专利名称：利用酵母表面展示系统分析单抗的抗原表位的方法及其在疫苗开发中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用酵母表面展示系统分析单抗的抗原表位的方法及其在疫苗开发中的应用。
背景技术：
宿主的抗体反应在抵抗病原体感染的过程中起着重要作用，而体内的多克隆抗体反应是由针对不同抗原或同一抗原的不同抗原表位的单克隆抗体组成的。深入的理解这个复杂的过程能够为研究疾病的发病机制提供关键的信息，还能够为高效疫苗的研发和疾病治疗提供重要的理论基础。在抗原表位的诸多研究方法中，兴起于1990年的噬菌体展示肽库技术(kott， J. K. and G.P.Smith, Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 1990. 249 (4967) :p. 386-90.)，即用随机合成的短肽文库(一般6-12个氨基酸， 库容量达IOll-IO12)和噬菌体展示系统进行筛选的方法，以其快捷、准确、不受氨基酸位点限制的优点而逐渐成为目前应用最广、发展最快的抗原表位筛选平台之一。然而，噬菌体展示肽库技术也存在很大的局限性(1)短肽文库可以产生的绝大部分是线性表位，不能很好地模拟占抗原表位80%以上的构象型表位；(2)噬菌体的衣壳蛋白所能容纳的外源分子小、结构简单，对外源蛋白缺乏修饰，该系统中很多细胞毒性分子和真核生物蛋白难以表达和展示；C3)噬菌体个体过小，多采用亲合层析柱或亲合聚苯乙烯板进行筛选，筛选效率低；(4)每轮筛选后，噬菌体必须重新感染宿主细胞以便获得足够的病毒粒子进行下一轮筛选，重组病毒粒子间感染能力的差别会造成一定的扩增优势；( 噬菌体易被空气传播， 因而容易引起交叉污染。单克隆抗体的特点是能与抗原的专一表位结合，判断不同来源的单克隆抗体表位的异同，对了解抗体的使用价值和大规模抗体制备等均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用酵母表面展示系统分析单抗的抗原表位的方法及其在疫苗开发中的应用。本发明提供的分析目的蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤(1)构建所述目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的 DNA片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库甲；(3)将所述目的蛋白的单克隆抗体与所述酵母展示文库甲混合，分选出与所述单克隆抗体结合的酵母；(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核苷酸序列分析所述目的蛋白的抗原表位(各个质粒中插入的共有DNA片段编码的肽片段即为候选的识别表位)。所述T载体具体可为在PCTC0N2质粒的Nhe I和BamH I位点之间插入序列表的序列表3自5，末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTC0N2_T质粒。所述目的蛋白的编码基因的DNA片段具体插入所述PCTC0N2-T质粒的km I酶切位点。所述酵母为可酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。所述步骤(1)中，构建所述DNA文库的方法可包括如下步骤①将所述目的蛋白的编码基因用DNase I进行消化，回收50_100bp的DNA片段；②将步骤①回收的DNA片段进行随机片段重组；③将步骤②重组后的DNA片段加A尾；④将步骤③得到的加A尾后的DNA片段插入所述PCTC0N2-T质粒的km I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA文库。所述随机片段重组的反应体系具体可为90ng小片段DNA，4y 1 5XPhire buffer, 0. 8 μ 1 dNTPs,0. 5μ 1 Phire DNA 聚合酶(1 个单位)，加 ddH20 至 20 μ 1。所述随机片段重组的反应程序具体可为95°C 2分钟；94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C N秒钟，10个循环或15个循环；72°C 10分钟；第1个循环时，N为60秒，自第2个循环开始，每个循环比上个循环N增加k (即第2个循环时，N为65秒，第3个循环时N为70秒，以此类推)。所述反应程序中，优选10个循环或15个循环。也可用物理剪切法、随机引物扩增法和酶消化法等方法构建目标蛋白的DNA文库。所述宿主菌可为大肠杆菌，优选大肠杆菌Dffia。在进行所述步骤(1)前，可先通过PCR扩增所述目的蛋白的编码基因。所述PCR 扩增所用的酶可为高保真DNA聚合酶，优选为PyroBest DNA Polymerase0所述方法中，可利用流式细胞术进行步骤(3)中的所述分选。所述步骤O)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面可包括如下步骤①提取所述步骤(1)中得到的含有所述DNA文库的质粒，转化所述酵母，得到重组酵母甲；②收集所述重组酵母甲诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库甲；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。