，加入实施例2制备的JW-I菌液，混匀，置于30°C培养箱中黑暗条件下恒温培养，定时取样测定氰氟草酯在土壤中的残留量，同时设置不接菌的对照。结果见表1，表I中数据表明在不接菌的对照土壤中，氰氟草酯残留浓度在第一天下降了 21. 2%，可能是由于土壤吸附的原因，而非氰氟草酯被降解，在此后的十多天里下降十分缓慢。而接种了降解菌JW-I (CCTCC NO M 2012297)的土壤，氰氟草酯残留浓度在第一天下降了 25. 1%，在此后的几天下降非常迅速，到第15天氰氟草酯残留浓度降解率达到95. 6%。表I菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)在土壤中对氰氟草酯残留解效果
权利要求
1.一种降解除草剂氰氟草酯的细菌Aquamicrobium lusatiense JW_1,保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为=CCTCC NO M 2012297，保藏日期为2012年7月20日。
2.一种含有权利要求I所述的降解除草剂氰氟草酯的细菌JW-I的降解菌剂。
3.权利要求I所述的降解除草剂氰氟草酯的细菌JW-I在降解水体和/或土壤中的除草剂氰氟草酯残留的应用。
4.权利要求2所述的含有降解除草剂氰氟草酯的细菌JW-I的菌剂在降解水体和/或土壤中的除草剂氰氟草酯残留的应用。
全文摘要
本发明属于环境污染生物修复领域，公开了一种降解除草剂氰氟草酯的细菌及其应用。一种降解除草剂氰氟草酯的细菌Aquamicrobium lusatiense JW-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NOM2012297，保藏日期为2012年7月20日。由该细菌制备的菌剂对氰氟草酯降解效率高达到95％以上，降解速度快，消除农产品中除草剂氰氟草酯残留，可用于降解土壤和水体中除草剂氰氟草酯残留，解决除草剂氰氟草酯对对土壤水体环境的危害问题。
文档编号A62D101/04GK102827799SQ20121034276
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者顾立锋, 顾子衡, 蒋子才 申请人:江苏碧诺环保科技有限公司