所述诱导培养的参数具体可为采用SGCAA培养基，20°C、250rpm摇床中培养36小时。SGCAA培养基的配方具体为半乳糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g， NaHPO4 · 12H20 13. 6g, NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0所述方法还可包括如下步骤(5)构建所述步骤(4)分析获得的所述抗原表位的编码序列的DNA突变文库；所述DNA突变文库中，所述抗原表位的编码序列的突变DNA片段插入所述PCTC0N2-T质粒；(6)将所述DNA突变文库展示在所述酵母表面，得到酵母展示文库乙；(7)将所述目的蛋白的单克隆抗体和C-myc单抗一起与所述酵母展示文库乙混合，分选出与C-myc单抗结合且与所述目的蛋白的单克隆抗体不结合的酵母；
(8)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述pCTC0N2-T质粒的DNA片段的核苷酸序列与所述抗原表位的编码序列的差异分析蛋白的抗原表位(与原基因序列进行比对，发生变化的核苷酸即为候选的破坏多肽片段与所述单克隆抗体结合的核苷酸，对应的氨基酸残基即为蛋白与单抗结合中的关键氨基酸残基)。所述步骤(5)中，构建所述DNA突变文库的方法可包括如下步骤①通过PCR扩增所述抗原表位的编码基因；所述PCR扩增所用的酶为低保真DNA 聚合酶，优选为rTaq酶；②将所述PCR扩增产物插入所述PCTC0N2-T质粒的km I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA突变文库；所述方法中，可利用流式细胞术进行步骤(7)中的所述分选；所述步骤(6)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面可包括如下步骤①提取所述步骤( 中得到的含有所述DNA突变文库的质粒，转化所述酵母，得到重组酵母乙；②收集所述重组酵母乙诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库乙；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。所述诱导培养的参数具体可为采用SGCAA培养基，20°C、250rpm摇床中培养36小时。SGCAA培养基的配方具体为半乳糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g， NaHPO4 · 12H20 13. 6g, NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0以上任一所述方法均可应用于研究抗原和抗体相互作用。以上任一所述方法在均可应用于疫苗研发。所述目的蛋白可为序列表的序列3所示的蛋白(H5W禽流感病毒的HA蛋白)。所述目的蛋白的编码基因优选序列表的序列4所示的DNA。所述目的蛋白可为序列表的序列1所示的蛋白(gpl60蛋白)。所述目的蛋白的编码基因优选序列表的序列2所示的DNA。所述单抗可为2F5单抗、4E10单抗、VRCOl单抗或AVFluIgG03单抗。所述AVFluIgG03单抗的制备方法如下①合成序列表的序列6所示的轻链可变区基因，克隆入Pac-L-Fc载体的)(ba I和 Sac I酶切位点之间，得到重组质粒甲。②合成序列表的序列7所示的重链可变区基因，克隆入所述重组质粒甲的Bio I 和Spe I酶切位点之间，得到重组质粒乙；③将所述重组质粒乙导入Sf9细胞，收集培养上清，得到AVFluIgG03单抗。单克隆抗体的酵母随机片段文库筛选路线参见图1。大量扩增的目的抗原基因片段经过随机切割与重组后通过T-A连接的方式与Aga2蛋白的C端融合，然后导入酵母并在相应的诱导条件下展示在酿酒酵母表面，通过相应的单克隆抗体进行FACS筛选，获得与单抗反应的片段，然后对共有的同单抗反应的蛋白基因片段进行随机突变文库的构建，通过对阴性酵母克隆的筛选，分析突变的基因位点，对单抗的识别表位进行精确的定位。在进行单克隆抗体的表位确定时，通过构建同该单抗对应的特定目的蛋白的重组文库并将其展示在酵母表面，然后把单克隆抗体与酵母库混合，再利用流式分选技术(FACQ筛选出与单抗反应的阳性酵母克隆。通过分析大量的阳性克隆的重复序列，就可以对单识别的抗原表位(包括线型表位和构象型表位)进行定位研究。然后对重复区序列进行随机突变，再用同样的单抗筛选突变的抗原蛋白文库，筛选出不同单抗反应的阴性酵母克隆，分析突变的位点， 可对单抗的识别位点进行精确定位。利用单抗筛选得到的细胞表面表达抗原表位的酵母细胞作为免疫原，获得同单抗具有相似特性的免疫抗体。酵母细胞还是一个有效的免疫佐剂，能够直接免疫动物诱导特定抗体的产生，使用酵母细胞作为抗原进行免疫，还能够有效地激活树突状细胞(Dendritic cell, DC)的功能，加强保护性细胞免疫应答。因此，利用单抗筛选得到的细胞表面表达抗原表位的酵母细胞作为免疫原，很可能在接受免疫的机体产生较好的体液免疫和细胞免疫效果。同传统的抗原表位分析方法相比，利用酵母表面展示技术进行单克隆抗体识别表位的确定具有独到的优点(1)酵母细胞对蛋白的修饰途径更多，可以方便地展示大分子量和复杂的蛋白，因此可用于筛选单抗的空间构象表位；(2)酵母可采用FACS逐个筛选，大大提高准确性与筛选通量；C3)酵母可独立完成自身的生长复制过程，操作简便，干扰因素少；(4)酵母本身即为免疫佐剂，可检验抗原表位能否再诱导类似活性的抗体产生。
图1为单克隆抗体的酵母随机片段文库筛选路线。图2为构建gpl60蛋白的DNA文库过程中的琼脂糖凝胶电泳图。图3为2F5单抗识别的抗原表位的序列分析。图4为4E10单抗识别的抗原表位的序列分析。图5为应用AVFluIgG03单抗的分选效果评价。图6为实施例5中各组小鼠血清的效价检测结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。酿酒酵母EBY100 :invitrogen公司，产品目录号C839-00。Biomed质粒小提试剂盒博迈德公司。大肠杆菌DH5a 天根公司。Phire DNA聚合酶(Phire hot-start DNA Polymerase) :New England Biolabs。 Hlcarrier DNA (Iifefl DNA) =Merck 产品目录号CB^2012。HA蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司，Catalog Number 11048-V08H1。2F5 单抗获自 NIH AIDS Research&Reference Reagent Program, Catalog Number :14750 4E10 单抗获自 NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Catalog Number :10091o VRCOl 单抗获自 NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Catalog Number :12033。2F5 单抗、4E10 单抗和 VRCOl 单抗均为对HIV-1 具有广谱中和活性的单抗，其中2F5和4E10的抗原识别序列为线性表位，分别为ELDKWA和NWFDIT ； VRCOl则是针对CD4bs区的广谱中和抗体，其识别的表位是一个构象性表位。pCTC0N2质粒(酵母展示载体)由MIT Dane Wittrup教授惠赠，公众可以从清华大学获得；参考文献:Chao, G. , et al. , Isolating and engineering human antibodiesusing yeast surface display. NATURE PROTOCOLS,2006. 1(2) :p. 755—768)。Pac-L-Fc 载体参考文献Yao LS, et al. Generation of human recombinant antibody Fab fragment and its IgG to adeno—associated virus type II from phage display library. Zhonghua Shi Yah He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. 2003Sep ； 17(3) :240-3.。Sf9 细胞参考文献:Sun L, et al. Generation, characterization and epitope mapping of two neutralizing and protective human recombinant antibodies against influenza A H5Nlviruses. PLoS One. 2009 ；4 (5) :e5476. Epub 2009May 7.。YPD培养基葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母提取物lg，加重蒸水至100ml。SDCAA培养基葡萄糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g，NaHPO4 · 12H20 13. 6g， NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0SDCAA平板葡萄糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g，琼脂粉15g， NaHPO4 · 12Η2013· 6g, NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0SGCAA培养基半乳糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g，NaHPO4 · 12H20 13. 6g， NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0实施例1、pCTC0N2-T质粒(重组酵母展示载体)的构建为了便于建库，需要将PCTC0N2质粒改造成T载体，步骤如下1、合成序列表的序列5所示的DNA(双链)。 5，-AGTCGCTAGC CCAGGGATAGGGTGGCCACCCTATCCCTGG GGATCCGGGT-3，(序列 5)。左边的下划线标注Nhe I识别序列，右边的下划线标注BamH I识别序列，粗体标注两个km I识别序列。2、用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切步骤1合成的DNA，回收酶切产物。3、用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切pCTC0N2质粒，回收载体骨架。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到PCTC0N2-T质粒(骨架载体为pCTC0N2质粒，在骨架载体的Nhe I和BamH I位点之间插入了序列表5自5’末端第 11至40位核苷酸所示的DNA)。pCTC0N2-T质粒在pCTC0N2质粒里引入了两个)(cm I酶切位点，用限制性内切酶km I酶切会形成T尾。实施例2、AVFluIgG03单抗的制备1、合成序列表的序列6所示的轻链可变区基因，克隆入I^c-L-Fc载体(德国 PROGEN PR3003)的Xba I和Me I酶切位点之间，得到重组质粒甲。2、合成序列表的序列7所示的重链可变区基因，克隆入重组质粒甲的)(ho I和 SpeI酶切位点之间，得到重组质粒乙。3、采用美国Pharmogen公司的BaculoGold共转染试剂盒，将重组质粒乙导入Sf9 细胞，收集培养上清，得到AVFluIgG03单抗。实施例3、应用本发明的方法分析gpl60蛋白的抗原表位一、构建gpl60蛋白的DNA文库(随机切割片段文库)构建gpl60蛋白的DNA文库，首先将gpl60蛋白的编码基因通过DNase I进行随机切割，获得约50-100bp的小片段，然后通过随机重组得到具有特定长度分布的随机片段 DNA 文库(Lin, Ζ. , S. Li and Y. Chen, Identification of Viral Peptide Fragments forVaccine Development. Viral Applications of Green Fluorescent Protein :Methods and Protocols，2009 :p.261-274. ；Chen，Y.，et al.，Random dissection to select for protein split sites and its application in protein fragment complementation. PROTEIN SCIENCE, 2009. 18(2) :p. 399-409.)。上述方法非常类似于 DNA shuffling 的程序(Lorimer，I.and I. Pastan，Random recombination of antibody single-chain fv sequences after fragmentation with dnasei in the presence of Mn2+. Nucleic Acids Res, 1995. 23(15) :p. 3067-3608.)，巧妙地利用片段重组过程来调节随机片段DNA文库的分布，可根据筛选需要构建更为合理的文库，为获得关键的构象型抗原表位提供基础。1、大量扩增目的基因①进行目的基因PCR扩增合成序列表的序列2所示的gpl60蛋白的编码基因(序列2所示蛋白编码序列表的序列1所示的gpl60蛋白，即HIV-1B’亚型毒株的膜蛋白)作为模板，用gpl60-F和 gpl60-R组成的引物对进行PCR扩增(所用的DNA聚合酶为Takara公司生产的PyroBest DNA Polymerase, 一种高保真聚合酶)，得到PCR扩增产物(模板DNA)。gpl60-F:5，-ATGAGAGTGACGGGG-3，；gpl60-R :5，-TAGCAAAGCCCTTTC-3，。②采用QIAquick PCR Purification Kit纯化回收PCR扩增产物，进行DNA定量 (DNA的浓度应大于130ng/y 1)。2、DNase I 随机消化①准备DNase I 底物溶液；4 μ g 模板 DNA、2. 5 μ 1 IM Tris-Cl (ρΗ7· 5)，10 μ 1 50mMMnCl2,加 ddH20 至 49 μ 1。②加入Ιμ DNase I (0. 075U)(购自 Worthington 公司，产品目录号 LS006361)， 15°C 反应 4min。③加入10 μ 1 0. 5Μ EDTA水溶液终止反应。④90°C放置10分钟，进一步使DNase I失活。3、纯化DNase I酶切片段产物①使用I^all超滤浓缩离心管(截留分子量为30K)过滤去除步骤2的反应体系中的模板DNA。②将步骤①收集的滤液通过Mil超滤浓缩离心管(截留分子量为3K)，回收分子量为I以下的小片段DNA。采用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo)确定DNA浓度。步骤②得到的小片段DNA的琼脂糖凝胶电泳图见见图2A的泳道1，大小为 50-100bp。4、小片段DNA的重组将步骤3得到的小片段DNA进行随机片段重组，得到随机片段。重组反应体系90ng小片段 DNA，4y 1 5 X Phire buffer, 0. 8 μ 1 dNTPs，0. 5μ1 Phire DNA聚合酶(1个单位)，加ddH20至20 μ 1。重组反应程序95°C 2分钟；94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C N秒钟，15个循环； 720C 10分钟；4°C保存。第1个循环时，N为60秒，自第2个循环开始，每个循环比上个循环N增加k ；即第2个循环时，N为65秒，第3个循环时N为70秒，以此类推)。
得到的随机片段用QIAquick PCR Purification Kit纯化并定量其浓度。随机片段的琼脂糖凝胶电泳图见图2B的泳道1，大小为IOO-SOObp。5、随机片段加A尾将步骤4得到的随机片段采用Α-tailing DNA Kit(Takara)按试剂盒的说明书加 A尾，具体步骤如下在微量离心管中配制如下加“A”反应液(50ul) :10XA_Tailing Buffer 5μ 1, dNTP Mixture 4 μ 1，A-Tailing Enzyme 0· 5 μ 1，随机片段 2 μ g，加 ddH20 至 50 μ 1 ;72°C 反应20分钟，然后冰浴4分钟；然后用QIAquick PCR Purification Kit纯化，并用 Nanodrop2000分光光度计定量DNA片段浓度。6、载体骨架的制备用限制性内切酶)(cm I酶切pCTC0N2-T质粒，得到载体骨架。酶切体系pCTC0N2-T质粒 24μ g，10XNEB buffer2 10 μ 1，10XBSA Ιμ ，限制性内切酶)(cm I 2μ 1，加 ddH20 至 100μ 1。反应条件37°C水浴4小时(3-6小时均可)。采用QIA quick Gel Extraction Kit回收酶切产物。将回收的酶切产物用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，并用Nanodrop2000分光光度计定量DNA片段浓度。7、随机片段库与载体的结合将步骤5力Π“Α”后的随机片段和步骤6的载体骨架恒温金属浴16°C连接过夜(12 小时以上均可)。连接体系10XT4 ligase buffer 20 μ 1，加“Α”后的随机片段1 μ g，骨架载体 4yg，T4 ligase (New England Biolabs) 10 μ 1，力口 ddH20 至 200 μ 1。8、电转①用QIAquick PCR Purification Kit纯化步骤7的连接混合物。②将纯化后的片段电转到大肠杆菌Dffia细胞中。③涂LB平板(含50mg/ml氨苄青霉素)，37°C温箱中过夜培养，次日查看转化结果，统计板上的菌落数(库容量)。库容量为500，000左右。随机挑取10个单菌落，采用 PCTC0N2质粒上下游的测序引物通过PCR进行插入片段大小的鉴定(图2C。1至12为不同单克隆的PCR扩增产物)。④采用刮板器刮干净LB平板上的菌落，放入60ml LB培养基(含100mg/ml氨苄青霉素)，即为gpl60蛋白的DNA文库。二、酵母转化、培养和诱导1、酵母转化平行进行10组酵母转化，每组均采用如下方法(1)从YPD平板上挑取一个新鲜的酿酒酵母EBY100单克隆至5ml YPD液体培养基，30°C 250rpm过夜培养；(2)将过夜培养物稀释至0D600值为0. 4-0. 5，在30°C摇床中继续培养至0D600值达到2(约4小时)；(3)室温1500g离心5分钟，弃上清，收集酵母细胞；用25ml无菌水重悬酵母细胞， 室温1500g离心5分钟，弃上清，收集酵母细胞；(4)用Iml 0. IM醋酸锂溶液重悬酵母细胞，30°C水浴10分钟，然后13000g离心k，弃上清，收集酵母细胞；(5)用0. 5ml 0. IM醋酸锂溶液重悬酵母细胞，50ul每管分装(感受态细胞)；(6)将单链carrier DNA放入沸水中水浴5分钟，然后立即取出冰浴；(7)采用Biomed质粒小提试剂盒(博迈德)提取步骤一得到的DNA文库的质粒， 将ι μ g质粒稀释至50ui ；(8)取一管步骤( 得到的感受态细胞，13000g离心k，弃上清；依次加入240 μ 1 50% PEG溶液、36 μ 1 IM醋酸锂溶液、25 μ 1单链carrier DNA、50ul步骤(7)的质粒，充分混勻；30°C水浴30分钟，然后42°C水浴15分钟；13000g离心k，弃上清，收集酵母细胞；(9)用Iml无菌水重悬酵母细胞，取出IOOul涂SDCAA平板，在30°C恒温箱中放置约48小时，能看到明显的菌落，统计菌落数，计算酵母转化效率。每一组的转化效率(菌落数)为50，000-100, 000,10组的库容量就是500，000-1000, 000,能够涵盖通过理论计算的绝大多数克隆。2、诱导(1)每组剩余的900ul菌液用IOml SDCAA重悬后混合在一起，30°C，250rpm摇床中培养至0D600约为3 (24小时)。( 取500微升菌液，室温8000rpm离心1分钟，弃上清，用Iml SGCAA培养基重悬细胞，然后稀释至0D600在0. 5-1之间；(3) 200C 250rpm摇床中诱导36小时，得到的菌液即为酵母展示文库。三、分析gpl60蛋白针对2F5单抗的抗原表位1、酵母展示文库的FACS分选将步骤二得到的酵母展示文库进行FACS分选，步骤如下①将酵母展示文库(IO7-IO8个细胞)装入1. 5ml Ep管中，8000rpm(或> 8000rpm 也可)离心1分钟，弃上清；②加入1ml PBS，轻弹管壁将酵母重悬，8000rpm离心1分钟，取沉淀；重复此操作一次；③加入用50ul蛋白浓度为10ug/ml的2F5单抗，轻弹混勻，冰浴1小时，期间每隔 15-20分钟轻弹管壁；④加入Iml PBS，混勻，8000rpm 4°C离心1分钟，取沉淀；重复此操作一次；⑤加入用50ul PBS 100倍稀释的荧光标记的二抗(PE标记羊抗鼠IgG，购自Santa Cruz公司，货号sc-3738)，轻弹混勻，冰浴45分钟，期间每隔15-20分钟轻弹管壁(注意避光)；⑥加入Iml PBS，混勻，8000rpm 4°C离心1分钟，取沉淀(酵母)；重复此操作一次；⑦用PBS重悬酵母(3_細1 PBS)转移到流式细胞仪进行FACS分选，收集与单抗结合的酵母细胞。2、FACS分选效果评价将步骤1分选得到的酵母细胞(10万-50万)转移到试管中，加入SDCAA培养基至总体积为anl，将试管置于30°c摇床中，让酵母复苏2-3小时。取出200ul (大约5000-10000 个酵母细胞)复苏的菌液涂SDCAA平板，将平板倒置在30°C恒温箱中，48小时后收菌，得到阳性单克隆。从平板上挑取阳性单克隆单菌落到5-6ml SDCAA培养基中，在30°C、250rpm摇床中生长二4小时后0D600大约为6-8 ；取部分菌液离心弃上清，用SGCAA培养基重悬细胞使其0D600在0. 5-1之间，20°C、250rpm摇床中诱导36小时后进行FACS分析。FACS分析方法同步骤三的1中FACS分选的方法，差别仅在于步骤①中取IO6-IO7个细胞，步骤⑦中用 0.5-lml PBS重悬酵母。24个单克隆FACS分析为阳性。3、测序及序列分析①对于步骤三的3中FACS分析为阳性的单克隆，扩大培养后，用甘油冻存菌种 (甘油终浓度15% )，剩余全部菌液用质粒小提试剂盒提取质粒；②由于从酵母中提取的质粒拷贝数很低，将提取的质粒转化到大肠杆菌Dffia，然后进行测序(检测插入PCTC0N2-T质粒中的片段的核苷酸序列)。③序列分析采用kquencher软件将插入到pCTC0N2载体中的随机片段与gpl60蛋白编码基因的全长序列进行比对，结果见图3。Sequencher软件按照软件的操作手册进行分析。经过序列比对发现，2F5单抗对各个单克隆的共有识别序列为LELDKWA，同已知的识别序列均一致，表明本发明提供的方法对于抗原表位的定位非常精确。四、分析gpl60蛋白针对4E10单抗的抗原表位用4E10单抗代替2F5单抗，其它同步骤三。25个单克隆FACS分析为阳性。FACS分析为阳性的单克隆的序列分析结果见图 4。经过序列比对发现，4E10单抗对各个单克隆的共有识别序列为WASLWNWFDIT，同已知的识别序列均一致，表明本发明提供的方法对于抗原表位的定位非常精确。五、分析gpl60蛋白针对VRCOl单抗的抗原表位用VRCOl单抗代替2F5单抗，其它同步骤三。32个单克隆FACS分析为阳性。VRCOl单抗对各个单克隆的共有识别序列为序列表的序列1自N末端第257至471位氨基酸残基，是一个构象性表位，包括了膜蛋白的V3、 V4和V5区段，而HIV的⑶4bs区即包括在内。实施例4、精确确定H5m_HA蛋白针对AVFluIgG03单抗的抗原识别表位一、构建H5m_HA蛋白的DNA文库(随机切割片段文库)1、大量扩增目的基因①进行目的基因PCR扩增合成序列表的序列4所示的H5m_HA蛋白的编码基因(序列表的序列4所示DNA 编码序列表的序列3所示的H5m-HA蛋白)，作为模板，用HA-F和HA-R组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物(模板DNA)。HA-F 5' -GATCAGATTTGCATTGGTTA-3，；HA-R 5’ -TATTTGGTAAGTTCCTATTG-3’。②采用QIAquick PCR Purification Kit纯化回收PCR扩增产物，进行DNA定量 (DNA的浓度应大于130ng/y 1)。步骤2至8同实施例3的步骤一的2至8。二、酵母转化、培养和诱导
同实施例3的步骤二。三、初步确定H5m_HA蛋白针对AVFluIgG03单抗的抗原表位将步骤二得到的酵母展示文库进行FACS分选用AVFluIgG03单抗代替2F5单抗， 其它同实施例3的步骤三。应用AVFluIgG03单抗筛选，7个单克隆FACS分析为阳性。经过序列比对发现， AVFluIgG03单抗对H5m-HA蛋白的识别序列为序列表的序列3自N末端第51至260位氨基酸残基(对应序列表的序列4自5’末端第241至774位核苷酸)。这个单抗的识别序列位于H5W的HAl区段，该表位为一构象性抗原表位。四、精确确定H5m_HA蛋白针对AVFluIgG03单抗的抗原识别表位(一)构建H5m_HA蛋白的突变DNA文库1、大量扩增针对步骤三发现的抗原表位的突变DNA片段①合成序列表的序列4所示的H5m_HA蛋白的编码基因，作为模板，用HA-F和 HA-R组成的引物对进行PCR扩增(所用的DNA聚合酶为Takara公司的rTaq酶，该酶的保真性较低，容易产生突变)，得到PCR扩增产物(突变DNA片段)。Fl 5' -GAGCGCTAGCATTTTAAGAGATTGTA-3’ (下划线标注 NheI 识别序列)；Rl :5，-TAGTGGATCCCCCTTTCTTGACAATTTT-3‘(下划线标注 BamHI 识别序列)。②采用QIAquick PCR Purification Kit纯化回收PCR扩增产物，进行DNA定量 (DNA的浓度应大于130ng/y 1)。2、用限制性内切酶NheI和BamHI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。3、载体骨架的制备用限制性内切酶NheI和BamHI双酶切pCTC0N2_T质粒，得到载体骨架。酶切体系pCTC0N2-T质粒 24 μ g, IOXNEB buffer2 60 μ 1，100XBSA 6 μ 1，限制性内切酶 NheI 和 BamHI 各 12 μ 1，加 ddH20 至 600 μ 1。反应条件37°C水浴4小时(3-6小时均可)。采用QIA quick Gel Extraction Kit回收酶切产物。将回收的酶切产物用 QIAquickPCR Purification Kit纯化，并用Nanodrop2000分光光度计定量DNA片段浓度。4、随机突变库与载体的结合将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架恒温金属浴16°C连接过夜(12小时以上均可)。连接体系=IOXiM ligase buffer 20 μ 1，酶切产物1 μ g，骨架载体4 μ g，T4 ligase (New England Biolabs) 10 μ 1，力口 ddH20 至 200μ1。5、电转①用QIAquick PCR Purification Kit纯化步骤4的连接混合物。②将纯化后的片段电转到大肠杆菌Dffia细胞中。③涂LB平板(含50mg/ml氨苄青霉素)，37°C温箱中过夜培养，次日查看转化结果，统计板上的菌落数(库容量)。库容量为500，000左右。④采用刮板器刮干净LB平板上的菌落，放入60ml LB培养基(含100mg/ml氨苄青霉素)，即为随机突变库。( 二)酵母转化、培养和诱导同实施例3的步骤二。
(三)精确分析单抗AVFluIgG03的抗原表位1、FACS 分选将步骤二得到的酵母展示文库进行第一次FACS分选用C-myc单抗和 AVFluIgG03单抗代替2F5单抗，同时加入两种二抗(PE标记羊抗鼠IgG和FITC标记羊抗鸡 IgG)，其它同实施例3的步骤三的1 ；收集与C-myc单抗结合且与AVFluIgG03单抗不结合的酵母细胞进行第二次FACS分选用C-myc单抗和AVFluIgG03单抗代替2F5单抗，同时加入两种二抗(PE标记羊抗鼠IgG和FITC标记羊抗鸡IgG)，其它同实施例3的步骤三的1 ；收集与C-myc单抗结合且与AVFluIgG03单抗不结合的酵母细胞进行第三次FACS分选用C-myc 单抗和AVFluIgG03单抗代替2F5单抗，同时加入两种二抗(PE标记羊抗鼠IgG和FITC标记羊抗鸡IgG)，其它同实施例3的步骤三的1 ；收集与C-myc单抗结合且与AVFluIgG03单抗不结合的酵母细胞。2、FACS分选效果评价用C-myc单抗和AVFluIgG03单抗代替2F5单抗，同时加入两种二抗(PE标记羊抗鼠IgG和FITC标记羊抗鸡IgG)，其它同实施例3的步骤三的2。分选前的酵母展示文库(A)、第一次分选后收集的酵母细胞(B)、第二次分选后收集的酵母细胞(C)和第三次分选后收集的酵母细胞(D)的FACS图谱见图5。第三次分选后，共得到41个与C-myc单抗结合且与AVFluIgG03单抗不结合的单克隆。3、测序及序列分析同实施例3的步骤三的3。41个单克隆中，27个为单点突变的克隆。与序列表的序列4所示的H5m_HA蛋白的编码基因比对，27个单点突变的克隆中的单点突变(重复克隆不计)见表1(发生位置的数字均表示序列表的序列4自5’末端的位数，数字前面为突变前得核苷酸，数字后面为突变后的核苷酸)。表1测序结果
权利要求
1.分析目的蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤(1)构建所述目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的DNA 片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库甲；(3)将所述目的蛋白的单克隆抗体与所述酵母展示文库甲混合，分选出与所述单克隆抗体结合的酵母；(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核苷酸序列分析所述目的蛋白的抗原表位。
2.如权利要求2所述的方法，其特征在于在进行所述步骤(1)前，先通过PCR扩增所述目的蛋白的编码基因；所述PCR扩增所用的酶为高保真DNA聚合酶；优选为PyroBest DNA Polymerase。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述T载体为在pCTC0N2质粒的NheI 和BamH I位点之间插入序列表的序列表5自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTC0N2-T质粒；所述目的蛋白的编码基因的DNA片段插入所述pCTC0N2_T质粒的Xcm I酶切位点；所述酵母为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBYlOO。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中，构建所述DNA文库的方法包括如下步骤①将所述目的蛋白的编码基因用DNaseI进行消化，回收50_100bp的DNA片段；②将步骤①回收的DNA片段进行随机片段重组；③将步骤②重组后的DNA片段加A尾；④将步骤③得到的加A尾后的DNA片段插入所述PCTC0N2-T质粒的kmI酶切位点， 然后转化宿主菌，得到所述DNA文库。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，利用流式细胞术进行步骤(3)中的所述分选。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于步骤⑵中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面包括如下步骤①提取所述步骤(1)中得到的含有所述DNA文库的质粒，转化所述酵母，得到重组酵母甲；②收集所述重组酵母甲诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库甲；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。
7.如权利要求3至6中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤(5)构建所述步骤(4)分析获得的所述抗原表位的编码序列的DNA突变文库；所述DNA 突变文库中，所述抗原表位的编码序列的突变DNA片段插入所述PCTC0N2-T质粒；(6)将所述DNA突变文库展示在所述酵母表面，得到酵母展示文库乙；(7)将所述目的蛋白的单克隆抗体和C-myc单抗一起与所述酵母展示文库乙混合，分选出与C-myc单抗结合且与所述目的蛋白的单克隆抗体不结合的酵母；(8)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述PCTC0N2-T质粒的DNA片段的核苷酸序列与所述抗原表位的编码序列的差异分析蛋白的抗原表位。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤( 中，构建所述DNA突变文库的方法包括如下步骤①通过PCR扩增所述抗原表位的编码基因；所述PCR扩增所用的酶为低保真DNA聚合酶；优选为rTaq酶；②将所述 PCR扩增产物插入所述pCTC0N2-T质粒的km I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA 突变文库；所述方法中，利用流式细胞术进行步骤(7)中的所述分选；所述步骤(6)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面包括如下步骤①提取所述步骤 (5)中得到的含有所述DNA突变文库的质粒，转化所述酵母，得到重组酵母乙；②收集所述重组酵母乙诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库乙；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。
9.权利要求1至8中任一所述方法在研究抗原和抗体相互作用中的应用。
10.权利要求1至8中任一所述方法在疫苗研发中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用酵母表面展示系统分析单抗表位的方法及其在疫苗开发中的应用。本发明提供的方法，包括如下步骤(1)构建目的蛋白的DNA文库；(2)将DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；(3)将目的蛋白的单抗与酵母展示文库甲混合，分选出与单抗结合的酵母；(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，分析所述目的蛋白的抗原表位。同传统方法相比，本发明的优点(1)酵母细胞对蛋白的修饰途径更多，可以展示大分子量和复杂蛋白；(2)酵母可采用FACS逐个筛选，提高准确性与筛选通量；(3)酵母可独立完成自身的生长复制过程，操作简便，干扰因素少；(4)酵母本身即为免疫佐剂，可检验抗原表位能否再诱导类似活性的抗体产生。
文档编号C40B50/06GK102321146SQ20111020680
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者史宣玲, 姚辰, 左腾, 张林琦, 汪桦 申请人:清华大学